專利名稱：用畢赤酵母pGAP調控表達漆酶的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種應用畢赤酵母的PGAP啟動子調控生產生物蛋白的方法，具體是一種應用畢赤酵母的PGAP調控表達漆酶的方法。
背景技術：
漆酶(laccase，EC 1. 10. 3. 2)廣泛地存在于自然界中，因最初發現于漆樹的樹脂而得名。從植物和一些微生物中能分離到漆酶。漆酶有多種工業用途。漆酶能除去酚類物質而應用于污水處理和作為食品添加劑等；漆酶具有分解木質素的作用而應于紙漿、造紙工業和纖維素乙醇工業。雖然從植物中能分離到漆酶，但是工藝煩瑣，成本高；多種微生物具有產生漆酶的功能，但是，由于或是天然的產漆酶菌株的生長緩慢，營養要求較高，或是產物在胞內形成包涵體(細菌菌株)不利于目標蛋白的純化，生產成本較高。畢赤酵母 (Pichiapastoris)是最近迅速發展的一種真核表達宿主，營養要求不高，適合于高密度發酵的大規模生產方式，由于Pichia pastoris分泌自身的蛋白很少，有利于表達產物的純化。pGAP (三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子)是Pichia pastoris的組成型強啟動子，與Pichia pastoris的pAOXl (醇氧化酶1啟動子)相比其優越性主要是不需要有毒性的甲醇作為碳源。
發明內容
本發明的目的是為解決應用天然植物或天然的產漆酶的菌株生產漆酶的成本較高、產物難于純化的問題，而提供一種應用畢赤酵母的PGAP (三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子) 調控表漆酶的方法。本發明所采用的技術方案是一種用畢赤酵母pGAP調控表達漆酶的方法，其步驟是1、首先從畢赤酵母中擴增pGAP啟動子；2、在漆酶基因序列的3’末端融合His6標簽，構建由pGAP調控漆酶基因的由G418 抗性基因作為篩選標記的畢赤酵母表達載體，將這一載體轉化畢赤酵母基因組，并將轉化物涂布于含G418彡300 μ g/mL的G418-YPD平板上；即涂布于含G418為彡300 μ g/mL的 YPD (2%蛋白胨，yeast extract，2%葡萄糖)平板上；3、從步驟2的G418-YPD平板上再挑選畢赤酵母重組子作為工程菌株(畢赤酵母的基因組中沒有G418抗性基因，在含G418抗性的平板上不能生長；由于重組子含有G418 抗性基因，所以在含G418抗性的平板上能生長。也就是說在G418抗性平板上能生長的就是重組子)；4、將步驟3獲得的工程菌株接種于含碳源的液體培養基中，于觀 30°C在生物反應器中發酵工程菌1 2d分泌表達漆酶。所述液體培養基是由以下組分組成85%磷酸 25 28ml/L、CaSO4 · 2Η200· 8 1. 2g/L、K2SO4 17 19g/L、MgSO4 · 7H20 13 16g/ L、K0H3. 5 4. 5g/L、碳源 15 45g/L、蛋白胨 18 22g/L、Yeast extract 8 12g/L、PTM43 5ml/L ；所述 PTM4 是由以下組分組成CuS04 · 5H20 2. Og/L、NaI · 2H20 0. lg/L、 MnSO4 · H2O 3. Og/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 2g/L、H3BO3 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 1. 05g/L、ZnCl2 7. Og/L, Fe2 (SO4) 3 · 7H20 22g/L、生物素 0. 2g/L、硫酸 lml/L。所述碳源是甘油、油酸、山梨醇、葡萄糖、乳酸、甘氨酸、丙氨酸、海藻糖或甘露醇。本發明采用了畢赤酵母的pGAP調控表達的漆酶，具有下列優點1、生產成本低，只需使用普通的無機鹽、碳源和氮源作為發酵培養基。2、可在生物反應器中發酵畢赤酵母，其細胞能生長至細胞密度達200A以上，能以足夠多的細胞數量表達漆酶，有利于漆酶的大規模生產。3、發酵周期短，整個發酵周期只需1 2d。4、使用無毒性的碳源，不需要使用有毒性的甲醇作為碳源。5、由于pGAP是畢赤酵母的強啟動子，由pGAP調控表達的L漆酶約占總分泌蛋白的比例較高，并且由于在漆酶的C端融合了 His6標簽，有利于產物的純化。
具體實施例方式下面才用非限定性實施例對本發明作進一步說明。實施例一1、首先從Pichia pastoris中擴增pGAP啟動子；2、在漆酶基因序列的3’末端融合His6標簽，構建由pGAP調控漆酶基因的由G418 抗性基因作為篩選標記的畢赤酵母表達載體，將這一載體轉化畢赤酵母基因組，并將轉化物涂布于含G418彡300 μ g/mL的G418-YPD平板上。3、從步驟2的G418-YPD平板上再挑選畢赤酵母重組子作為工程菌株；
4、將工程菌株菌液接種于液體培養基中液體培養基的配方(每升)85%磷酸 26. 7ml, CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g，甘油 40g，蛋白胨 20g, Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml] (PTM4 配方(每升)=CuSO4 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反應器中進行發酵表達漆酶。其發酵參數為溫度^ 30°C，pH5.0，攪拌轉速200-900r/min。發酵1 2d后離心收獲上清，用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒進行純化漆酶，通過蛋白電泳(在 SDS-PAGE上呈現純化的目標蛋白的分子量符合漆酶的分子量)和酶活性(純化的目標蛋白能夠催化愈創木酚生成醌類物質)對表達的漆酶進行鑒定。分泌于發酵液中的漆酶占 Pichia pastoris總的分泌蛋白的7%以上。實施例二步驟1、2、3同實施例一。4、將工程菌株菌液接種于液體培養基中液體培養基的配方(每升):85%磷酸 26. 7ml, CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g，油酸 20g，蛋白胨 20g, Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml] (PTM4 配方(每升)=CuSO4 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反應器中進行發酵表達漆酶。其發酵參數為溫度^ 30°C，pH5.0，攪拌轉速200-900r/min。發酵1 2d后
4離心收獲上清用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒進行純化漆酶，通過蛋白電泳(在 SDS-PAGE上呈現純化的目標蛋白的分子量符合漆酶的分子量)和酶活性(純化的目標蛋白能夠催化愈創木酚生成醌類物質)對表達的漆酶進行鑒定。分泌于發酵液中的漆酶占 Pichia pastoris總的分泌蛋白的8%以上。實施例三步驟1、2、3同實施例一。4、將工程菌株菌液接種于液體培養基中液體培養基的配方(每升):85%磷酸 26. 7ml, CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g,山梨醇 35g，蛋白胨 20g，Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml(PTM4 配方(每升):CuS04 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反應器中進行發酵表達漆酶。其發酵參數為溫度^ 30°C，pH5.0，攪拌轉速200-900r/min。發酵1 2d后離心收獲上清用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒進行純化漆酶，通過蛋白電泳(在 SDS-PAGE上呈現純化的目標蛋白的分子量符合漆酶的分子量)和酶活性(純化的目標蛋白能夠催化愈創木酚生成醌類物質)對表達的漆酶進行鑒定。分泌于發酵液中的漆酶占 Pichia pastoris總的分泌蛋白的5%以上。實施例四步驟1、2、3同實施例一。4、將工程菌株菌液接種于液體培養基中液體培養基的配方(每升)85%磷酸 26. 7ml，CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g,葡萄糖 40g,蛋白胨 20g，Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml(PTM4 配方(每升):CuS04 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, C0Cl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反應器中進行發酵表達漆酶。其發酵參數為溫度^ 30°C，pH5.0，攪拌轉速200-900r/min。發酵1 2d后離心收獲上清用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒進行純化漆酶，通過蛋白電泳(在 SDS-PAGE上呈現純化的目標蛋白的分子量符合漆酶的分子量)和酶活性(純化的目標蛋白能夠催化愈創木酚生成醌類物質)對表達的漆酶進行鑒定。分泌于發酵液中的漆酶占 Pichia pastoris總的分泌蛋白的6%以上。實施例五步驟1、2、3同實施例一。4、將工程菌株菌液接種于液體培養基中液體培養基的配方(每升):85%磷酸 26. 7ml, CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g，乳酸 30g，蛋白胨 20g, Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml] (PTM4 配方(每升)=CuSO4 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反應器中進行發酵表達漆酶。其發酵參數為溫度^ 30°C，pH5.0，攪拌轉速200-900r/min。發酵1 2d后離心收獲上清用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒進行純化漆酶，通過蛋白電泳(在 SDS-PAGE上呈現純化的目標蛋白的分子量符合漆酶的分子量)和酶活性(純化的目標蛋白能夠催化愈創木酚生成醌類物質)對表達的漆酶進行鑒定。分泌于發酵液中的漆酶占Pichia pastoris總的分泌蛋白的5%以上。
權利要求
1.一種用畢赤酵母PGAP調控表達漆酶的方法，其特征在于，其步驟是1)、首先從畢赤酵母中擴增PGAP啟動子；2)、在漆酶基因序列的3’末端融合His6標簽，構建由pGAP調控漆酶基因的由G418抗性基因作為篩選標記的畢赤酵母表達載體，將這一載體轉化畢赤酵母基因組，并將轉化物涂布于含G418彡300 μ g/mL的G418-YPD平板上；3)從步驟幻的G418-YPD平板上再挑選畢赤酵母重組子作為工程菌株；4)、將步驟幻獲得的工程菌株接種于含碳源的液體培養基中，于觀 301在生物反應器中發酵工程菌1 2d分泌表達漆酶；所述液體培養基是由以下組分組成85%磷酸25 28ml/L、CaSO4 · 2Η200· 8 1. 2g/L、K2SO4 17 19g/L、MgSO4 · 7H20 13 16g/L、K0H3. 5 4. 5g/L、碳源 15 45g/L、蛋白胨 18 22g/L、Yeast extract 8 12g/L、PTM4 3 5ml/ L ；所述 PTM4 是由以下組分組成=CuSO4 ‘ 5H20 2. 0g/L、NaI · 2H20 0. 1 g/L,MnSO4 · H2O 3. Og/ L^Na2MoO4 ·2Η20 0. 2g/L、H3BO3O. 02g/L、CoCl2 · 6H20 1. 05g/L、ZnCl27. Og/L, Fe2 (SO4) 3 · 7H20 22g/L、生物素 0. 2g/L、硫酸 lml/L。
2.根據權利要求1所述的用畢赤酵母pGAP調控表達漆酶的方法，其特征在于所述碳源是甘油、油酸、山梨醇、葡萄糖、乳酸、甘氨酸、丙氨酸、海藻糖或甘露醇。
全文摘要
本發明公開了一種用畢赤酵母pGAP調控表達漆酶的方法，屬生物技術領域，首先從畢赤酵母中擴增pGAP啟動子；構建由pGAP調控漆酶基因的畢赤酵母表達載體，并將這一載體轉化畢赤酵母基因組；根據載體上所帶的抗性基因篩選高拷貝重組子作為工程菌株；將工程菌株接種于含碳源的液體培養基中發酵工程菌分泌表達漆酶。本發明生產成本低，發酵周期短，利用畢赤酵母的pGAP調控表達的漆酶有利于產物的純化，解決應用天然植物或天然的產漆酶的菌株生產漆酶的成本較高、產物難于純化的問題，有利于漆酶的大規模生產。
文檔編號C12N9/02GK102242084SQ20101018487
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月13日 優先權日2010年5月13日
發明者張添元, 張愛聯, 楊穗珊, 羅進賢 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所