專利名稱：一種abo血型基因分型的pcr-sbt方法及試劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因分型檢測方法，尤其涉及一種用于ABO血型基因分型的分子生物 學檢測方法，本發明還涉及該方法所應用的試劑。
背景技術：
人類ABO基因位于9號染色體(9q34. 1 34. 2)，由A、B和0三個復等位基因控制， 包含長度大小從28 688bp不等的7個外顯子和長度約為19514bp的6個內含子，總長大 約為18 20kb。其基因編碼產物是糖基轉移酶，多數編碼序列(1062bp中823bp)位于第6 和第7外顯子上，負責編碼糖基轉移酶的催化區域。這些轉移酶控制ABO血型抗原的生物合 成，從而決定其血型。ABO血型的其它等位基因DNA序列高度保守，與AlOl的DNA序列緊密 相關，僅有幾個堿基替換或單個堿基缺失。對漢族人群中ABO血型進行頻率調查發現，主要 為A102、B101、001、002這幾種等位基因。A102等位基因與AlOl等位基因相比只是在467位 的單個堿基替換(C/T，Pro/Leu)，兩者翻譯的糖基轉移酶活力沒有顯著性差異。BlOl基因僅 在297、526、657、703、796、803、930和1096位堿基8個位置與AlOl有改變，導致糖基轉移酶 多肽鏈上有 4 個氨基酸替代C526G(Arg/Gly)、G703A(Gly/Ser)、C796A (Leu/Met)、G803C(Gly/ Ala)。001等位基因與AlOl的差異是第261位核苷酸G缺失，引起了閱讀框移動，在351至 354位置產生終止密碼子，肽鏈合成在117位氨基酸終止，產生一條無催化能力的短肽鏈。除 此之外，人群中還存在大量的亞型和罕見基因型，通常也是由于單個核苷酸變異形成的。現有技術中，人類ABO血型檢測方法主要有兩種一是經典的血清學方法，二是基因分 型方法。血清學方法具有簡單實用等特點，但也存在一定的局限性，首先需要新鮮紅細胞樣品，對 樣本要求較高；其次方法檢測的范圍較窄，只能對ABO血型中的常見血型進行定型，對于一些亞 型標本以及罕見樣本，在血型檢測時易出現正反定型不符，難以定型或定型錯誤的現象，且不能 確定其具體基因型。基因分型的方法在某種程度上彌補了經典血清學方法在這方面的不足。目前的ABO血型基因分型最主要的方法是PCR-SSP(PCR_序列特異性引物)，但該 方法需要進行多管擴增，需有進一步改進的基因掃描技術可進行單一管擴增。并且PCR-SSP 方法在設計引物時只能針對某些具有區別性的特異性位點進行設計，因此只能對常規的 ABO血型進行基因分型，對于一些特殊的亞型或存在的新突變位點則難以明確。而ABO血型 PCR-SBT(PCR-Sequence based typing，基于PCR測序的分型技術)分型方法可以克服前兩 者的上述缺陷和局限性。但現階段的ABO血型PCR-SBT分型方法主要針對多態性位點比較 集中的6、7號外顯子的測定來確定其基因型，而對第1-5號外顯子不進行測序，尤其是含有 起始密碼子的1號外顯子，其GC含量比較高，PCR擴增較難獲得，這種操作方法存在兩個缺 陷第一，由于6、7號外顯子單核苷酸多態性非常集中，而各個ABO血型之間的差異可能僅 有單個或幾個核苷酸的變異所引起，容易造成SNP位點(單核苷酸多態性位點)的漏檢，引 起血型基因型的誤判。第二，第1-5號外顯子以及所包含的內含子中同樣存在大量的基因 信息，對確定樣本基因型和解決ABO血型相關問題具有重要的意義。發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種用于AB。血型分型的PCR—SBT方法，以克服現有血型分型技術中的上述缺陷。為此，本發明采用以下技術方案
它包括下述步驟
(1)制備人基因組])NA；
(2)設計擴增引物，用聚合酶鏈反應分別擴增人基因組])NA中AB。基因外顯子l1外顯子2—41外顯子5—7的三個片段，其中l號外顯子采用含GC緩沖液的PCR擴增；
(3)將步驟(2)得到的擴增產物進行雙酶切純化；
(4)設計測序引物，將步驟(3)得到的純化產物進行測序PCR反應；
(5)將步驟(4)得到的測序產物進行醋酸鈉一乙醇沉淀法純化，進行毛細管電泳測序；
(6)將步驟(5)獲得的序列通過軟件分析，確定其基因型。
本發明另一個所要解決的技術問題是提供上述方法所用的試劑。為此，本發明采用以下技術方案它包括3對寡核苷酸擴增引物和18條寡核苷酸測序引物，所述3對寡核苷酸擴增引物分別擴增AB。血型基因的l號外顯子12—4號外顯子以及5—7號外顯子，所述18條寡核苷酸測序引物用于測序分析。
所述3對寡核苷酸擴增引物序列如下
l號外顯子擴增引物
Ml 3一E lF5’一GTAAAA(GACGGCCAGGCCGTCCCTTCCTAGCAG一3’
M13一ElR5’一CAG(；AAA(AGCTATGACCGAGGAGAGGCTGGAGAC一3’
2—4號外顯子擴增引物
E24F25’一GAGGGTGAGTGATGTGATT一3’
E24Rl5’一ACTGG(2AA(；AGGGACTAA(一3’
5—7號外顯子擴增引物
E57F5’一CTGCTAAAA(CAAGGGCG一3’
E7R5’一CTGCCCACAGT(3AATTGAGA一3’
所述18條寡核苷酸測序引物序列如下
外顯子l片段的測序引物
Ml 3F5’一GTAAAA(GACGGCCA一3’
Ml 3R5’一CAG(}AAA(AGCTATGAC一3’
外顯子2—4片段的測序引物
5 18F5’ 一aCCaCCCtCCtgCCCaCC一3’
252]F’5’一aCagaaggtCCCagaaCCaaga一3’
l 7 lF5’一gggtCaCCtggataCCtCtgg一3’
682]F’5’一CCtCtgttgggaCCaCtCttg一3’
306]F’5’一atCgCCaCagtgatggttgt七一3’
44lF5’一CCtggg(tCaagtgattCtCC一3’
955]F’5’一ttttatgtCgggctCaaatCaC一3’
外顯子5—7片段的測序引物
工6F5’一GTTCCCGCAGGTCC；AATGT一3’
I6R 5' -GCTGCATGAATGACCTTTCC-3’E7F 5' -TCTGCTGCTCTRAGCCTTCC-3，51R 5 ’ -AAACCAACCAGAGGCAAATG-3’5IF 5' -CCTGTCCCTTTGTTCTCCAA-3’6IF1 :5’ -GGGTAGAGACCCAGGCAGTG-3，6IR1 :5’ -CTCTGCACCCTAGAGCTTCC-3’6IF2 :5， -CCCAGACACCAAAGGAAGTG-3，6IR2 :5’ -CCACCATGAAGTGCTTCTCC-3’本發明中引物設計是PCR擴增的關鍵，有關引物設計的方法和軟件均可從英特網 上免費獲得。本發明所設計的寡核苷酸引物是根據Genebank(序列號AC000397)中人類 ABO血型基因序列中包括多態性位點在內的連續寡核苷酸序列而設計獲得的。所有引物的 設計均避開突變位點，以免因位點的漏檢而導致分型的錯誤。本發明以一對寡核苷酸引物 可以擴增包含幾個外顯子的長片段，使其簡化為3對擴增引物即可保證包含所有外顯子的 有效擴增。1號外顯子含有大量GC堿基，較難獲得有效擴增，同時與其他外顯子之間隔有一 段長片斷內含子，因此將其單獨作為一個片段，利用GC緩沖液，保證其有效擴增。5-7號外 顯子含有較多突變位點，同時考慮擴增片段長度及擴增效果，將此3個外顯子合并成一個 片段擴增。余下的外顯子作為單獨的一個片段擴增。擴增引物的設計避開了 ABO血型抗原 編碼序列的多態性位點，避免了任何突變點的漏檢從而導致的基因型誤判。測序引物的設 計能保證清晰準確測得所擴增片段的全長序列，對部分序列進行雙向測序，從而將樣本進 行精確的基因分型。其中所述1號外顯子擴增引物在其5'包含一段M13通用引物，以保證 GC含量較高的1號外顯子能有效地獲得清晰的測序電泳圖譜。本發明通過對ABO血型所有外顯子進行全長序列測序，獲得ABO血型相關外顯子 的全長和部分內含子寡核苷酸序列，精確地對其基因進行分型。隨著DNA序列分析儀的普 及，PCR-SBT技術廣泛應用于臨床檢測，如藥物相關的乙肝病毒變異測序、骨髓移植的HLA 高分辨測序分型等。高通量獲得的所有ABO血型編碼序列精確信息在基因定型，基因多態 性檢測，基因頻率調查分析等方面的應用受到廣泛重視。本發明所提供的試劑和方法可作為一種獨立的、應用廣泛的鑒定方法，解決了 ABO亞型 的鑒定、疑難血型的判定、新突變位點的發現、基因之間的重組現象、基因多態性檢測等問題，發 揮PCR-SBT對ABO基因定型操作高通量，結果精確的特點，在臨床輸血醫學研究和遺傳學等領域的 相關應用受到高度重視，對于醫學研究單位、藥學研究和試劑開發單位具有重要的現實意義。
圖1為本發明中檢測樣本的外顯子1 (El)、外顯子2-4(E2_4)、外顯子5_7 (E5_7) 三個片段的PCR擴增電泳圖譜，M為DNA Marker (DL2000, TaKaRa)。圖2為本發明中對3例檢測樣本中的樣本1 (A102/B101)的1_7號外顯子的全部 測序電泳圖譜。圖3為本發明中對3例檢測樣本中的樣本2(B(A)02/B101)的1_7號外顯子的全 部測序電泳圖譜。圖4為本發明中對3例檢測樣本中的樣本3 (B (A) 02/001)的1_7號外顯子的全部測序電泳圖譜。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明內容作進一步詳細說明。實施例一般用抗A和抗B試劑來測定紅細胞上是否有A抗原和B抗原，確定ABO血型稱為正 定型；用已知有A和B抗原的紅細胞對血清定型，稱為反定型。正反定型相符，才能避免ABO血 型的誤定。即試驗中紅細胞有A、B抗原，血清中無A、B抗體，可完全確信這次定型AB型是正確 的。正反定型不符即正定型和反定型的結果不一致，不能確定其正確的血型。本實施例中樣本 正反定型不符即提示紅細胞表達A、B抗原，其血清中有抗Al抗體，因此不能定義其血型。本實施例具體以對一例正反定型符合和兩例正反定型不符個體進行ABO血型定 型為例對本發明內容做詳細說明，本發明所采用的一種ABO血型基因分型的PCR-SBT方法 具體包括以下步驟1、制備人基因組DNA，作為后續步驟的PCR擴增模板。取待檢全血200μ 1，按照invitrogen DNA isolation試劑盒說明書提取基因組 DNA，利用分光光度計測定基因組濃度和純度。2、合成3對擴增引物和18條測序引物，具體序列見前述發明內容中的序列，不再贅述。將擴增弓丨物用純水稀釋至25 μ M ；準備La-Taq酶(Lot :CK4501，TaKaRa)、10 X緩沖液 (Lot :CK4501, TaKaRa)、2XGC buffer I (Lot :A2801A，TaKaRa)、dNTP(Lot :CBG4301A，TaKaRa)、純 水，與步驟1所制備的PCR擴增模板按表1、表2和表3所述體系配制PCR擴增體系表1 步驟2中1號外顯子PCR擴增體系 表2 步驟2中2-4號外顯子PCR擴增體系 表3 步驟2中5-7號外顯子PCR擴增體系 用PCR儀(ABI9700)分別按以下程序擴增1號外顯子擴增94°C預變性lmin，DNA雙鏈充分解開；94°C變性30s，67. 5°C退火 30s，引物結合到模板上，72°C延伸35s，延長所需擴增片段，反應35個循環；72°C，IOmin,擴 增片段充分延伸；2-4號外顯子擴增94°C預變性5min，DNA雙鏈充分解開；94°C變性30s，61°C退火 30s,引物結合到模板上，72°C延伸5min，延長所需擴增片段，反應35個循環；72°C，lOmin， 擴增片段充分延伸；5-7號外顯子擴增94°C預變性5min，DNA雙鏈充分解開；94°C變性30s，63. 8°C退 火30s，引物結合到模板上，72°C延伸3min30s，延長所需擴增片段，反應35個循環；72°C， lOmin，擴增片段充分延伸。3、擴增產物的雙酶切純化。檢測樣本所擴增的3個片段各取2 μ 1 PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，如圖1所示， 確定擴增片段的特異性。在剩余的PCR產物中分別加入蝦堿性磷酸酶(SAP，IU/μ 1，Lot M820A, Promega)和核酸外切酶 I (Exo-I，5U/μ l，Lot :CK11011Β，TaKaRa)，利用蝦堿性磷酸 酶(SAP)的DNA 5'端去磷酸化功能以及核酸外切酶I (Exo-I)的單鏈特異性3' -5'核 酸外切酶功能，進行擴增產物純化。在25 μ 1擴增產物體系中加入SAP 2μ 1和Exo-I 1μ 1, 37°C 30min酶切反應，80°C 15min酶失活。4、對PCR產物進行測序PCR。將步驟3中純化之后的PCR產物中加入25 μ 1純水稀釋，混勻。測序引物用純水 稀釋至 1. 6 μ Μ，以 BigDye terminator v3. 1 sequencing kit (美國 ABI 公司)試劑按照表 3配制反應體系表3 步驟4中PCR產物的PCR測序體系
反應體系體積(μ )5 X緩沖液1. 6BigDye mix0. 8測序引物1DNA2H204. 6總體積10 三個樣本以所擴增純化的片段為模板，分別進行18個反應，用PCR儀(ABI9700) 按以下程序擴增96°C預變性lmin，DNA雙鏈充分解開；96°C變性10s，50°C退火5s，測序引物結合到DNA模板上，60°C延伸4min，延長擴增片段，25個循環。測序引物濃度為1.6μΜ， 稀釋的上述純化后DNA模板2 μ 1。5、測序擴增PCR產物直接用醋酸鈉/乙醇純化法進行純化。將步驟4中測序擴增PCR產物直接用醋酸鈉/乙醇純化法進行純化。直接在PCR 產物中加入Ιμ EDTA (1.25 μ Μ)和25 μ 1醋酸鈉(3Μ)/無水乙醇(1 40)混合液，混勻， 3000g離心30min ；去除上清，加入75%乙醇，3000g離心lOmin，去除上清，酒精揮發后加入 10 μ 1甲酰胺溶解，95°C變性3min，迅速在冰上冷卻。6、將制備好的產物在ABI 3730測序儀上進行48孔毛細管高通量電泳測序，所測 序結果利用SeqScape V2. 5軟件進行序列比對，按照Blood Group Antigen Gene Mutation Database(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/projects/gv/mhc/xslcgi. cgi ？ cmd = bgmut/ systems)數據庫序列確定ABO血型的基因型。如圖2、3、4所示，圖2的樣本1為正反定型符合的正常AB血型基因型結果，圖3的 樣本2和圖4的樣本3為兩例正反定型不符個體AB血型基因型結果，即用血清學方法難以 判斷其血型的疑難血型。3730測序儀毛細管電泳圖譜分析結果顯示，樣本1基因為261G/G、 297A/G(R)、467C/T(Y)、526C/G(S)、657C/T(Y)、700C/C、703A/G(R)、796A/C(M)、803G/C(S)、 930A/G(R)，基因型定為 A102/B101。樣本 2 基因為 261G/G、297G/G、526G/G、657T/T、700C/ G(S)、703A/A、796A/A、803C/C、930A/A，基因型定為 B(A)02/B101。樣本 3 基因為 261G/del、 297A/G(R)、526C/G(S)、657C/T(Y)、700C/G(S)、703A/G(R)、796A/C(M)、803G/C(S)、930A/ G (R)，基因型定為B (A) 02/001。其中前面的數字代表堿基序列位置，括號中字母代表所對應 雜合堿基的縮寫。樣本1表現為正反定型符合的正常AB型。樣本2和樣本3的表現為正 反定型不符的A2B。AB型可分為AlB和A2B兩種亞型，本實施例中此兩例正反定型不符樣 本所表現的A2B型屬于一種罕見亞型，可引起正反定型不符，難以判斷其正確的血型，而大 部分人群表現為普通AlB型。對三例樣本的測序圖譜比較分析，B (A) 02等位基因700位堿 基為G，703位堿基為A ；A102.001基因700位堿基為C，703位堿基為G ；BlOl基因700位堿 基為C，703位堿基為A，可見其700位G是其特征堿基，作為罕見基因B (A) 02的一個標志。 本實施例將疑難血型準確的加以定型。所以，采用本發明提供的ABO血型基因分型的PCR-SBT方法可以通過對ABO血型 所有外顯子進行全長序列測序，獲得ABO血型相關外顯子的全長和部分內含子寡核苷酸序 列，可以精確地對其基因型進行分型，從而解決了 ABO亞型的鑒定、疑難血型的判定、新突 變位點的發現、基因之間的重組現象、基因多態性檢測等問題，可發揮PCR-SBT對ABO基因 定型操作高通量，結果精確的特點，在臨床輸血醫學研究和遺傳學等領域的相關應用受到 高度重視，對于醫學研究單位、藥學研究和試劑開發單位具有重要的現實意義。
權利要求
一種ABO血型基因分型的PCR SBT方法，其特征在于它包括以下步驟(1)制備基因組DNA；(2)設計擴增引物，用聚合酶鏈反應分別擴增人基因組DNA中ABO基因外顯子1、外顯子2 4、外顯子5 7的三個片段，其中1號外顯子采用含GC緩沖液的PCR擴增；(3)將步驟(2)得到的擴增產物進行雙酶切純化；(4)設計測序引物，將步驟(3)得到的純化產物進行測序PCR反應；(5)將步驟(4)得到的測序產物進行醋酸鈉 乙醇沉淀法純化，進行毛細管電泳測序；(6)將步驟(5)獲得的序列通過軟件分析，確定其基因型。
2.如權利要求1所述的一種ABO血型基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于所述步驟 (2)中，三個片段擴增的反應體系和反應程序如下其特征在于步驟(2)中，外顯子 1 擴增體系，以 25μ 1 計，包括2XGC buffer I 12. 5 μ 1,2. 5mM dNTP 2μ1、每 條引物終濃度均為0. 5ymol/L、La-Taq DNA聚合酶1. OUUOOng/μ 1 DNA模板2. 5 μ 1，余 量以純水補足；外顯子2-4擴增體系，以25 μ 1計，包括10XPCR緩沖液2. 5 μ 1，2. 5mM dNTP 2μ1，每 條引物終濃度均為 0. 5 μ mol/L, Mg2+ 終濃度 2. Ommo 1/L, La-Taq DNA 聚合酶 1. 0U, IOOng/ μ 1 DNA模板2. 5 μ 1，余量以純水補足；外顯子5-7擴增體系，以25 μ 1計，包括10XPCR緩沖液2. 5 μ 1，2. 5mM dNTP 2μ1，每 條引物終濃度均為 0. 5 μ mol/L, Mg2+ 終濃度 2. Ommo 1/L, La-Taq DNA 聚合酶 1. 0U, IOOng/ μ 1 DNA模板2. 5 μ 1，余量以純水補足；擴增程序為1號外顯子擴增94°C預變性lmin，DNA雙鏈充分解開；94°C變性30s，67. 5°C退火30s， 引物結合到模板上，72°C延伸35s，延長所需擴增片段，反應35個循環；72°C，IOmin,擴增片 段充分延伸；2-4號外顯子擴增94°C預變性5min，DNA雙鏈充分解開；94°C變性30s，61°C退火30s， 引物結合到模板上，72°C延伸5min，延長所需擴增片段，反應35個循環；72°C，lOmin，擴增 片段充分延伸；5-7號外顯子擴增94°C預變性5min，DNA雙鏈充分解開；94°C變性30s，63. 8 °C退 火30s，引物結合到模板上，72°C延伸3min30s，延長所需擴增片段，反應35個循環；72°C， lOmin，擴增片段充分延伸。
3.如權利要求1或2所述的一種ABO血型基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于所述 步驟(2)和步驟(4)中的引物分別為3對寡核苷酸擴增引物和18條寡核苷酸測序引物，所 述3對寡核苷酸擴增引物分別擴增ABO血型基因的1號外顯子、2-4號外顯子以及5-7號外 顯子，所述18條寡核苷酸測序引物用于測序分析；所述3對寡核苷酸擴增引物序列如下1號外顯子擴增引物M13-E1F :5’ -GTAAAACGACGGCCA GGCCGTCCCTTCCTAGCAG-3’M13-E1R :5’ -CAGGAAACAGCTATGACCGAGGAGAGGCTGGAGAC-3’2-4號外顯子擴增引物E24F2 :5’ -GAGGGTGAGTGATGTGATT-3’ E24R1 :5’ -ACTGGCAAGAGGGACTAAG-3’ 5-7號外顯子擴增引物 E57F :5’ -CTGCTAAAACCAAGGGCG-3， E7R 5' -CTGCCCACAGTGAATTGAGA-3‘ 所述18條寡核苷酸測序引物序列如下 外顯子1片段的測序引物 Ml3F 5 ’ -GTAAAACGACGGCCA-3’ Ml3R 5 ’ -CAGGAAACAGCTATGAC-3’ 外顯子2-4片段的測序引物 518F -Bccaccctcctgcccacc-S' 252F -acagaaggtcccagaaccaaga-3‘ 171F -gggtcacctggatacctctgg-S' 682F -cctctgttgggaccactcttg-S' 306F -atcgccacagtgatggttgtt-3‘ 441F -cctgggctcaagtgattctcd' 955F -ttttatgtcgggctcaaatcac-S' 外顯子5-7片段的測序引物 I6F :5’ -GTTCCCGCAGGTCCAATGT-3， I6R :5’ -GCTGCATGAATGACCTTTCC-3’ E7F :5，-TCTGCTGCTCTRAGCCTTCC-3‘ 51R 5 ’ -AAACCAACCAGAGGCAAATG-3’ 5IF :5，-CCTGTCCCTTTGTTCTCCAA-3， 6IF1 :5’ -GGGTAGAGACCCAGGCAGTG-3， 6IR1 :5’ -CTCTGCACCCTAGAGCTTCC-3’ 6IF2 :5’ -CCCAGACACCAAAGGAAGTG-3， 6IR2 :5’ -CCACCATGAAGTGCTTCTCC-3，。
4.如權利要求1所述的一種ABO血型基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于所述步驟 (4)中純化所需的兩種酶為蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶I。
5.一種ABO血型基因分型的PCR-SBT方法所用的試劑，其特征在于它包括3對寡核苷 酸擴增引物和18條寡核苷酸測序引物，所述3對寡核苷酸擴增引物分別擴增ABO血型基因 的1號外顯子、2-4號外顯子以及5-7號外顯子，所述18條寡核苷酸測序引物用于測序分 析；所述3對寡核苷酸擴增引物序列如下 1號外顯子擴增引物M13-E1F :5’ -GTAAAACGACGGCCA GGCCGTCCCTTCCTAGCAG-3’ M13-E1R :5’ -CAGGAAACAGCTATGACCGAGGAGAGGCTGGAGAC-3’ 2-4號外顯子擴增引物 E24F2 :5’ -GAGGGTGAGTGATGTGATT-3’E24R1 :5’ -ACTGGCAAGAGGGACTAAG-3’ 5-7號外顯子擴增引物 E57F :5’ -CTGCTAAAACCAAGGGCG-3， E7R 5' -CTGCCCACAGTGAATTGAGA-3‘所述18條寡核苷酸測序引物序列如下外顯子1片段的測序引物M13F5’ -GTAAAACGACGGCCA-3’M13R5，-CAGGAAACAGCTATGAC-3，外顯子2-4片段的測序引物518F5，_accaccctcctgcccacc_3’252F5，-acagaaggtcccagaaccaaga-3171F5，-gggtcacctggatacctctgg-3'682F5，一cctctgttgggaccactcttg一3’306F5，-atcgccacagtgatggttgtt-3‘441F5，一cctgggctcaagtgattctcc一3’955F5，-ttttatgtcgggctcaaatcac-3外顯子5-7片段的測序引物I6F 5，-GTTCCCGCAGGTCCAATGT-3’I6R 5，-GCTGCATGAATGACCTTTCC-3’E7F 5，-TCTGCTGCTCTRAGCCTTCC-3，5IR 5，-AAACCAACCAGAGGCAAATG-3’5IF 5，-CCTGTCCCTTTGTTCTCCAA-3’6IF15’ -GGGTAGAGACCCAGGCAGTG-3’6IR15，-CTCTGCACCCTAGAGCTTCC-3 ‘6IF25’ -CCCAGACACCAAAGGAAGTG-3’6IR2；5’ -CCACCATGAAGTGCTTCTCC-3’。
全文摘要
本發明提供一種用于ABO血型分型的PCR-SBT方法，它包括下述步驟制備人基因組DNA；擴增ABO基因外顯子1、外顯子2-4、外顯子5-7的片段；得到擴增產物進行雙酶切純化；將純化產物進行測序PCR反應；將測序產物進行醋酸鈉-乙醇沉淀法純化，進行毛細管電泳測序；將獲得的序列通過軟件分析，確定其基因型。本發明解決了ABO亞型的鑒定、疑難血型的判定、新突變位點的發現、基因之間的重組現象、基因多態性檢測等問題，發揮PCR-SBT對ABO基因定型操作高通量，結果精確的特點，在臨床輸血醫學研究和遺傳學等領域的相關應用受到高度重視，對于醫學研究單位、藥學研究和試劑開發單位具有重要的現實意義。
文檔編號C12Q1/68GK101921834SQ201010174588
公開日2010年12月22日 申請日期2010年5月17日 優先權日2010年5月17日
發明者嚴力行, 朱發明, 許先國 申請人:浙江省血液中心