專利名稱：一種植物胚乳特異性表達啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物胚乳特異性表達啟動子及其應用。
背景技術：
植物生物技術的最新發展不僅實現了傳統農藝形狀的改良(如提高作物產量， 增強抗病、抗蟲、抗除草劑特性，改良品質等)，而且使植物成為生物醫藥和工業產品的生物反應器(Daniell et al. , Trends Plant Sci. 2001,6 :219-226 ；Giddings et al.， NatureBiotech. 2000，18 :1151-1156 ；Hood and Jilka, Curr. Opin. Biotechnol. 1999，10 382-386 ；Hood and ffoodard, Plants as Factories for Protein Production 2002, pp. 119-135. Netherlands =Kluwer Academic)。對于絕大多數禾本科作物，由于其產量高、 生產成本低、耐儲藏且生產規模容易控制等特點，決定了其為第二代轉基因產物的理想載體。近年來利用水稻種子生產具有保健作用的外源蛋白和可食性疫苗研究發展很快，且已經取得了巨大成功。如維生素A、具有降低血糖作用的大豆球蛋白(Glycinin)、具有預防和治療缺鐵性貧血和提高自身免疫功能的大豆鐵蛋白Ferritin)、具有刺激胰島素分泌預防糖尿病發生功能的GLP、乙肝疫苗和花粉過敏癥疫苗等均成功地在水稻中表達并高水平累積(Goto et al.，Nature Biotech. 1999,17 :282-286 ；Katsube et al.，Plant Physiol. 1999,120 :1063-1073 ；Qu et al.，Planta 2005,222 :225-233 ；Takagi et al.， Proc Natl. Acad. Sci. 2005,102 :17525-17530 ；Ye et al.，Science 2000，287 :303-305 ； Zheng et al.，PlantPhysiol. 1995，109 :777-786)。然而缺少相應的啟動子成為目前生物技術應用(外源基因的理想表達部位，表達方式，表達時期和表達水平等)的限制因子。植物基因工程的根本目標是培育能使目的基因穩定而且高效表達的轉基因植株。 基因表達受控于轉錄起始處的核苷酸序列即啟動子成分，它主要包括RNA聚合酶啟動轉錄的信號，以指導合成相應的信使RNA分子，進一步指導蛋白質的合成。啟動子控制基因轉錄水平，同時還決定了基因的表達時間和表達方式。目前廣泛應用的啟動子(包括CaMV35S、ubiquitinl、ACtinl)盡管其表達效率高， 然而由于其表達不受時空限制，它在幾乎所有組織中都能使外源基因表達，在進行種子中外源基因過量表達過程中，會驅動基因在種子外的其它組織中表達，既消耗生物能源，同時會導致一些可能對生物生長發育產生不利影響的代謝產物的合成。且上述啟動子的表達強度尚無法滿足轉基因產業化的需要。若選擇胚乳特異性高強度表達啟動子，有助于定時定向調控外源有用蛋白的合成，既節約能源，保證了植物正常生理活動不受干擾，同時又能提高外源有用蛋白在種子中的儲藏水平。水稻種子儲藏蛋白以谷蛋白和醇溶性蛋白為主，分別占種子全蛋白的80%和 10%。水稻谷蛋白基因只在胚乳中表達，而在其它組織中幾乎檢測不到谷蛋白。水稻谷蛋白由至少13個基因控制，這些基因根據其DNA序列的同源性分為GluA、GluB、GluC和GluD 四個基因亞族(Subfamily)。雖然水稻谷蛋白基因在其堿基序列上具有較高的相似性(亞族內80-96%，亞族間60-80% )，但其啟動子區域卻幾乎沒有相似性，預示著其基因表達的調控機制各不相同。來自于水稻胚乳儲藏蛋白基因的啟動子對于外源基因的表達具有潛在的應用價值。Qu 和 Takaiwa(Plant Biotechnol. J. 2004,2 :113-125)利用 GUS 作報告基因，研究 7 3 個水稻谷蛋白(GluB-1, GluB-2, GluB-4)，3 個醇溶蛋白(10kD, 13kD, 16kD)和 1 個球蛋白Q6kD)基因啟動子的表達方式、組織表達特異性和表達強度，獲得了 4個表達活性比 Ubiquitin高數倍的胚乳特異性表達啟動子(GluB-4，IOkD prolamin, 16kD prolamine和 Glb-1)。Qu 等人(J.Exp. Bot. 2008,59(9) =2417-2424)進一步利用 GUS 作報告基因，對 6 個水稻谷蛋白(GluA-1，GluA-2，GluA-3，GluB-3，GluB-5，GluC)基因啟動子的表達方式、組織表達特異性和表達強度進行了研究，發現GluA-1，GluA-2, GluA_3啟動子在胚乳的外周特異性表達，GluB-5和GluC啟動子在整個胚乳中特異性表達，而GluB-3啟動子則在糊粉層和亞糊粉層中特異性表達。
發明內容
本發明的目的是提供一種植物胚乳特異性表達啟動子及其應用。本發明所提供的植物胚乳特異性表達啟動子，來源于稻屬水稻(Oryza sativa) GluB-6基因的上游序列，可以是下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有70%以上同源性，且具有植物胚乳特異性表達啟動子功能的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。上述高嚴謹條件可為在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。其中，序列表中序列1是由2192個脫氧核苷酸組成。上述自序列表中序列1的5'端第2123-21 位核苷酸為植物胚乳特異性表達啟動子TATA盒核心區。將啟動子除TATA盒核心區外的其他序列通過堿基突變或缺失等發生變化，一般不會使啟動子活性完全喪失，因此也可根據需要將啟動子的調控元件改變。含有上述植物胚乳特異性表達啟動子的表達盒、重組表達載體、轉基因細胞系及宿主菌均屬于本發明的保護范圍。在所述表達盒中，所述植物胚乳特異性表達啟動子的下游連接結構基因，或調節基因，或結構基因或調節基因的反義基因，或者能夠干擾內源基因表達的小RNA，用于驅動結構基因，或調節基因，或結構基因或調節基因的反義基因，或者天然小RNA或人工合成的小RNA的表達。所述重組表達載體是上述表達盒與質粒、病毒或運載體表達載體所構建的重組載體，所述重組表達載體為重組植物表達載體，所述重組植物表達載體含有上述表達盒并且能夠將所述的表達盒轉送進入植物宿主細胞、組織或器官及其后代并且能夠或者至少方便所述的表達盒整合到宿主的基因組中，它包括但不限于雙元載體、共合載體。上述重組表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導或基因槍等常規生物學方法轉化植物細胞或組織或器官，得到轉基因植物細胞或組織或器官及由此分化、再生的完整植株及其無性系或其后代。
上述植物胚乳特異性表達啟動子可用于培育胚乳特異性表達外源基因的植物。利用該植物胚乳特異性表達啟動子培育胚乳特異性表達外源基因的植物的方法也屬于本發明的保護范圍。所述培育胚乳特異性表達外源基因的植物的方法可為將所述外源基因連接于所述植物胚乳特異性表達啟動子下游，通過植物表達載體轉入植物中，篩選得到在胚乳中特異性表達所述外源基因的轉基因植物。所述植物胚乳特異性表達啟動子下游還可連接有調控基因表達的調控元件。所述調控基因表達的調控元件，該調控元件包括能增強外源基因表達或調控基因在植物中表達部位的元件，如增強子、組成型表達、組織特異性表達、誘導型表達的調控元件。所述方法中，所述外源基因為蛋白編碼基因和(或)非蛋白編碼基因；所述蛋白編碼基因優選為品質改良基因；所述非蛋白編碼基因為正義RNA基因和/或反義RNA基因。所述方法中，所述植物為單子葉植物或胚乳型雙子葉植物。所述單子葉植物為水稻、小麥、玉米、大麥、高粱、燕麥等；所述胚乳型雙子葉植物是蕎麥、小桐子、油桐、蓖麻等。本發明的植物胚乳特異性表達啟動子是通過設計引物，以水稻基因組DNA為模板，利用PCR方法從水稻中分離得到的谷蛋白基因GluB-6啟動子。通過其在水稻中的表達特異性實驗表明本發明的啟動子使β-葡糖苷酸酶(GUS)報告基因只在水稻種子胚乳中特異性表達。說明本發明的啟動子可以啟動外源基因在植物的胚乳中特異性的表達，適用于任何種子具有胚乳的植物，即單子葉植物或胚乳型雙子葉植物。利用本發明的啟動子可提高外源基因在植物胚乳中的表達和累積水平，可改良種子品質、將具有生理活性的蛋白或短肽導入種子中創制保健型功能新品種、利用種子作生物反應器生產有用外源蛋白或可食性疫苗，增加農產品科技附加值等。本發明的啟動子及其應用為利用生物技術改良種子品質、分子醫藥農場等研究奠定了基礎，具有極大的應用前景。
圖1為GluB-6啟動子克隆載體pMD-GluB_6的結構示意圖。圖2為pMD-GluB-6的雙酶切鑒定圖譜。圖3為GluB-6啟動子融合⑶S基因植物表達載體GluB-6-pGPTV-35S_HPT的結構
示意圖。圖 4 為 GluB-6-pGPTV_;35S-HPT 雙酶切鑒定圖譜。圖5為轉GluB-6-pGPTV-35S-HPT載體Ttl代水稻植株PCR分析的電泳圖譜。圖6為轉GluB-6-pGPTV-35S_HPT載體Ttl代水稻葉、根及莖桿中的⑶S染色結果。圖7為轉GluB-6-pGPTV-35S_HPT載體Ttl代水稻種子中的⑶S染色結果。圖8為轉GluB-6-pGPTV-35S-HPT載體Ttl代水稻植株種子中的⑶S熒光活性測定結果。
具體實施例方式下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。
實施例1、植物胚乳特異性表達啟動子(GluB-6啟動子)的獲得根據Qu等人(J.Exp. Bot. 2008，59 =2417-2424)報導，選定一個谷蛋白基因(基因名為0s02g0248800)，定名為GluB_6。從GenBank中查找GluB_6基因的上游序列，設計引物擴增GluB-6啟動子。為便于載體構建，在引物上依次添加兩個酶切位點(下劃線所示)。 啟動子的正向引物為 GluB-6HindF :5，-TTAAGCTTTTCGCTGGATTAGAATTC-3’ (Hind III)，反向引物為 GluB-6SalR :5，GCGTCGACAGCTTTTGTATATACTAATAAAAC-3‘ (Sal I)。CTAB法從水稻(野生型水稻臺中65號，該品種為1936年我國臺灣省育成；曲樂慶等，植物學報，2001,43 :1167-1171 ；中國科學院植物研究所保存)葉片中小量提取基因組DNA，以其為模板，以GluB-6HindF和GluB_6&ilR為引物，進行PCR擴增GluB-6 啟動子序列。反應體系為10μΜ正反向引物各1μ l，10XEx Buffer 2μ1，基因組DNA 1 μ I(IOng) ,ExTaq(TaKaRa)O. 5unit，加超純水至 20 μ 1 ；反應程序為94°C 預變性 5min，然后 94°C lmin，55°C lmin30sec, 72°C 2min30sec，30 個循環，最后 72°C，lOmin。PCR 擴增得到2. 2kb的目的條帶。回收擴增產物，直接連接到PMD18-T載體(購自TaKaRa公司)上， 進行測序，結果表明，擴增得到的GluB-6啟動子序列大小為2192bp，具有序列表中序列1的核苷酸序列。將測序檢測表明含有GluB-6啟動子片段的重組載體命名為pMD-GluB-6(其結構示意圖如圖1所示)。pMD-GluB-6的雙酶切鑒定圖譜如圖2所示，圖2中泳道1為 pMD-GluB-6的雙酶切獲得的片段，泳道2為DNA分子量標記。實施例2、植物胚乳特異性表達啟動子(GluB-6啟動子)表達載體構建與遺傳轉化1、GluB-6啟動子融合⑶S基因的植物表達載體構建雙元表達載體pGPTV-35S-HPT 按照文獻(Qu and Takaiwa, Plant Biotech J 2004，2 :113-125)所述的方法構建，中國科學院植物研究所保存。用Ml I和Hind III雙酶切pMD-GluB-6質粒和pGPTV-35S-HPT。回收含有GluB-6啟動子的2192bp的酶切片段，將該片段連接到PGPTV-35S-HPT的Ml I和Hind III酶識別位點之間。將得到的重組質粒在 PCR鑒定的基礎上利用&il I和Hind III進行雙酶切鑒定，得到含有2. 21cbGluB-6啟動子的片段。將雙酶切鑒定表明含有GluB-6啟動子的重組質粒命名為GluB-6-pGPTV-35S-HPT (其結構示意圖如圖3所示)，GluB-6-pGPTV-35S-HPT中⑶S基因位于GluB-6啟動子下游，由 GluB-6啟動子啟動表達。其中，GluB-6-pGPTV-35S-HPT的雙酶切鑒定圖譜，如圖4所示。 圖4中泳道1為GluB-6-pGPTV-35S-HPT的雙酶切圖，泳道2為DNA分子量標記。2、轉 GluB-6-pGPTV_;35S-HPT 水稻的獲得用凍融法將GluB-6-pGPTV-35S_HPT 導入農桿菌 EHA105(Hood et al.， TransgenRes 1993，2 :208-218 ；中國科學院植物研究所保存)中，然后轉化野生型水稻 Kitaake0利用潮霉素篩選方法(按照文獻Hiei et al. , Plant J 1994，6 :271-282所述方法進行)，獲得11株Ttl代轉GluB-6-pGPTV-35S-HPT水稻植株。利用PCR方法對上述篩選得到的轉GluB-6-pGPTV-35S-HPT水稻進行PCR分子檢測，PCR引物為上述擴增GluB-6啟動子的引物，即:GluB-6啟動子的正向引物GluB_6HindF :5，-GGAAGCTTT TTAAGCTTTTCGCTGGATTAG-3，及反向引物 GluB_6SalR :5，-AAGTCGACTGCGTCGACAGCTTTT GTATAT-3，。PCR反應體系為10μΜ正反向引物各1μ l，10XEx Buffer 2μ1，基因組 DNA 1μ 1，ExTaq(TaKaRa)O. 5unit，加超純水至 20 μ 1 ；反應程序為94°C 預變性 5min，然后 94°C lmin，55°C lmin30sec, 72 °C 2min30sec，30 個循環，最后 72 °C，lOmin。PCR 擴增得到2. 2kb的目的條帶即為檢測陽性。結果表明共得到9株PCR檢測陽性的轉 GluB-6-pGPTV-35S-HPT水稻Ttl代植株。圖5中，第1泳道為以pMD-GluB-6質粒為模板擴增的陽性對照，第13泳道為PCR體系中不加模板的陰性對照，第2 12泳道分別為轉 GluB-6-pGPTV-35S-HPT植物表達載體的Ttl代植株。T0代轉基因植株所結的種子和由該種子長成的植株為T1代，依此類推，T2、T3分別表示轉基因植株第2代和第3代。實施例3、植物胚乳特異性表達啟動子(GluB-6啟動子)的功能驗證對轉GluB-6-pGPTV-35S_HPT水稻Ttl代植株進行組織化學染色。具體步驟將轉 GluB-6-pGPTV-35S-HPT水稻Ttl代植株的部分葉片、根、莖桿組織及用解剖刀從中部縱切開的開花后11天、15天、17天的灌漿期種子浸泡于⑶S反應液(0. IM NaPO4緩沖液，pH7. 0， IOmM EDTA, pH7. 0，5mM 鐵氰化鉀，5mM 亞鐵氰化鉀，1. OmMX-Gluc，0. 1 % Triton X-100)， 37°C反應。染色后的組織在70%乙醇中保存、觀察，并在解剖顯微鏡下照相。結果表明 轉GluB-6-pGPTV-35S-HPT水稻根、莖桿及葉中均未觀察到⑶S表達，結果圖6所示；開花后11天的種子胚乳外部變藍，胚乳中心部位和胚未被染成藍色；開花后15天的種子與開花后11天的種子相比，糊粉層、亞糊粉層、胚乳外部藍色清晰可見，胚未被染成藍色；開花后17天種子的整個胚乳的藍色清晰可見，胚仍未被染成藍色，結果圖7所示。染色結果表明GluB-6啟動子使β-葡糖苷酸酶(GUQ報告基因只在水稻種子胚乳中特異性表達。圖6 中1、2、3、4分別為根、莖桿、葉片、葉鞘染色結果。圖7中lld、15d、17d分別表示分別表示轉GluB-6-pGPTV-35S-HPT載體Ttl代水稻植株開花后11天、15天、17天灌漿期種子的⑶S 染色結果。實施例4、轉基因水稻的組織⑶S熒光活性測定對轉GluB-6-pGPTV-35S-HPT載體Ttl代水稻植株開花后15天的灌漿期種子進行⑶S定量分析，方法按照Jefferson等的熒光檢測方法(Jefferson，Plant Mol. Biol. Report, 1987, 5 =387-405)進行。具體為取1粒種子，置于1. 5ml印pendorf管中，用玻璃棒將種子碾碎，加入 30 μ 1 抽提液(50mM NaPO4 (pH7. 0)，IOmM β -Mercaptoethanol，IOmM Na2EDTA(ρΗ8· 0) ,0. 1 % SDS，0. 1 % Triton X-100)，搖勻。4°C 15，OOOrpm 離心 IOmin,取 10 μ 1上清于新管中，加入90 μ 1保溫至37°C的反應液(ImM MUG)，37°C反應60分鐘，加入900 μ 1終止液(0. 2Μ Na2CO3)，室溫終止反應。用F-4500 (日立)型熒光分光光度計在 360nm激發波長和460nm吸收波長下檢測相對4MU含量。以牛血清蛋白為對照，利用Bio-Rad Protein Assay Kit測定蛋白質含量，如圖8所示。結果表明，GluB_6啟動子驅動的⑶S在轉基因水稻種子中表達的活性為15. 65士8. 19pmol 4MU/min/μ g蛋白。圖8中，1 6分別為不同轉GluB-6-pGPTV-35S-HPT載體Ttl代水稻植株的3粒種子中⑶S表達活性平均值1 為 11.53pmol 4MU/min/μ g 蛋白，2 為 10. 83pmol 4MU/min/μ g 蛋白，3 為 10. 67pmol 4MU/ min/yg 蛋白，4 為 29. 81pmol 4MU/min/μ g 蛋白，5 為 21. 48pmol 4MU/min/μ g 蛋白，6 為 9. 6pmol 4MU/min/ μ g 蛋白。
權利要求
1.一種植物胚特異性表達啟動子，其序列是下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有70%以上同源性，且具有植物胚特異性表達啟動子功能的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.含有權利要求1所述的植物胚特異性表達啟動子的表達盒。
3.含有權利要求1所述的植物胚特異性表達啟動子的重組表達載體、轉基因細胞系或宿主菌。
4.權利要求1所述的植物胚特異性表達啟動子在培育轉基因植物中的應用，所述轉基因植物中的外源基因是在胚中特異性表達的。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于所述培育轉基因植物，是將所述外源基因連接于所述植物胚特異性表達啟動子下游，通過植物表達載體轉入植物中，篩選得到在胚中特異性表達所述外源基因的轉基因植物。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于所述胚特異性表達啟動子下游還連接有調控基因表達的調控元件。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于所述外源基因為蛋白編碼基因和/或非蛋白編碼基因；所述蛋白編碼基因優選為品質改良基因；所述非蛋白編碼基因為正義RNA 基因和/或反義RNA基因。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于所述單子葉植物為水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥；所述雙子葉植物是大豆、油菜或向日葵。
全文摘要
本發明公開了一種植物胚乳特異性表達啟動子及其應用。該啟動子，1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發明的啟動子可以啟動外源基因在植物的胚乳中特異性的表達，適用于任何種子具有胚乳的植物，即單子葉植物或胚乳型雙子葉植物。
文檔編號C12N1/15GK102250892SQ20101018372
公開日2011年11月23日 申請日期2010年5月20日 優先權日2010年5月20日
發明者徐秀萍, 曲樂慶, 柴志堅, 董祥柏 申請人:中國科學院植物研究所