體外擴增人臍帶胎盤間充質干細胞的方法

專利名稱：：體外擴增人臍帶胎盤間充質干細胞的方法
技術領域：
：本發明涉及一種高效、大規模擴增間充質干細胞的方法，尤其是一種體外擴增人臍帶胎盤間充質干細胞的方法。
背景技術：
：間充質干細胞(MysenchymalStemCell，MSC)作為一種成體干細胞廣泛存在于全身多種組織中，可在體外大量培養擴增，并在特定條件下向內、中、外三個胚層來源的細胞分化。MSC是繼胚胎干細胞和造血干細胞之后的又一科研熱點，已成為二十一世紀治療多種系統疾病的實用型干細胞，它在造血細胞移植、器官移植、骨和軟骨組織修復、心肌梗死和肝臟損傷中具有潛在的應用價值，某些治療措施已經進入臨床試用階段。近年來已逐步應用于心腦血管疾病、肝病、骨和肌肉衰退性疾病、腦及脊髓神經損傷、老年癡呆、系統性紅斑狼瘡和硬皮病等疾病的治療，具有廣泛的臨床應用前景。臍帶是連于胚胎臍部與胎盤間的索狀結構，其中富含造血、間充質、神經及內皮等多種干/祖細胞。與骨髓來源的間充質干細胞相比較，人臍帶胎盤來源間充質干細胞的優勢在于收集過程相對簡單、無創、胎盤屏障使臍帶受病毒與細菌污染少、臍血免疫系統的原始性降低了移植后受體發生排斥反應的機率，在體外培養體系中能快速增殖，傳代后35天能增殖45倍，傳代培養10代以上細胞可增加510倍，且增殖速度無明顯降低，傳代穩定。此外，人臍帶胎盤間充質干細胞不存在倫理學問題、較強的歸巢能力和易于基因轉染等優點使其成為實施細胞治療的理想細胞，并在腫瘤的靶向治療、組織工程和組織修復方面具有骨髓來源的間充質干細胞和其他成體干細胞無可比擬的優越性。目前美國國家食品藥品管(FoodandDrugAdministration,FDA)已經批準間充質干細胞輸注進入II期臨床試驗，以期減輕異基因骨髓移植中的移植物抗宿主反應(GraftversusHostReaction，GVHR)。此外，FDA批準的有關MSC細胞治療的臨床方案包括①MSC靜脈輸注治療Crohn病；②MSC局部應用治療牙周疾病；③MSC靜脈輸注治療心肌梗死；④MSC修復半月板及⑤G-CSF動員的骨髓MSC治療心肌梗塞等。國內的臨床研究中適應證的選擇更為廣泛，利用自體或異體MSC預防或治療GVHD、心肌梗死、骨或軟骨缺損、糖尿病足壞疽、肝臟損傷或股骨頭壞死等，多家單位的研究已經進入臨床試用階段。但是，必須指出的是，有些臨床試驗尚需要充分的理論支持，有關間充質干細胞體外培養體系的標準化以及體內植入存活及分化潛能等，仍需要通過嚴謹的實驗進一步闡明。但由于初始接種細胞成分不同，培養體系組成的差異諸如血清濃度及血清種類以及生長因子的添加與否及添加成分等，這些均可影響最終細胞產品的純度和具體功能。鑒于MSC在細胞治療、基因治療以及組織工程中的應用前景，其大規模、規范化培養和擴增成為應用的關鍵。動物細胞大規模培養技術是利用動物細胞生產基因工程藥物、抗體藥物、疫苗、基因治療藥物等產品的一項關鍵技術，其基礎是細胞培養基。近年來，隨著現代生物制藥技術的快速發展，細胞培養基作為細胞生長的物質基礎，被廣泛應用于細胞生物學科和醫學研究的各個領域。同時，為了實現規模化、產業化，達到精密控制生產過程、降低生產成本、便于下游工作及提高生物制品的質量以及安全性，使得不斷優化細胞培養技術、優化和選擇適宜的細胞培養基顯得尤為重要。目前所報道的臍帶間充質干細胞體外培養條件及培養效率不盡相同，尚缺乏統一標準。而且由于不同來源的間充質干細胞生物學特征尚有一定差異，因此建立人臍帶胎盤間充質干細胞簡便、高效的培養體系十分必要。查閱大量國內外文獻，用于人臍帶胎盤間充質干細胞體外培養的體系包括低糖DMEM、DMEM/F12、間充質干細胞基礎培養基和無血清培養體系。(I)DMEM培養基是為小鼠成纖維細胞設計的，含各種氨基酸、維生素和葡萄糖。最初的配方中葡萄糖含量為1.0g/L(低糖型)，后來為了某些細胞的生長需要，將葡萄糖含量又調整為4.5g/L(高糖型)。高糖型有利于細胞停泊于一個位置生長，適合于高密度懸浮細胞的培養。低糖型適于生長慢、依賴性貼壁細胞的培養。有研究表明目前常用的含10%胎牛血清的低糖DMEM不利于維持間充質干細胞的干細胞特性，在多次傳代后發現其細胞粘附面積變大，鋪展開呈不規則型，增殖能力及分化潛能均降低，細胞老化明顯。(2)DMEM/F12是由DMEM和F12按11混合而成的。其中F12的成分和DMEM有所不同，它與FlO相比含有更多的維生素，肌醇，氨基酸，與DMEM混和后成分更為多樣而均衡，營養成分豐富，且可以使用較少血清，或作為無血清培養基的基礎培養基，適于原代細胞的培養。因此在收獲臍帶間充質干細胞時可以使用DMEM/F12培養液，但不適合其大規模的擴增使用。(3)目前廣泛應用的人MSC培養體系多采用胎牛血清，它含有補體成分，殘存的胎牛血清可能會導致患者的不良反應。在體外培養過程中，細胞的吞噬作用使牛血清中的蛋白分子細胞內在化，即使通過洗滌也不能清除牛血清蛋白，從而干擾治療效果及其評估。為此，有人嘗試應用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清進行人MSC培養，結果發現在無血清體系中，細胞能保持其多向分化特性，增殖速度較傳統體系下更為旺盛，此外，它能增加確定性、減少后期純化和下游加工，提高制品安全性和質量。但是，血清替代品中多含有牛血清白蛋白，它是主要蛋白質成分之一，無血清培養體系雖能保證細胞培養批次及實驗室間的穩定性，仍不能從根本上解決異種蛋白內在化問題。在無血清培養液中，MSC若不添加細胞因子將很難生長，可能與血清誘發MSC增殖與分化相關的胞內Ca2+流動有關。(4)MesenPRORSMedium的基礎培養基及生長因子是專門為人類MSC體外培養所設計的、適合其生長的培養基。包含必需和非必需氨基酸、維生素、有機和無機化合物、激素、生長因子、微量礦物質和胎牛血清。這些輔助物質可幫助細胞的克隆化培養及維持某些特殊細胞系的生長，該培養基緩沖體系為重碳酸鹽，在含體積分數為5%CO2的細胞培養箱中pH值能準確被平衡為7.4，此pH值為MSC生長的最適值。該培養基的配方能夠選擇性的促進正常人類MSC體外培養中的增殖和生長，并為其達到最理想營養平衡狀態提供數量上和質量上的保證。但其配方中現有成份組成比例適于在培養瓶中進行，不能滿足大規模滾瓶培養的需要。目前，國內建立了為數不多的幾家間充質干細胞庫，但是均尚未達到規模化生產。因此建立一種大規模擴增人臍帶胎盤間充質干細胞的方法勢在必行。目前國內用于生物制品大規模生產的培養容器主要是滾瓶(rollerbottle)。滾瓶培養具有結構簡單，投資少，技術成熟，重復性好，與傳統靜止單層培養相比，滾瓶具有以下五大優點(1)旋轉培養可形成的細胞單層面積大，單位面積所需培養基少，便于質量控制；(2)輕微的轉動可以防止培養液中形成的某些成分對細胞生長可能產生的影響，使細胞交替接觸培養液和空氣，利于細胞充分吸收營養和進行代謝；(3)細胞接種在旋轉的滾瓶中，大部分時間僅覆蓋一薄層培養液，滾瓶內保持有相當大的上方空間，以維持合適的氧和PH水平，有利于細胞呼吸和發生氧化還原作用，有利于細胞的生長繁殖；(4)若需增加細胞產量，除可在增加滾瓶的數量和容積外，使滾瓶直徑盡可能小，此時表面面積可因直徑或長度的倍增而成倍增加；(5)微生物污染是大規模細胞培養的主要危險。滾瓶培養在顯微鏡下可直接觀察到細胞的形態，這樣有利于研究形態學的變化，如病毒感染后出現的細胞病理性改變(CPE)，放射線或抗癌藥物引起的細胞形態變化及細胞誘導分化的形態改變等。就大規模培養而言，高接種量就意味著在培養開始前要制備大量的種子細胞，這不僅使操作復雜化，而且細胞的生理狀態和產物表達量也常常會因種子細胞制備過程中的連續傳代擴增而有所下降(即所謂的“代次效應”)。基于上述滾瓶培養特點，可以實現在較低的細胞接種密度條件下獲得較高的細胞產量的目標。目前商業上常見尺寸的滾瓶為850cm2和1750cm2。但是太大尺寸的滾瓶操作起來不是十分方便，而且微生物安全是細胞培養的關鍵環節。因此將滾瓶表面制成帶皺紋的表面或插入多層隔板。以增加表面積。在細胞培養的過程中，包括接種、傳代、收獲細胞或生產細胞制劑，和其它細胞處理，滾瓶培養需要相對高水平的技巧，此外，還需考慮各種影響細胞生長的因素，包括接種參數(例如滾瓶裝置的轉動速度及培養基體積)，培養條件(最初的細胞接種密度，單位面積加入的培養基體積和培養時間)。這些因素限定著在大規模培養條件下細胞的同質性。同時，在大規模的滾瓶培養條件下的細胞需要檢測其特定的表面標志物和細胞周期，這一點在細胞治療中十分必要。綜上所述，應用高效、穩定的培養體系在滾瓶中大規模擴增間充質干細胞是滿足臨床需求的充分且必要條件。
發明內容本發明所要解決的技術問題是，提供一種在滾瓶中高效、大規模體外擴增人臍帶胎盤間充質干細胞的方法。為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是一種體外擴增人臍帶胎盤間充質干細胞的方法，包括臍帶胎盤的機械切割，膠原酶消化，間充質干細胞的分離培養，間充質干細胞的體外擴增，所述間充質干細胞的體外擴增在滾瓶中進行，所用的培養體系為所述培養體系，按體積百分比濃度包括如下成份基礎培養基占82-87%，生長因子占2%,FBS占10-15%，L-谷氨酰胺占0.99%，硫酸慶大霉素占0.01%。所述基礎培養基和生長因子均為MesenPRORSMedium。所述的體外擴增人臍帶胎盤間充質干細胞的方法，具體包括以下步驟1)將檢測合格的臍帶胎盤經過機械切割后，經過II型膠原酶消化為單細胞懸液，洗滌去除膠原酶殘留，將細胞懸液接種于培養瓶或培養板中；2)獲得的原代細胞待24-72小時細胞貼壁后全量更換培養液，2周后增長速度加快，成為形態相對均一的梭形細胞，呈平行排列生長或旋渦狀生長；3)待細胞達到80-90%融合時，經TrypLESelect(GIBCO)傳代1次，按1400-2000個細胞/cm2的密度將細胞接種至滾瓶中，在上述培養體系中體外擴增；4)待細胞達到80-90%融合時，經胰酶消化，將單細胞懸液接種至滾瓶中，經過初期融合和細胞倍增，進行大規模的體外擴增。所述的步驟4)中滾瓶培養系統細胞倍增時間為24_48h。所述的滾瓶培養系統在細胞貼壁前使用的轉數為10-15轉/小時，轉動2-4小時；貼壁后減少轉動速度至5-10轉/小時。所述滾瓶的直徑為275mm，高度120mm，表面積為850cm2。所述滾瓶在接種細胞前不需基質的包被。本發明的有益效果是本發明方法制備的間充質干細胞在5-6天的培養周期中，細胞量可增殖20倍，可得到大量富有活性的間充質干細胞，并能夠長時間保存而不失其活性，且操作簡單易行，并且經過流式細胞儀檢測、細胞周期檢測以及體外分化實驗鑒定，獲得的間充質干細胞純度和細胞活性較高，具有良好增殖潛力，并且使用滾瓶作為擴增介質，結合滾瓶在細胞培養上的優勢_初始接種細胞數量少、單位面積所需培養液少及細胞在滾瓶中良好的生長增殖能力，可快速建立細胞庫，成本低廉，可直接用于科學實驗研究和臨床上的輔助治療，富有應用前景。圖1是原代細胞貼壁前、后及傳代1次(Pl)后的細胞形態。其中，A為原代細胞貼壁前的形態，B為貼壁后的形態，C為原代細胞經過1次傳代后的形態。圖2為本發明在最佳滾瓶培養條件下大規模擴增的人臍帶胎盤間充質干細胞。A為MesenPRORSMedium培養的細胞經過胰酶消化后，細胞可以完全貼壁且細胞倍增時間較短；B為MesenPRORSMedium培養的細胞初期融合時間短，單位面積下細胞密度較高。圖3為本發明在最佳滾瓶培養體系中擴增的間充質干細胞(P4)的形態及免疫表型檢測和細胞周期檢測。其中，A為在擴增介質滾瓶中獲得的形態均一、平行排列生長或旋渦狀生長的梭形間充質干細胞；B為免疫表型檢測，陽性標記物的表達均在99%以上，陰性標記物的表達均在以下，表明所擴增的細胞為純度較高的間充質干細胞；C為細胞周期檢測，處于G0/G1期的細胞在94%以上，表明其具有強大的增殖潛能。圖4為本發明經過最佳滾瓶培養體系中擴增的間充質干細胞與75cm2培養瓶在細胞產量上的差異。其中，1表示為75cm2培養瓶，2表示為850cm2滾瓶；A為1瓶75cm2培養瓶和1瓶850cm2滾瓶收獲的細胞數量的對比；B為75cm2培養瓶和850cm2滾瓶在相同的生長表面積條件下收獲的細胞數量的對比。具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步的說明，但本發明并不受限于下述實施例。實施例1人臍帶胎盤間充質干細胞的制備經產婦知情同意，采集足月剖宮產健康胎兒臍帶或胎盤。臍帶或胎盤采集之前產婦需做艾滋病病毒抗體、乙型肝炎病毒抗體、丙型肝炎病毒抗體、梅毒螺旋體抗體、谷丙轉氨酶、支原體等檢測，全部合格以確保安全性后方可采集。1、臍帶或胎盤自手術臺取下后，浸入含抗生素的0.9%生理鹽水中，4°C保存；2、在操凈臺內取出臍帶或胎盤，用D-PBS沖洗凈表面殘余血液；3、將臍帶或胎盤剪成Imm3大小的組織塊后放入200mL藍蓋試劑瓶，加入質量/體積比為0.1%的II型膠原酶30mL，置于恒溫振蕩儀內持續消化6h；4、100目篩網過濾收集細胞；5、加入D-Hank’s液沖洗細胞3次，用含體積分數為10%胎牛血清的DMEM/F12重懸細胞，調整細胞密度為(4.8XIO31XIO4)/cm2,接種于6孔板內，于37°C、體積分數為5%的CO2孵箱內培養，24-72h后換液，圖1。實施例2MesenPRORSMedium培養體系的優化作為人臍帶胎盤間充質干細胞體外培養的最佳培養體系MesenPRORSMedium,考慮到以下因素，我們在原有培養基的基礎上補加終濃度10%-15%FBS、2mML-谷氨酰胺及硫酸慶大霉素(1)胎牛血清含有豐富的細胞生長所必要的營養成分。它在細胞接種后的作用大致有以下幾點。①保護細胞免受損傷；②促進細胞黏附；③促進細胞增殖多種生長因子，尤其血小板促生長因子能促進細胞分裂，是主要的促進細胞增殖因子。另外，血清中的胰島素，能促進細胞攝取葡萄糖和氨基酸，與促細胞分裂有關；類胰島素生長因子，能與細胞表達的胰島素受體結合，從而具有與胰島素相同的作用；促生長激素，具有細胞增殖的效應。胎牛血清中的氫化可的松，可能兼有促細胞貼附和增殖并誘導其分化作用。(2)L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的，脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源，參與蛋白質的合成和核酸代謝；(3)體外培養細胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養成功或失敗的首要條件。在一切操作中最大可能地保證無菌的條件下，仍然需要補加一定量的硫酸慶大霉素。因此，作為優化，MesenPRORSMedium補加FBS至終濃度10-15%，L-谷氨酰胺(200mM)至終濃度2mM(0.99%)，硫酸慶大霉素(4萬U/ml)至終濃度80U/ml(0.01%)，所述濃度為體積百分比濃度。我們將原有的MesenPRORSMedium和經過優化的MesenPRORSMedium進行體外生長對比實驗1)將待原代培養的臍帶胎盤間充質干細胞貼壁并傳代1次(Pl)后，在6孔板中進行培養體系的生長對比實驗；2)采用連續適應法使細胞由原代培養時使用的DMEM/F12分別逐步過渡到MesenPRORSMedium和優化的MesenPRORSMedium培養體系，即用含體積分數為10%胎牛血清的DMEM/F12培養基和相應的上述兩種培養基按11(νν)混合培養細胞，通過下列混合培養基的方式，連續幾代減少當前培養基的量，即12，14,116和100%替代培養基，每次適應改變培養體系時，傳代細胞一兩次。3)細胞形態學觀察和細胞倍增時間測定結果發現經過優化的MesenPRORSMedium培養的細胞僅需較短的初期融合時間和細胞倍增時間，在5-6天的培養周期中，細胞量可增殖20倍，可得到大量富有活性的臍帶胎盤間充質干細胞，并能夠長時間保存而不失其活性，且具有較強的克隆形成能力，更適于人臍帶胎盤間充質干細胞的體外擴增。實施例3在最佳滾瓶培養條件下大規模擴增人臍帶胎盤間充質干細胞1、使用MesenPRORSMedium培養體系培養的間充質干細胞待細胞密度達到80%-90%時，胰酶消化，制備單細胞懸液；2、將懸液接種于表面積為850cm2的滾瓶中，細胞總數為1XIO6(1400個細胞/cm2)，加入MesenPRORSMedium培養液至100ml，垂直晃動懸液后再水平緩慢轉動滾瓶1周，目的是使細胞平均分布于滾瓶，然后將滾瓶放置于INCUDRIVED-ICO2培養箱轉動系統，為了使最佳溫度穩定，盡可能使滾瓶位于培養箱后方，在4個位置上以較寬的軸向距離驅動；3、在37°C下，以12轉/小時，轉動2小時，使細胞均勻貼壁，見圖2A；4、減少轉動速度至5轉/小時并連續培養；5,2-3天后即可達到90%融合，見圖2B，加入IOml胰酶后將滾瓶放回上述轉動系統，待轉動1周后即可取出，加入20ml10%FBS的培養液終止消化；6、離心后棄上清，加入MesenPRORSMedium培養液繼續培養，即轉入擴大再培養。由于間充質干細胞對生長環境的改變較為敏感，細胞容易成團，因此，為維持細胞正常均勻生長，我們在操作過程中，使細胞均勻分散貼壁、維持穩定的溫度、酸堿度和適當的轉動速度。對于按照本發明上述方法制備的間充質干細胞，按照“國際細胞療法協會”(ISCT)制定的標準進行生物學表型鑒定，表現出以下技術特征1)在最佳培養體系條件下細胞貼壁生長，可形成CFU-F集落，形態相對均一，呈平行排列生長或旋渦狀生長的梭形細胞；2)表達粘附分子受體標記物⑶29、⑶44，間質細胞標記⑶73、⑶105，干細胞標記物⑶90；而不表達內皮細胞標記物⑶31和造血干細胞標志⑶34，也不表達HLA-DR；3)體外可誘導分化為成骨細胞、肝系細胞及心肌細胞。實施例4在最佳滾瓶培養條件下擴增的人臍帶胎盤間充質干細胞的細胞特征1、細胞形態學觀察MesenPRORSMedium培養的間充質干細胞連接緊密，可形成CFU-F集落，形態相對均一，呈平行排列生長或旋渦狀生長的梭形細胞，見圖3A。2、細胞倍增時間測定細胞倍增時間是指有增殖能力的細胞通過有絲分裂使細胞增加一倍所需要的時間。體外傳代培養細胞的倍增時間可以通過測量計算而得。細胞倍增時間因細胞種類而異，對同種細胞而言其倍增時間是相對恒定的。因而細胞倍增時間直接反映細胞增殖的快慢，當環境因素使細胞倍增時間發生改變時，則意味著細胞周期進程發生了改變。因此，細胞倍增時間也是觀察細胞周期進程變化的重要參數。況且，此參數的測定簡而易行，更有實際意義。將第2-8代細胞以相同的細胞密度(1400個細胞/cm2)接種于滾瓶中，待細胞貼壁后加入上述三種培養體系。每隔24h用胰酶消化1個滾瓶，收集細胞計數。用Patterson公式計算對數生長期細胞倍增時間，(Td=tX[lg2/lg(Nt/No)])，t為細胞數由No增至Nt所用時間(h)，No為首次記下的細胞數，Nt為t時間后的細胞數。一般No在接種細胞24小時后進行。應用該公式我們計算出臍帶胎盤來源的間充質干細胞在MesenPRORSMedium中的細胞倍增時間為42小時。綜上所述，使用MesenPRORSMedium培養的間充質干細胞僅需較短的初期融合時間和細胞倍增時間，且具有較強的克隆形成能力，更適于臍帶胎盤間充質干細胞的體外擴增。無論從細胞培養角度還是從產業化角度看，MesenPRORSMedium是理想的培養體系。3、免疫表型檢測CD29，CD44,CD73,CD90,CD105,CD31,CD34,HLA-DR(見表1)。將第4-7代人臍帶胎盤來源的間充質干細胞接種于滾瓶中，待細胞達到80-90%融合時使用IOml胰酶消化，瓶子以12轉/小時在滾動系統上轉動1周后停止消化，向瓶中加入20-30ml含10%FBS的培養基，將細胞懸液轉入50ml離心管中并以IOOOrpm離心3分鐘。離心之后，棄掉上清，PBS洗滌2次，分成每管1XIO6細胞，第一管為空白對照(只含間充質干細胞)，用于調節流式細胞儀的電壓，第二管加入同型對照抗體(PE-MOUSEIgGl/FITC-MOUSEIgGl/APC-MouseIgGlκ)10μ1，其余管中加入其它相應抗體10μ1，混勻，4°C避光孵育30分鐘，PBS洗滌1次，離心后棄上清，加入500μ1PBS重懸，混勻，即可上機(流式細胞儀FACSAria，BD公司)檢測，見圖3B。細胞免疫表型為⑶29，⑶44，，⑶73，⑶90，⑶105為陽性標記，⑶31，⑶34，HLA-DR為陰性標記(見表2)。表1本發明優選檢測人臍帶胎盤間充質干細胞的表面標志物序號物品名稱標記Cat.No.數量來源1PEMouseAnti-HumanCD29陽性MCA1949PET25TESTSserotec2APCMouseAnti-HumanCD44陽性559942IOOtestsBD公司3PEMouseAnti-HumanCD73陽性550257IOOtestsBD公司4FITCanti-humanCD90陽性MCA90FT25μgserotec5PElabeledanti-humanCD105陽性MCA1557PET25TESTSserotec6FITClabeledanti-humanCD31陰性MCA1738FT25μgserotec7APCMouseAnti-HumanCD34陰性555824IOOtestsBD公司FITClabeledanti-humanKA陰性MCA71FImlserotec8DR9MOUSEIgGl:RPE同型對照MCA928PE100TESTSserotec10MOUSEIgGl=FITC同型對照MCA928F100TESTSserotec11APC-MouseIgGlK同型對照555751IOOtestsBD公司表2人臍帶胎盤間充質干細胞表面標志物的檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>4、細胞周期檢測消化體外擴增的第5代間充質干細胞，離心棄上清后，300μ1PBS制備1XIO6細胞懸液，逐滴加入_20°C冰預冷的700μ1無水乙醇，漩渦振蕩儀上混懸，4°C固定1-2小時，離心棄上清后，加入500μ1PBS(含50ug/mL碘化丙啶溶液，100ug/mLRNaseA)，室溫避光孵育30分鐘，離心棄上清后PBS洗滌1次，500μ1PBS重懸，混勻，即可上機檢測。流式細胞儀檢測細胞周期顯示，第4代細胞中約有94%處于G0/G1期，結果表明，體外培養的間充質干細胞具有干細胞的生長特征，大部分細胞處于靜止期，見圖3C。5、細胞的成骨及成心肌分化潛能及分化后鑒定消化體外擴增的第4-6代間充質干細胞，以5ΧIO4細胞總數接種于6孔板中，每孔加2ml上述MesenPRORSMedium培養液。在細胞達到60%-80%融合時，更換相應的誘導分化培養基。5.1成骨誘導分化誘導分化培養基為含有lOOnmol/L的地塞米松，IOmmol/L的β-甘油磷酸鈉，50μmol/L維生素C和10%FBS的DMEM/F12培養液，每隔2天換液1次，培養21天，PBS洗滌細胞1次，70%乙醇固定10分鐘，行堿性磷酸酶定性檢測、茜素紅染色、丨型膠原的免疫熒光檢測、四環素熒光檢測及VonKossa染色，鑒定鈣結節的產生。顯微鏡下觀察，堿性磷酸酶染色及茜素紅染色可見細胞漿中有大量的鈣沉積，丨型膠原和四環素的熒光檢測可見在形成鈣結節的位置有紅色熒光信號，VonKossa染色可見黑色礦化物沉積。5.2成心肌誘導分化誘導分化培養基為含有10μmol/L的5_氮胞苷和10%FBS的DMEM/F12培養液，加入誘導液24小時后，立即更換為10%FBS的DMEM/F12培養液，以后每隔2天換液1次，培養8周。提取細胞的RNA，進行real-timePCR檢測人心肌轉錄因子GATA4和NKX2.5，心肌肌漿網鈣ATP酶，肌鈣蛋白I，α-橫紋肌肌動蛋白的表達。結果表明這些基因均有一定程度的表達。綜上所述，本發明的內容并不局限在上述的實施例中，相同領域內的有識之士可以在本發明的技術指導思想之內可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發明的范圍之內。權利要求一種體外擴增人臍帶胎盤間充質干細胞的方法，包括臍帶胎盤的機械切割，膠原酶消化，間充質干細胞的分離培養，間充質干細胞的體外擴增，其特征在于，所述間充質干細胞的體外擴增在滾瓶中進行，所用的培養體系為所述培養體系，按體積百分比濃度包括如下成份基礎培養基占82-87％，生長因子占2％，FBS占10-15％，L-谷氨酰胺占0.99％，硫酸慶大霉素占0.01％。2.根據權利要求1所述的體外擴增人臍帶胎盤間充質干細胞的方法，其特征在于，所述基礎培養基和生長因子均為MesenPRORSMedium。3.根據權利要求2所述的體外擴增人臍帶胎盤間充質干細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟1)將檢測合格的臍帶胎盤經過機械切割后，經過II型膠原酶消化為單細胞懸液，洗滌去除膠原酶殘留，將細胞懸液接種于培養瓶或培養板中；2)獲得的原代細胞待24-72小時細胞貼壁后全量更換培養液，2周后增長速度加快，成為形態相對均一的梭形細胞，呈平行排列生長或旋渦狀生長；3)待細胞達到80-90%融合時，經TrypLESelect(GIBCO)傳代1次，按1400-2000個細胞/cm2的密度將細胞接種至滾瓶中，在上述培養體系中體外擴增；4)待細胞達到80-90%融合時，經胰酶消化，將單細胞懸液接種至滾瓶中，經過初期融合和細胞倍增，進行大規模的體外擴增。4.根據權利要求3所述的體外擴增人臍帶胎盤間充質干細胞的方法，其特征在于，所述的步驟4)中滾瓶培養系統細胞倍增時間為24-48h。5.根據權利要求3所述的體外擴增人臍帶胎盤間充質干細胞的方法，其特征在于，所述的滾瓶培養系統在細胞貼壁前使用的轉數為10-15轉/小時，轉動2-4小時；貼壁后減少轉動速度至5-10轉/小時。6.根據權利要求3所述的體外擴增人臍帶胎盤間充質干細胞的方法，其特征在于，所述滾瓶的直徑為275mm，高度120mm，表面積為850cm2。7.根據權利要求3所述的體外擴增人臍帶胎盤間充質干細胞的方法，其特征在于，所述滾瓶在接種細胞前不需基質的包被。全文摘要本發明公開了一種體外擴增人臍帶胎盤間充質干細胞的方法，采用人臍帶胎盤作為細胞來源，利用II型膠原酶消化組織，離心，棄去上清液，用D-Hank’s液洗滌3次后，即獲得單細胞懸液，接種于培養板或培養瓶中，24-72小時細胞(P0)貼壁后全量換液，待細胞達到80％-90％融合時傳代1次(P1)，然后按最低1400個細胞/cm2的密度將細胞接種至滾瓶中，對比不同培養體系間充質干細胞的生長狀態、細胞倍增時間和成集落能力，獲得了高效、穩定的擴增培養體系，并利用該最佳擴增體系在滾瓶中大規模擴增間充質干細胞。文檔編號C12N5/0775GK101831403SQ20101017827公開日2010年9月15日申請日期2010年5月21日優先權日2010年5月21日發明者劉劍,李林芳,洪敬欣,錢其軍,韓俊領申請人:協和干細胞基因工程有限公司;上海東方肝膽外科醫院