幽門螺桿菌尿素酶b抗原表位多肽及其應用的制作方法

專利名稱：幽門螺桿菌尿素酶b抗原表位多肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位(UreB)蛋 白B細胞抗原表位多肽及其應用。
背景技術：
1982年澳大利亞學者Warren和Marshall首次從慢性活動性胃炎病人胃黏膜中分 離并培養出幽門螺桿菌(Helicabucter pylori，H. pylori)，該菌的發現揭開了胃微生物研 究的新時代。幽門螺桿菌分布極為廣泛，世界范圍內人群感染率高達50%左右。業已證實， 幽門螺桿菌感染是慢性慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍的主要病因，幽門螺桿菌的持續性 感染還與胃腺癌(gastric adenocarcinoma)和胃淋巴瘤(gastric lymphoma)的發生密切 相關。1994年，世界衛生組織將它定為I類致癌因子(Type I carcinogen)。現在針對幽門螺桿菌感染的治療主要是采用兩種抗生素聯合質子泵抑制劑，然 而，這一治療手段有著諸多缺點，如花費過高，患者依從性差和產生藥物抗性菌株的高風險 性等，尤其是抗生素治療不能防止再度感染。所以，現普遍認為疫苗是在全球范圍內控制幽 門螺桿菌感染的最有效的方法。早期的幽門螺桿菌疫苗研究大多應用幽門螺桿菌全菌成 分，存在著效果差、不易標準化等缺點。目前幽門螺桿菌疫苗抗原的研究集中在幽門螺桿菌 中具有免疫保護作用的抗原上。目前在小鼠模型上已證實多種幽門螺桿菌抗原，包括空泡 毒素(VacA)、細胞毒素相關蛋白(CagA)、熱休克蛋白A和B (HspA和HspB)、尿素酶和過氧化 氫酶等。其中尿素酶蛋白被視為最有前途的幽門螺桿菌疫苗候選，是研究最多的一個。尿 素酶不僅對幽門螺桿菌在胃內酸性環境下定植提供保護作用，而且是幽門螺桿菌中的一種 保守蛋白，不同菌株間的保守性達98%以上。已有大量動物實驗證明了它作為疫苗抗原的 安全性和有效性。尿素酶包括尿素酶A(UreA)和B(UreB)兩個結構亞單位，其中UreB是尿 素酶的主要功能單位，含有尿素酶的活性位點，其保護性優于UreA。疫苗是控制感染性疾病最為經濟有效的辦法，疫苗接種能夠刺激機體產生不同于 自然感染導致的特異性免疫應答，可以達到預防或者治療幽門螺桿菌感染的目的。目前尿 素酶疫苗預防幽門螺桿菌感染已在許多動物模型上獲得成功，國外多個研究組報告口服幽 門螺桿菌尿素酶能防止小鼠感染貓螺桿菌。迄今為止，國內外對幽門螺桿菌疫苗的研究主 要是采用模擬自然抗原的方法進行蛋白疫苗的研制，單獨表達某個抗原分子或融合表達幾 個抗原分子，亦或將抗原分子與粘膜免疫佐劑融合表達，可部分獲得一定時期內的免疫保 護作用。目前，表位疫苗已成為研制感染性疾病和惡性腫瘤疫苗的方向，且已在HIV、瘧疾、 乙肝病毒、腫瘤等方面表現出獨特的優勢。鑒于此，在表位水平上進行選擇和重組來設計疫 苗，可能會是一種有效的預防和治療幽門螺桿菌感染的疫苗形式。利用幽門螺桿菌保護性 抗原的表位來設計疫苗，通過單個或串連表達保護性抗原上的特異性表位，并輔以能有效 誘發黏膜免疫的佐劑來激發機本更強、更特異的、不同于自然感染時的免疫應答，有可能打 破免疫耐受，從而可以達到預防或治療幽門螺桿菌感染的目的。已經有大量實驗表明，尿素酶B亞單位(UreB)不僅對幽門螺桿菌感染具有預防作用，而且還可以在一定程度上清除體內已經感染的幽門螺桿菌。研究發現針對UreB不同表 位的單抗可以抑制尿素酶的活性，從而阻斷幽門螺桿菌的感染，但用完整的尿素酶免疫動 物并不能很好的抑制尿素酶的活性，因而不能完全阻止幽門螺桿菌在胃內的定植
發明內容

本發明的目的是提供一種幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位 (UreB)蛋白B細胞抗原表位多肽及其應用。本發明提供的幽門螺桿菌尿素酶B亞單位中和性B細胞抗原表位多肽，來源于幽 門螺桿菌尿素酶B亞單位(UreB)，名稱為UP38，，是如下1)或2)的多肽1)由序列表中序列37所示的氨基酸序列組成的多肽；2)將序列表中序列37的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且具有幽門螺桿菌尿素酶抗原表位功能的由1)衍生的多肽。序列表中序列37由15個氨基酸殘基組成，來源于幽門螺桿菌尿素酶B亞單位 (UreB)上第181-195位氨基酸殘基。所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加可為1-10個氨基酸殘 基的取代和/或缺失和/或添加；所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添 加可發生在上述結構域之外。上述表位多肽的編碼基因也屬于本發明的保護范圍，，所述編碼基因為1)、2)、3) 或4)1)序列表中序列28的DNA ；2)編碼序列表中序列37的蛋白質序列的多核苷酸；3)在嚴格條件下與1)或2)的基因雜交且編碼權利要求1所述蛋白的基因。4)與序列表中序列28同源性在80%以上并且編碼幽門螺桿菌尿素酶抗原表位功 能的多肽的核苷酸。上述嚴格條件可為用0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. SDS的溶液，在DNA或者RNA 雜交實驗中65°C下雜交并洗膜。序列表中的序列28由45個核苷酸組成，自5'端第1至45位核苷酸為編碼序列。本發明還提供檢測、預防或治療幽門螺桿菌感染的免疫制劑，其活性成分包括上 述表位多肽，如該免疫制劑由上述表位多肽和序列表中序列34所示的表位多肽、序列表中 序列31所示的表位多肽組成多聯多聚表位疫苗制劑，該免疫制劑的活性成分也可以單獨 為上述序列表中序列37所示的表位多肽。本發明還提供抑制尿素酶的活性的藥物，其活性 成分包括上述表位多肽和/或其抗體。如該由上述表位多肽和序列表中序列34所示的表 位多肽、序列表中序列31所示的表位多肽組成的藥物；該藥物活性成分也可以單獨為上述 表位多肽和/或其抗體；該抗體為體外培養雜交瘤細胞系獲得的抗體。本發明還提供上述幽門螺桿菌尿素酶B亞基中和性B細胞抗原表位多肽的篩選方 法，主要包括以下步驟(1)將幽門螺桿菌的UreB抗原采用截短法分段構建并進行目的蛋白的表達，通過 免疫印跡分析，初步確定單抗A1H10、B3D9、A3C10所針對的表位范圍；(2)根據上述步驟(1)所確定的幽門螺桿菌尿素酶B亞單位單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10所針對的抗原表位所在區域，進行第二次和第三次的截短分段構建UreB抗原，將單抗A1H10、B3D9、A3C10所針對的抗原表位精確定位在UreB特定的位置；(3)化學合成上述步驟(2)鑒定出來的抗原表位，通過間接ELISA法，以進一步確 定抗幽門螺桿菌尿素酶B亞單位單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10所針對的抗原表位。本發明運用分子生物學結合分子免疫學實驗鑒定的方法，篩選得到了由15個氨 基酸殘基構成的表位多肽，經濟、有效，為抗原表位的篩選提供了參考。本發明為新型的多 聯多聚表位疫苗的開發尊定了基礎，也為基于蛋白表位的病原生物診斷試劑盒的開發及治 療制劑的研制帶來新的思路。獲得的抗原表位對H. pylori發病機制的研究具有重要的意 義，有助于更有效的預防和控制幽門螺桿菌的感染。本發明提供的抗原表位多肽具有良好的免疫原性，在小鼠動物模型中可以誘導產 生針對此B細胞表位的特異性體液免疫應答，產生的抗血清不僅能夠中和尿素酶的活性， 而且還能與H. pylori天然菌株的尿素酶發生特異性抗原抗體反應。同時采用血清學分析 方法證實臨床感染幽門螺桿菌患者血清中產生了針對該UreB抗原表位的抗體。本發明提供的抗原表位多肽激發小鼠體內產生的抗體可抑制尿素酶活性，為尿素 酶抗原表位的研究奠定了良好的基礎。本發明提供的抗原表位多肽能刺激機體產生抗幽門 螺桿菌保護性免疫反應，并可以避免產生構象表位特異性抗體，從而增強對幽門螺桿菌感 染的抑制和清除效果，對相應疫苗的研發、致病機理的研究以及臨床診斷中起到很好的推 動作用。本發明的激發機體抗H. pylori的保護性免疫反應的抗原表位在體外檢測和產生 免疫保護上的具有很有價值的應用。


圖1不同截短UreB片段相對應的位置圖(數字表示在UreB中所對應的位置，白 色條表示與單克隆抗體A1H10、B3D9或A3C10 western blot反應為陰性，灰色條表示與單 克隆抗體A1H10、B3D9或A3C10western blot反應為陽性)圖2幽門螺桿菌(H. pylori)尿素酶B亞單位各截短抗原PCR擴增結果；其中，A 泳道1為核酸(DNA)分子量標準(Marker)；泳道2為目的基因UPl的PCR擴增 產物(400bp)；泳道3為目的基因UP2的PCR擴增產物(430bp)；泳道4為目的基因UP3的 PCR擴增產物(450bp)；泳道5為目的基因UP4的PCR擴增產物(660bp)；B 泳道1為核酸(DNA)分子量標準(Marker)；泳道2為目的基因U21的PCR擴增 產物(IOObp)；泳道3為目的基因U22的PCR擴增產物(85bp)；泳道4為目的基因U23的 PCR擴增產物(IOObp)；泳道5為目的基因U24的PCR擴增產物(115bp)；泳道6為目的基 因U25的PCR擴增產物(115bp)；泳道7為目的基因U26的PCR擴增產物(IOObp)。 C 泳道1為核酸(DNA)分子量標準(Marker)；泳道2為目的基因GST-UP32的PCR 擴增產物(60bp)；泳道3為目的基因GST-UP33的PCR擴增產物(60bp)；泳道4為目的基因 GST-UP34的PCR擴增產物(60bp)；泳道5為目的基因GST-UP36的PCR擴增產物(60bp)； 泳道6為目的基因GST-UP38的PCR擴增產物(60bp)；泳道7為目的基因GST-UP39的PCR 擴增產物(60bp) D 泳道1為核酸(DNA)分子量標準(Marker)；泳道2為目的基因GST-UP31的PCR 擴增產物(330bp)；泳道3為目的基因GST-UP35的PCR擴增產物(330bp)；泳道4為目的基因GST-UP37的PCR擴增產物(330bp)；結果表明各目的基因的PCR克隆擴增效果良好。
圖3為幽門螺桿菌(H. pylori)尿素酶B亞單位各截短抗原基因重組菌TPTG誘導 表達SDS-PAGE電泳圖；其中，A 泳道1為蛋白質分子量標準(Marker)；泳道2為空載體菌誘導4h ；泳道3為表 達UPl基因的重組菌誘導4h ；泳道4為表達UP2基因重組菌誘導4h ；泳道5為表達UP3基 因重組菌誘導4h ；泳道6為表達UP4基因重組菌誘導4h ；B 泳道1為蛋白質分子量標準(Marker)；泳道2為宿主菌誘導4h ；泳道3為空載 體菌誘導4h ；泳道4為基因重組菌UP21誘導4h ；泳道5為基因重組菌UP22誘導4h ；泳道6 為基因重組菌UP23誘導4h ；泳道7為基因重組菌UP24誘導4h ；泳道8為基因重組菌UP25 誘導4h ；泳道9為基因重組菌UP26誘導4h ；C 泳道1為蛋白質分子量標準(Marker)；泳道2為宿主菌誘導4h ；泳道3為空載 體菌誘導4h ；泳道4為基因重組菌GST-UP32誘導4h ；泳道5為基因重組菌GST-UP33誘導 4h ；泳道6為基因重組菌GST-UP34誘導4h ；泳道7為基因重組菌GST-UP36誘導4h ；泳道8 為基因重組菌GST-UP38誘導4h ；泳道9、10為基因重組菌GST-UP39誘導4h ；D 泳道1為蛋白質分子量標準(Marker)；泳道2為宿主菌誘導4h ；泳道3為空載 體菌誘導4h ；泳道4為基因重組菌GST-UP31誘導4h ；泳道5為基因重組菌GST-UP35誘導 4h ；泳道6為基因重組菌GST-UP37誘導4h圖4為截短的UreB片段與單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10免疫印跡圖；其中，A第 一次分段表達的截短抗原(UP1、UP2、UP3和UP4)與單克隆抗體A1H10、B3D9或A3C10免疫 印跡分析；(1)UP1、UP2、UP3和UP4與單克隆抗體AlHlO的免疫印跡結果；(2)UP1、UP2、UP3 和UP4與單克隆抗體B3D9的免疫印跡結果；(3)UP1、UP2、UP3和UP4與單克隆抗體A3C10 的免疫印跡結果；B為第二次分段表達的截短抗原(UP21、UP22、UP23、UP24、UP25和UP26)與單克 隆抗體 A1H10、B3D9 或 A3C10 免疫印跡分析；(1)UP21、UP22、UP23、UP24、UP25 和 UP26 與單 克隆抗體AlHlO的免疫印跡結果；(2)UP21、UP22、UP23、UP24、UP25和UP26與單克隆抗體 B3D9的免疫印跡結果；(3)UP21、UP22、UP23、UP24、UP25* UP26與單克隆抗體A3C10的免 疫印跡結果；C 為第三次分段表達的截短抗原(GST-UP31、GST-UP32、GST-UP33，GST-UP34、 GST-UP35、GST-UP36，GST-UP37、GST-UP38 和 GST-UP39)與單克隆抗體 A1H10、B3D9 或 A3C10 免疫印跡分析；(1)GST-UP31、GST-UP32、GST-UP33與單克隆抗體AlHlO的免疫印跡結果； (2)GST-UP34、GST-UP35、GST-UP36 與單克隆抗體 B3D9 的免疫印跡結果；(3)GST-UP37、 GST-UP38、GST-UP39與單克隆抗體A3C10的免疫印跡結果圖 5 為融合表位月太 GST-UP32、GST-UP35、GST-UP38 分別與 AlHlO、B3D9、A3C10 間 接ELISA分析。圖6為單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10對合成表位肽的識別的間接ILISA分析圖7為表位肽對H. pylori病人血清的識別。A :H. pylori 病人血清與融合表位 GST_UP32、GST_UP35 和 GST-UP38 的 ELISA 反應； B :H. pylori病人血清與合成表位肽UP32、UP35和UP38的ELISA反應。圖8為鼠抗融合表位肽血清對融合表位肽、合成肽、不同天然H. pylori菌株尿素酶B亞單位蛋白的識別；A抗表位血清與對應融合肽的Western blot分析；B抗表位血清與 對應合成肽的ELISA反應；C抗表位血清與天然H. pylori菌株尿素酶B亞單位蛋白ELISA 反應。圖9為單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10及抗融合表位多抗抑制幽門螺桿菌尿素酶
活性實驗。
具體實施例方式下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。實施例1、抗幽門螺桿菌尿素酶B亞單位單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10抗原識別 表位的鑒定通過多次截短分段表達尿素酶B片段篩選抗原表位，各次截斷片段在幽門螺桿菌 尿素酶B亞單位的位置關系如圖1所示。一、UreB截短蛋白的第一次分段表達及抗原表位的初步鑒定1、截短的幽門螺桿菌UreB分段抗原UPl (序列5)、UP2 (序列6)、UP3 (序列7)、 UP4(序列8)的重組表達1)幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)的培養幽門螺桿菌(Helicobacter pylori) 26695 (ATCC No. 700392)采用固體培養，培養 基為空腸彎曲菌瓊脂基質(中國腹瀉病控制上海試劑供應研究中心)43g/L、脫纖維羊血 (由市場采購活羊經頸動脈取血后用玻璃珠脫纖維處理后即得)50ml/L、抗菌素多粘菌素 B (購自Merck) 0. 38mg/L、萬古霉素(購自Amresco) 10mg/L和兩性霉素B (購自Sigma) 5mg/ L。37°C微需氧環境(5% O2,10% CO2,85% N2)中培養48_72hr，改良布氏肉湯收集菌體。2)幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)基因組DNA的制備幽門螺桿菌(Helicobacter pylori) 26695基因組DNA提取按照promega公司細 菌基因組提取試劑盒說明書進行。3)引物序列設計根據Genbank已公布的H. pylori國際標準株26695的基因組序列找到UreB的基 因序列(gi :21637177)，利用Primerf. 0軟件設計設計4對特異性引物，在上游和下游引物 中分別加入SacI和Hind III酶切位點(下劃線示酶切位點)，它們的序列如下所示擴增UPl的編碼基因(序列表中序列1)的引物UP1-F CGAGCTCAAAAAGATTAGCAGAAAAG ；UPl-R CCCAAGCTTTTAAGCAGTTACGATC。擴增UP2的編碼基因(序列表中序列2)的引物UP2-F CGAGCTCAATCTTAGCGTAGGTCC ；UP2-R CCCAAGCTTTTAGTCTGTGTGGATAG。擴增UP3的編碼基因(序列表中序列3)的引物UP3-F CGAGCTCATCAATCATGCGTTAG ；UP3-R CCCAAGCTTTTACCAAGTTCTAGTGATA。擴增UP4的編碼基因(序列表中序列4)的引物UP4-F :GAGCTCATTTTCTCAATCACCAG ；UP4-R CCCAAGCTTGAAAATGCTAAAGAGTT。4) PCR擴增目的基因以幽門螺桿菌(Helicobacter pylori) 26695株基因組DNA為模板，加入相應引物，經過30個PCR循環擴增得到UreB分段片段UPl (編碼基因具有序列表中序列1的核苷酸序列)、UP2 (編碼基因有序列表中序列2的核苷酸序列)、UP3 (編碼基因具有序列表中 序列3的核苷酸序列)、UP4(編碼基因具有序列表中序列4的核苷酸序列)的編碼基因，經 1.0%瓊脂糖電泳顯示，各目的片段與擴增基因的理論大小一致。各段目的基因的PCR擴增結果如圖2中A所示，表明目的基因UP1、UP2、UP3、UP4 編碼基因的PCR克隆擴增效果較好，分別擴增出了約400bp、430bp、450bp、660bp大小的目 的片段，經測序表明序列正確。2、分段抗原UP1、UP2、UP3、UP4表達質粒的構建及表達將步驟1擴增得到的PCR產物UP1、UP2、UP3、UP4編碼基因純化后分別用SacI 和Hind III雙酶切與經同樣酶雙酶切的質粒pET-28a(+)(購自Merck)連接后轉化E. coli DH5 α (購自天根生化)，在終濃度為50 μ g/ml卡那霉素抗性的培養基篩選后進行酶切和 測序鑒定，將酶切和測序鑒定表明正確的重組載體命名為pET-UPl、pET-UP2、pET_UP3、 PET-UP4。提取重組質粒pET-UPl、pET-UP2、pET-UP3、pET-UP4并轉化大腸桿菌BL21 (購自 天根生化)株，在終濃度為50 μ g/ml卡那霉素抗性的培養基篩選后，質粒進行酶切鑒定，得 到鑒定無誤的表達UP1、UP2、UP3或UP4的重組菌。取鑒定無誤的重組菌接種于5ml含卡 那霉素的LB培養液中，37°C搖床培養過夜。次日，將過夜培養的重組菌按1 100的比例 轉種于5ml含卡那霉素的新鮮LB培養液中，37°C，200rpm培養至OD6tltl值約為0. 6時加入 IPTG至終濃度1. OmM,誘導培養4h，取Iml培養物，離心收集菌體，用80 μ 1 PBS (0. 01mol/L, pH7. 4)重懸，加入20 μ 1 5倍SDS-PAGE上樣緩沖液(1L溶液中含15. Ig Tris堿，94g甘氨 酸，5gSDS)，混均后沸水中煮5分鐘，離心收上清進行SDS-PAGE分析。同時，以轉pET_28a (+) 的大腸桿菌BL21重組菌為對照。SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達情況，篩選高效表達菌株。誘導表達鑒定結果如圖3中A所示，結果顯示UPl在相對分子質量約18kD、UP2在 相對分子質量約20kD、UP3在相對分子質量約21kD、UP4在相對分子質量約28kD處有的特 異蛋白表達條帶，與預期的融合蛋白大小一致。3, Western blot鑒定A1H10、B3D9、A3C10單克隆抗體識別的表位所在區域Western blot具體操作步驟如下按照步驟2的方法，分別培養表達UP1、UP2、UP3或UP4的重組菌，制備蛋白電泳樣 品，進行15%的SDS-PAGE電泳。電泳完畢，50V電壓濕轉4h至NC膜上。加入含5%脫脂奶 粉的PBST室溫封閉2h，PBST洗3次，每次5min。分別加入1 5000稀釋的三株小鼠抗UreB 單抗B3D9(生物技術通訊，2007 ；18(2) :246_8，中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程 研究所在專利保護期限內提供)、A1H10 (生物技術通訊，2007 ；18(2) :246_8，中國人民解放 軍軍事醫學科學院生物工程研究所在專利保護期限內提供)、A3C10 (生物技術通訊，2007 ； 18(2) :246-8，中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所在專利保護期限內提供)， 室溫放置lh，PBST洗3次。加入1 50000稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgG(Sigma)，室溫 放置Ih，PBST洗3次。DAB顯色。Western blot結果見圖4中A，免疫印跡結果顯示重組UP2蛋白與小鼠抗UreB單 抗AlHlO和B3D9發生了抗原抗體特異性結合反應，重組UP3和UP4蛋白與小鼠抗UreB單 抗A3C10發生了抗原抗體特異性結合反應，說明了單克隆抗體AlHlO和B3D9所針對的抗原 表位位于UreB蛋白UP2內，單克隆抗體A3C10所針對的抗原表位位于UP3和UP4疊加的位置。
為了將三株單抗識別UreB各段的抗原表位限定到比校小的范圍內，我們又將第 一次表達能被這三株單抗識別的段進行第二次的表達及鑒定。二、UreB截短蛋白的第二次分段表達及抗原表位的進一步鑒定UreB截短蛋白的第二次分段表達及抗原表位的進一步鑒定所用的方法與第一次 分段表達鑒定的方法類似，所用的表達載體為PGEX-4T-2 (購自Amersham)。第二次分段分成六段UreB截短蛋白UP21 (序列表中序列15)、UP22 (序列表中 序列16)、UP23 (序列表中序列17)、UP24 (序列表中序列18)、UP25 (序列表中序列19)禾口 UP26 (序列表中序列20)，表達UP21、UP22、UP23、UP24、UP25、UP26的各編碼基因引物表如 下，在上游和下游引物中分別加入EcoR I和Xho I酶切位點，下劃線示酶切位點。擴增UP21編碼基因(序列表中序列9)的引物對UP21F CCGGAATTCTAGATGGCGTTAAAAA ；UP21R CCGCTCGAGTCATGTGTCAATACCA。擴增UP22編碼基因(序列表中序列10)的引物對UP22F CCGGAATTCTCGGTGGTATTGACA ；UP22R CCGCTCGAGTTAGGTTGTTACACCGCTT。擴增UP23編碼基因(序列表中序列11)的引物對UP23F CCGGAATTCTAAGCGGTGTAACAAC ；UP23R CCGCTCGAGTTATTTTAAATTTCTTCTG。擴增UP24編碼基因(序列表中序列12)的引物對UP24F CCGGAATTCTAACTATCACTCCAGGCA ；UP24R CCGCTCGAGTTACGCGTCGTTAGAAG。擴增UP25編碼基因(序列表中序列13)的引物對UP25F CCGGAATTCTAGCTTCTAACGACGCG ；UP25R CCGCTCGAGTTATAACGCATGATTGATT。擴增UP26編碼基因(序列表中序列14)的引物對UP26F CGGAATTCTACCTCAAACCATTGCGGC ；UP26R CCGCTCGAGTTAACCCACACGACCCATAG。PCR擴增結果如圖2B所示，分別擴增出UP21、UP22、UP23、UP24、UP25、UP26編碼 基因，它們的大小約1 OObp、85bp、1 OObp、115bp、115bp、1 OObp大小的目的片段。按照步驟一中的步驟2的方法分別構建表達UP21、UP22、UP23、UP24、UP25或UP26 的重組載體，只是將出發載體由PGEX-4T-2替換pET-28a(+)。鑒定表明正確的重組載體命 名為 PGEX-UP21、PGEX-UP22、PGEX-UP23、PGEX-UP24、PGEX-UP25、PGEX-UP26。按照步驟一 的步驟2所述的方法誘導表達UP21、UP22、UP23、UP24、UP25或UP26蛋白，并進行SDS-PAGE 檢測重組蛋白的表達情況，篩選高效表達菌株。蛋白誘導表達鑒定結果如圖3中B所示，表明基因重組菌經過誘導后，在約 28KDa 29KDa處有增加的蛋白表達條帶，與目的蛋白分子量大小一致。參照步驟一的步驟3的方法進行UP21、UP22、UP23、UP24、UP25或UP26蛋白 Western blot檢測，Western blot結果如圖4中B所示，重組UP23蛋白能被小鼠抗UreB 單抗AlHlO識別，UP24蛋白能被小鼠抗UreB單抗B3D9識別，UP26蛋白能被小鼠抗UreB單 抗A3C10識別，出現特異性的反應條帶，表明單克隆抗體AlHlO所針對的抗原表位位于UreB 蛋白UP23內，單克隆抗體B3D9所針對的抗原表位位于UP24內，單克隆抗體A3C10所針對 的抗原表位位于UP26內。為了將三株單抗識別UreB各段的抗原表位精確定位到更小的范圍，同樣將第二次鑒定為陽性的片段進行更小的分段鑒定。三、UreB截短蛋白的第三次分段表達及抗原表位的精確定位 第三次分段分成九段UreB截短蛋白，表達引物表如下，在GST-UP32 (UP32序列為 序列表中序列31)、GST-UP33 (UP33序列為序列表中序列32)、GST-UP34 (UP34序列為序列 表中序列33)、GST-UP36 (UP36序列為序列表中序列35)、GST-UP38 (UP38序列為序列表中 序列37)、GST-UP39 (UP39序列為序列表中序列38)上游和下游引物中分別加入EcoR I和 Xho I酶切位點，在GST-UP31 (UP31序列為序列表中序列30)、GST_UP35 (UP35序列為序列表 中序列34)、GST-UP37 (UP37序列為序列表中序列36)上游和下游引物中分別加入BstB I 和Xho I酶切位點(下劃線示酶切位點)擴增GST-UP31編碼基因(UP31編碼基因序列為序列表中序列21)的引物對 GST-UP31F GAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCA ；GST-UP31R CCGCTCGAGATCAGCAGGACCAGTTCCGCCACCAATCATGGTTGTTACACCGCTACGCGGAACCAGATC。擴增GST-UP32編碼基因(UP32編碼基因序列為序列表中序列22)的引物對 GST-UP32F CGGAATTCTAGGTGGCGGAACTGGTCCTGCTGATGGC ；GST-UP32R CCGCTCGAGTCAGATAGTAGTCGCATTAGTGCCATCAGCAGGAC。擴增GST-UP33編碼基因(UP33編碼基因序列為序列表中序列23)的引物對 GST-UP33F CCGGAATTCTCGGCACTAATGCGACTACTATCACTCCAGGC ；GST-UP33R CCGCTCGAGCTATTTTAAATTTCTTCTGCCTGGAGTGAT。擴增GST-UP34編碼基因(UP34編碼基因序列為序列表中序列24)的引物對 GST-UP34F CCGGAATTCTGACTATCACTCCAGGCAGAAGAAATTTAAAA ；GST-UP34R CCGCTCGAGTTACGCTCTGAGCATCCATTTTAAATTTCT。擴增GST-UP35編碼基因(UP35編碼基因序列為序列表中序列25)的引物對 GST-UP35F GAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCA ；GST-UP35R CCGCTCGAGGAAACCTAAGTTCATAGAATATTCTTCAGCCGCTCTGAGCATCCAACGCGGAACCAGATC。擴增GST-UP36編碼基因(UP36編碼基因序列為序列表中序列26)的引物對 GST-UP36F CGGAATTCTAATGAACTTAGGTTTCTTGGCTAAAGGTAACGC ；GST-UP36R CCGCTCGAGTTACGCGTCGTTAGAAGCGTTACCTTTA。擴增GST-UP37編碼基因(UP37編碼基因序列為序列表中序列27)的引物對 GST-UP37F GAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCA ；GST-UP37R CCGCTCGAGCCCCATGTCATGCAAAGTGTCTTCAGCCGCAATGGTTTGAGGACGCGGAA
CCAGATC。 擴增GST-UP38編碼基因(UP38編碼基因序列為序列表中序列28)的引物對 GST-UP38F CGGGAATTCTAACTTTGCATGACATGGGGATTTTCTCAATCAC ；GST-UP38R CCGCTCGAGTTAAGAGTCAGAGCTGGTGATTGAGAAAATCC。擴增GST-UP39編碼基因(UP39編碼基因序列為序列表中序列29)的引物對 GST-UP39F GGAATTCTAATTTTCTCAATCACCAGCTCTGACTCTCAAGCTATGGG ；GST-UP39R CCGCTCGAGTTAACCCACACGACCCATAGCTTGA。GST-UP32、GST-UP33、GST-UP34、GST-UP36、GST-UP38、GST-UP39 以兩個長引物直 接退火合成，GST-UP31、GST-UP35、GST-UP37以PGEX-4T-2為模板，用常規PCR方法擴增得 到。PCR 擴增結果如圖 2C、2D 所示，擴增出了 GST-UP32、GST-UP33、GST-UP34、 GST-UP36、GST-UP38、GST-UP39的編碼基因約60bp大小的特異性目的片段，擴增得到 GST-UP31、GST-UP35、GST-UP37的編碼基因為約330bp大小的特異性目的片段。按照步驟一中的步驟2的方法分別構建表達GST-UP31、GST-UP32、GST-UP33、 GST-UP34、GST-UP35、GST-UP36、GST-UP37、GST-UP38、GST-UP39 的重組載體，只是將出發載 體由PGEX-4T-2替換pET-28a (+)。鑒定表明正確的重組載體命名為PGEX-UP31、PGEX-UP32、 PGEX-UP33、PGEX-UP34、PGEX-UP35、PGEX-UP36、PGEX-UP37、PGEX-UP38、PGEX-UP39。按 照步驟一的步驟2所述的方法構建表達GST-UP31、GST-UP32、GST-UP33、GST-UP34、 GST-UP35、GST-UP36、GST-UP37、GST-UP38、GST-UP39目的蛋白的大腸桿菌工程菌，并誘導 表達 GST-UP31、GST-UP32、GST-UP33、GST-UP34、GST-UP35、GST-UP36、GST-UP37、GST-UP38、 GST-UP39并進行SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達情況，篩選高效表達菌株。蛋白誘導表達鑒定結果如圖3中C、圖3中D所示，表明基因重組菌經過誘導后，在 約27KDa 28KDa處有增加的蛋白表達條帶，與目的蛋白分子量大小一致。參照步驟一的步驟3 的方法對 GST-UP31、GST-UP32、GST-UP33、GST-UP34、 GST-UP35、GST-UP36、GST-UP37、GST-UP38、GST-UP39進行Western blot檢測，Western blot 結果如圖4中C所示，結果顯示重組GST-UP32蛋白與單抗AlHlO發生了特異性結合反應， GST-UP35蛋白與單抗B3D9發生了特異性結合反應，GST-UP38蛋白與單抗A3C10發生了特 異性結合反應，表明單克隆抗體AlHlO說明單抗所對應表位為GST-UP32，單克隆抗體B3D9 所對應表位為GST-UP35，單克隆抗體A3C10所對應表位為GST-UP38。四、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法確定單抗A1H10、B3D9、A3C10的表位同時，用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法確定單抗A1H10、B3D9、A3C10的表位，將 通過GSTrap 4B親和柱純化的融合表位蛋白GST-UP32、GST-UP35、GST-UP38分別包被ELISA 板，以檢測單抗A1H10、B3D9、A3C10所針對的表位。具體操作步驟如下1、重組蛋白樣品準備將上述構建的表達GST-UP32、GST-UP35、GST-UP38目的蛋白的大腸桿菌工程菌于 含有相應抗生素的LB平板上劃線，37°C活化16-20h ；挑單克隆接種于5ml LB培養基中， 37°C搖菌過夜；次日，以1 100(重量比)接種量轉接到新鮮LB培養基中，37°C搖菌至0D600 1. 0，加入IPTG (終濃度ImM)誘導培養3_4h ；收集菌體，每升菌液約以50mL預冷的 STE(10mM Tris HCl pH8.0、150m M NaClUmM EDTA, pH 8.0)的溶液重懸；超聲破碎菌 體，15000g, IOmin離心收集上清，通過GSTrap 4B親和柱純化融合表位蛋白，具體是在上清 中加入適量Triton x-100至終濃度為l%，h) 0.45 μ m濾膜注射器過濾，上清4°C保存備用； 在8mL上清中加入 ImL用預冷 IX PBS(140mM NaCl, 2. 7mM KCl，10mMNa2HP04，1. 8mM KH2P04, PH 7.3)洗滌過的GST樹脂，輕輕晃動令其吸附蛋白0.5h。將含有GST融合蛋白的溶液注 入已平衡好的層析柱中，當含有融合蛋白的溶液全部進入柱中時，以30倍體積的預冷PBS 洗滌，加入ImL新鮮配制的15mM的谷胱甘肽洗脫液(IOmM的谷胱甘肽、50mM的Tris-HCl中 PH8. 0)，輕輕懸起后靜置lOmin，收集洗脫液，重復洗脫兩次；分別取等量的含有GST融合蛋 白(PGEX-4T-2表達蛋白純化)的流出液，洗滌液和洗脫的目的蛋白進行SDS-PAGE以分析 目的蛋白；收集含有目的蛋白的洗脫部分；然后通過PBS透析或去除游離的谷胱甘肽，樣品 進行SDS-PAGE后采集凝膠照片，用BandScan5. 0軟件進行分析，檢測表面純化得到的融合 蛋白純度為90%以上。2、用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法確定單抗A1H10、B3D9、A3C10的表位1)抗原包被用包被液分別將抗原(步驟1獲得的蛋白)稀釋為3 μ g/mL的混懸 液，加入ELISA板，IOOul/孔，同時設定陰性對照(即純化的GST融合蛋白)，4°C包被過夜；2)洗滌用洗滌液PBST洗滌ELISA板各孔3次，每次5分鐘，浙干；3)封閉每孔加入含5%脫脂奶粉的PBST溶液各200 μ L，置37°C孵育2h ；4)加入用保溫液(含0.5%脫脂奶粉的PBST溶液)適當稀釋(1 400-1 1000 倍)的單克隆抗體々1!110、830943(10，10(^1/孔，每個稀釋度各加兩孔。置37°C孵育2h， 洗滌同步驟2)；5)加入酶結合物(二抗)用保溫液將辣根過氧化物酶標記的抗小鼠二抗適當稀 釋(1 50000)加入反應孔，每孔100 μ L。置37°C孵育lh，洗滌同步驟(2)；6)顯色加入顯色底物溶液，每孔100 μ L，室溫避光顯色5-lOmin ；7)終止反應加入終止液2M/L H2SO4,每孔50 μ L ；8)測定OD值用酶聯檢測儀于492nm波長測定各反應孔的OD值，記錄結果；9)結果判斷以純化的GST OD492平均值作為陰性對照，融合表位蛋白OD492彡2. 1 倍陰性對照值(P/N ^ 2. 1)視為單抗所針對的抗原表位。上述反應結果與Western blot結果一致，如圖5所示，表明單克隆抗體A1H10、 B3D9、A3C10與融合表位蛋白GST-UP32、GST-UP35、GST-UP38發生了特異性結合反應，說明 單克隆抗體 A1H10、B3D9、A3C10 所對應的表位分別為 GST-UP32、GST-UP35、GST-UP38。實施例2、合成表位多肽以進一步確證單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10所針對的抗 原表位1、表位肽的合成針對實施例1中所確定的單抗識別表位，采用化學合成法合成表位多肽(送北京 中科亞光生物有限公司合成)，分別命名為UP32(氨基酸序列為序列表中序列31)、UP35(氨 基酸序列為序列表中序列34)、UP38(氨基酸序列為序列表中序列37)純度為90%以上，合 成量為4mg。2、ELISA方法確定單抗A1H10、B3D9、A3C10所針對的抗原表位
將合成的3條表位多肽UP32、UP35、UP38 (10 μ g/ml)分別包被ELISA板(IOOul/ 孔)，以檢測A1H10、B3D9、A3C10單抗所針對的表位。具體操作步驟同實施例1的步驟四。
反應結果如圖6所示，表明單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10與融合表位蛋白 GST-UP32、GST-UP35、GST-UP38發生了特異性結合反應，說明單克隆抗體A1H10、B3D9、 A3C10所對應的表位分別為UP32、UP35、UP38。實施例3、融合表位肽和合成表位肽與病人血清的識別實驗為了檢測臨床感染H. pylori病人血清中是否產生針對本發明鑒定出的抗原 表位的特異性抗體，我們將實施例1制備的融合表位肽(3yg/ml)GST-UP32、GST-UP35、 GST-UP38及實施例2合成的表位肽(10μ g/ml)UP32、UP35、UP38分別包被ELISA板(IOOul/ 孔)，以本實驗室收集并用S001幽門螺桿菌尿素酶檢測試劑盒(膠體金法，北京康美天鴻生 物技術有限公司)鑒定為UreB陽性的病人血清3份和2份正常人血清作為一抗(1 100) 進行ELISA分析，具體操作步驟同實施例1的步驟四。反應結果如圖7所示，融合表位蛋白和合成表位肽均與3份幽門螺桿菌感染患者 血清發生了陽性反應，與2份正常人血清均不發生反應，說明幽門螺桿菌感染病人中產生 了針對本發明表位肽的抗體，這為多價表位疫苗和診斷試劑的研制提供了新的思路。實施例4、表位抗原的多克隆抗血清對合成肽和天然UreB蛋白的識別1、鼠抗血清的制備1)動物免疫選取6-8周齡的SPF級雌性BALB/C小鼠，于背部皮下多點注射實施例1中所 純化的融合表位蛋白GST-UP32、GST-UP35及GST-UP38進行免疫，3次免疫抗原劑量均為 100μ g/只。首次免疫時將抗原加等量完全弗氏佐劑(CFA)充分混合乳化后皮下多點注射， 每隔2周再以抗原加等量不完全弗氏佐劑(IFA)乳化后加強免疫兩次。同時設立只注射 PBS緩沖液(pH7. 0，50mmol/L)和GST蛋白免疫組作為對照免疫組，免疫程序相同，每組5只 小鼠。3次免疫后10天耳緣靜脈采血，檢測抗血清效價，達到較理想的滴度后，于免疫程序 結束后14天，取血并收集免疫后多克隆抗血清。2)間接ELISA法檢測抗體效價對抗體效價的檢測采用間接ELISA法進行。用純化的GST-UP32、GST-UP35、 GST-UP38融合蛋白以包被液稀釋至3 μ g/ml，包被于酶標板中，每孔100μ 1，4°C包被過 夜。次日加入不同稀釋度待檢抗血清，以1 100稀釋的正常小鼠血清為對照，二抗為 1 50000稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG，顯色底物為鄰苯二胺(OPD)，顯色結果用酶標儀在波 長490nm處進行測定，P/N大于2. 1為陽性。結果顯示，三次免疫后，各實驗組的抗體效價可達1 25600-1 51200，而PBS對 照組基本不與任何一個融合表位反應，說明本發明構建融合表位蛋白能夠很好地激發機體 的體液免疫應答。2、ELISA法檢測多克隆抗血清與不同表位合成肽和天然UreB蛋白的識別1)蛋白樣品的準備(1)幽門螺桿菌的培養幽門螺桿菌國際標準菌株NCTC I 1637(購自英國的國立標準菌種收藏所 (NCTC))、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori) 26695的培養同實施例1的步驟1中的步驟1)。(2)幽門螺桿菌NCTC I 1637、26695全菌蛋白樣品的制備 用肉湯從幽門螺桿菌固體培養板上刮下幽門螺桿菌國際標準菌株NCTC I 1637或 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori) 26695菌體，4°C，5000g離心IOmin收集菌體，用預冷 的低鹽PBS緩沖液(ρΗ7· 0，50mmol/L)洗3次，每次均為4°C，5000g離心IOmin,最后用低 鹽PBS(pH7.0，50mmol/L)重懸。冰浴超聲lOmin，使細胞徹底破碎。然后將溶液室溫放置 0.5h，充分溶解蛋白質，SOOOg離心20min去掉不溶物。收集上清，即為全菌蛋白溶液。2)酶聯免疫吸附實驗檢測多克隆抗血清與不同表位合成肽天然UreB蛋白的識別將實施例2合成的表位肽UP32、UP35、UP38及幽門螺桿菌NCTC I 1637,26695 全菌蛋白樣品以lOOOng/lOOul/孔的量包被ELISA板。一抗為融合蛋白免疫的鼠抗血清 (1 100)，具體實驗步驟同實施例1。反應結果如圖8A、8B所示，結果發現，免疫的鼠抗血清能夠很好地識別相應的表 位合成肽，同時也能與天然的UreB發生反應。3、多克隆抗血清與天然UreB蛋白的western blot分析將上述準備好的幽門螺桿菌26695全菌蛋白樣品行SDS-PAGE電泳，轉膜，然后與 實施例1中所純化的融合表位蛋白GST-UP32、GST-UP35及GST-UP38免疫小鼠后抗血清 進行免疫印跡分析，以純化的融合表位蛋白及截短的UreB蛋白UreBM(是UreB蛋白上第 106-377位的多肽，按照實施例1的方法表達純化，其編碼基因的擴增引物為F CGAGCTCAATCTTAGCGTAGGTCC(SacI) ；R CCCAAGCTTCCAAGTTCTAGTGATAA(Hind HL)；利用該引物，以幽門螺桿菌(Helicobacterpylori) 26695基因組為模板，擴出目標基 因片段，再插入pET28a (+)載體的SacI和Hind III酶切位點之間構建得到重組載體，將重組 載體轉化BL21后表達，純化就可以得到用于陽性對照的UreBM)作為陽性對照，同時以BSA 作為陰性對照，抗血清按1 200倍稀釋其余具體操作步驟同實施例1。結果如圖8C所示，抗血清與純化的融合表位蛋白及截短的UreB蛋白UreBM發生 了陽性反應，并且與天然幽門螺桿菌26695的UreaB也發生了特異性抗原抗體反應，而與 BSA未見陽性反應發生，說明由融合表位蛋白免疫BALB/e小鼠制備的抗血清能夠識別天 然的UreB蛋白，進一步說明我們鑒定出來的表位是有效的表位，可作為表位疫苗的候選分 子。實施例5、單抗及多抗血清抑制尿素酶活性試驗含有尿素酶活性的提取物來自于上述制備的幽門螺桿菌NCTC 11637全菌破碎物 的離心上清。取含有尿素酶的提取物稀釋于25μ 1 PBS (ρΗ7. 0)中，分別與同樣稀釋于25 μ 1 PBS(ρΗ7. 0)的實施例4中制備的GST-UP32、GST-UP35及GST-UP38多克隆抗血清、單克隆 抗體Α1Η10、B3D9、A3C10共孵育于酶聯板中，4°C過夜。取含有500mM尿素，0. 02%酚紅和 0. ImM DTT的50mM磷酸鹽緩沖液(pH6. 8) 50 μ 1加于酶聯孔中，室溫孵育5h后測量560nm 處的OD值。同時以抗GST的多抗鼠血清、用實施例4中PBS免疫的小鼠血清作為對照。抑 制率(％)=(無抗體的OD值-加抗體后的OD值)/(無抗體的OD值)X100。試驗結果如圖9所示，與對照組相比，單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10對尿素酶 有顯著的抑制作用，當劑量達到25yg時，抑制率均可達70%，GST-UP32、GST-UP35及 GST-UP38多克隆抗血清對尿素酶也有一定的抑制作用，當加入的抗體劑量為30μ g時，抑制率均可達50%，而且這種抑制具有劑量依賴性，隨著加入抗體劑量的增加，抑制率呈上升 趨勢。
根據以上試驗可證明，本發明利用分段截短法構建分段抗原并用western blot方 法確定了各單抗所針對的抗原表位。本發明鑒定出來的表位免疫動物后，能夠有效地激發 機體的特異性體液免疫應答，證實了它們具有良好免疫原性，并且產生的抗血清具有一定 的尿素酶活性抑制作用，并可以避免產生構象表位特異性抗體，增強對幽門螺桿菌感染的 抑制和清除效果，對相應疫苗的研發、致病機理的研究以及臨床診斷中起到很好的推動作 用。同時，本發明的表位產生的抗血清能夠和天然幽門螺桿菌菌株的尿素酶發生反應，表明 本發明的表位可以應用于蛋白表位的病原生物診斷。
權利要求
一種多肽，是如下1)或2)的多肽1)由序列表中序列37所示的氨基酸序列組成的多肽；2)將序列表中序列37的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有幽門螺桿菌尿素酶抗原表位功能的由1)衍生的多肽。
2.權利要求1所述的多肽的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為1)、2)、3)或4)1)序列表中序列28的DNA；2)編碼序列表中序列37的蛋白質序列的多核苷酸；3)在嚴格條件下與1)或2)的基因雜交且編碼權利要求1所述蛋白的基因。4)與序列表中序列28同源性在80%以上并且編碼幽門螺桿菌尿素酶抗原表位功能的 多肽的核苷酸。
4.權利要求1所述的多肽或其編碼基因在制備預防或治療幽門螺桿菌感染的免疫制 劑中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于所述免疫制劑為表位疫苗制劑，優選為多 聯多聚表位疫苗制劑。
6.權利要求1所述的多肽或其編碼基因在制備抑制尿素酶的活性的藥物中的應用。
7.權利要求1所述的多肽或其編碼基因在制備幽門螺桿菌體外檢測試劑中的應用
8.檢測、預防或治療幽門螺桿菌感染的免疫制劑，其活性成分包括權利要求1所述的 多肽。
9.抑制尿素酶的活性的藥物，其活性成分包括權利要求1所述的多肽和/或其抗體。
10.一種篩選權利要求1所述幽門螺桿菌尿素酶B亞基中和性B細胞抗原表位多肽的 方法，主要包括以下步驟(1)將幽門螺桿菌的UreB抗原采用截短法分段構建并進行目的蛋白的表達，通過免疫 印跡分析，初步確定單抗A1H10、B3D9、A3C10所針對的表位范圍；(2)根據上述步驟(1)所確定的幽門螺桿菌尿素酶B亞單位單克隆抗體A1H10、B3D9、 A3C10所針對的抗原表位所在區域，進行第二次和第三次的截短分段構建UreB抗原，將單 抗A1H10、B3D9、A3C10所針對的抗原表位精確定位在UreB特定的位置；(3)化學合成上述步驟(2)鑒定出來的抗原表位，通過間接ELISA法，以進一步確定抗 幽門螺桿菌尿素酶B亞單位單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10所針對的抗原表位。
全文摘要
本發明公開了一種幽門螺桿菌尿素酶B抗原表位多肽及其應用。該抗原表位多肽，其氨基酸序列為序列表中序列37。它的編碼基因序列為序列表中序列28。本發明提供的抗原表位多肽能刺激機體產生抗幽門螺桿菌保護性免疫反應，從而增強對幽門螺桿菌感染的抑制作用，提高機體清除病菌的能力，對相應疫苗的研發、致病機理的研究以及臨床診斷中起到很好的推動作用。
文檔編號C12Q1/04GK101863965SQ20101018225
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月21日 優先權日2010年5月21日
發明者劉純杰, 王艷春, 邱炎, 陶好霞 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所