專利名稱：環介導恒溫擴增檢測肺炎衣原體的方法及檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及細菌的快速檢測技術，具體的說是涉及一種環介導恒溫擴增檢測肺炎 衣原體的方法及檢測試劑盒。
背景技術：
肺炎衣原體(chlamydia pneumoniae, CPn)是1989年新定名和分類的第三種衣 原體，是引起人類急性呼吸道感染的重要致病原，臨床上不僅可引起呼吸系統感染性疾病 (肺炎、支氣管炎、鼻竇炎和咽炎)，而且在心血管疾病、哮喘、結節病患者中也發現較高的 抗體水平，近年又發現Cpn與AS有密切相關。目前，肺炎衣原體的病原學檢查主要有以下方法，一是從氣管或鼻咽吸取物做細 胞培養，此培養法，由于肺炎衣原體只能在活細胞內生長繁殖，分離培養方法復雜，所需時 間長，對操作人員要求高，而且敏感性不高，不便于臨床快速診斷。二是用熒光結合的肺炎 衣原體特異性單克隆抗體來鑒定細胞培養中的肺炎衣原體，值得注意的是，熒光顯微鏡的 質量及操作熟練程度會影響免疫熒光試驗的結果。三是用PCR檢測標本中肺炎衣原體DNA， 此方法檢測程序相對復雜且對實驗室的環境要求較高，此方法容易產生假陽性。環介導恒溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000 年開發出的一種新的核酸擴增技術，它利用Bst大片段DNA聚合酶和根據不同靶序列設計 的兩對特殊的內引物(FIP、BIP)、外引物(F3、B3)，特異地識別靶序列上的6個獨立區域。 LAMP在恒溫(65°C )的條件下反應1小時即可完成核酸擴增反應，通過熒光染色直接目測 比色就可以得到清晰的反應結果。不需要長時間的溫度循環，不需要PCR等昂貴的儀器，不 需要繁瑣的電泳紫外觀察等過程。LAMP具有簡單、快速、特異性強的特點，能代替PCR方法 的最新技術。現已被廣泛應用于微生物檢測及胚胎性別鑒定等領域，如何運用環介導恒溫 擴增技術檢測臨床肺炎衣原體在臨床診斷技術發展中具有重大意義，因此開發一種簡單快 速、檢測效率高的運用環介導恒溫擴增技術來檢測肺炎衣原體的方法迫在眉睫。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種簡單快速、檢測效 率高的環介導恒溫擴增檢測肺炎衣原體的方法及檢測試劑盒，本方法提高了肺炎衣原體的 診斷效率，解決傳統檢測方法無法滿足臨床診斷的發展要求。本發明所采用的技術方案是首先通過實驗測序得到肺炎衣原體的Pl基因序列 如序列表N0. 5所示，并通過專業軟件設計用于環介導恒溫擴增技術檢測的特異性寡核苷 酸引物，以引物序列組擴增待測樣品模板，進行目的基因片段的特異性擴增，其檢測方法的 步驟包括(1)基因提取步驟，從待檢樣品中提取模板DNA ；(2)環介導恒溫擴增反應步驟，將上述模板DNA加入反應體系中進行擴增反應，其 中所使用的引物序列如下
F3 5-AGCCAAGCCTACTGGATC-3B3 5-AACGAGATTGAACGCTGT-3FIP 5-ACCACTCTGCATCGTGTAAATGTACTACTGCCGTAGATAGACC-3BIP 5-GGCTTCATTGCCTTAAACATTTGGAGAGTTTCCTCTAATGTAACCAT-3 ；(3)結果檢測步驟，選擇以下三種擴增產物檢測方法中的任意一種進行檢測A 將擴增產物離心目測白色沉淀來檢測結果；B 加入顯色液觀察反應液顏色來檢測結果；C 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，通過電泳帶形分析檢測結果。上述步驟(2)中環介導恒溫擴增反應條件為60 ~ 65 "C 45 90 分鐘；80 95°C 3 5 分鐘。其中采用A方法檢測時，陽性結果會產生白色沉淀。在環介導恒溫擴增過程中， dNTP不斷添加進新合成的核苷酸鏈，同時會生成大量的副產物——焦磷酸鎂。焦磷酸鎂是 一種白色沉淀物，由于整個擴增試驗都是在ere左右進行，所以焦磷酸鎂沉淀無法溶解，最 終，隨著陽性核苷酸鏈的增加，焦磷酸鎂沉淀也在不斷積累。從而在反應結束后可以直接通 過觀察白色沉淀而確定陽性反應。采用B方法檢測時，陽性結果如果加入SYBR Green染料，溶液變為綠色。陽性的 環介導恒溫擴增會合成大量的核苷酸鏈。反應后，向陽性反應產物中加入SYBR Green染料 后，SYBR Green分子會大量嵌入核苷酸鏈中，從而使SYBR Green分子產生綠色熒光。而陰 性結果由于沒有目的基因片段，無法擴增出核苷酸鏈，SYBR Green也無法同核苷酸鏈結合， 結果只能是橙色。如采用C方法檢測時，陽性結果在電泳中表現為階梯狀電泳條帶。環介導恒溫擴 增的原理是，FIP引物雜交在目標DNA的F2C區段，啟動互補鏈合成，導致DNA啞鈴狀結構的 產生。此啞鈴狀結構很快以自身為模板，進行DNA合成延伸，形成莖-環DNA結構，該莖-環 結構是LAMP法基因擴增循環的起始結構。LAMP反應以此DNA結構為起始結構，進行再循環 和延伸，靶DNA序列大量交替重復產生，形成的擴增產物是有許多環的花椰菜形狀的莖一 環結構的DNA。因此隨著擴增的不斷進行，積累了以這一環狀結構為基數的核苷酸鏈，反映 在電泳中即表現為形成階梯狀電泳條帶。
本發明還公開了一種用于上述檢測方法的檢測試劑盒，包括以下成分
成分
擴增體系預混合物
引物F3
引物B3
引物FIP
引物BIP
Bst DNA聚合酶
雙蒸水
濃度加樣量
2X12. 5μ L
5 15pmol/ μ LIyL
5 15pmol/ μ LIyL
20 ~ 40pmol/y L1 μ L
20 ~ 40pmol/y L1 μ L
8U/ μ L1 μ L
5. 5 μ L ；
上述的擴增體系預混合物中含有2. 5 μ L IOXThermoPol反應緩沖液、
4μ L10mmol/L dNTPU μ L 100mmol/L 硫酸鎂、5 μ L 5mol/L 甜菜堿；
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其中，10XThermoPol反應緩沖液含有200mM pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽 酸、IOOmM的氯化鉀、IOOmM的硫酸銨、20mM的硫酸鎂和的曲拉通X-100 ；其中所述dNTP 中含有的dATP、dTTP、dCTP、dGTP的質量比為1 1 1 1。此外為了測試本試劑盒的檢測靈敏度，還可取不同稀釋度的模板DNA，濃度分別為 ΙΟ5、ΙΟ4、103、102ccu/ml，按上述步驟進行反應和檢測，結果顯示本檢測試劑盒的檢測靈敏度 為 100ccu/mlo本發明的有益效果是本發明的檢測方法和傳統生理生化檢測方法相比，基于環 介導恒溫擴增的鑒定方法更適用于直接從患者含菌體液、體液培養物等臨床樣品中擴增靶 基因，只需要一次環介導恒溫擴增反應就能夠檢測肺炎衣原體是否存在，大大提高了檢測 效率。相比較其他PCR方法，本方法僅需要簡單是設備——'〖亙溫水浴箱、離心機或普通電泳 設備(電泳儀)即可，大大提高了性價比節約了成本。環介導恒溫擴增方法具有檢測準確、 特異性強、靈敏度高、簡便、快速的特點，可以快速、準確的鑒定目標菌。環介導恒溫擴增鑒 定方法不受培養條件和細菌生理狀態的影響，較生理生化鑒定方法準確。本發明試劑盒是 根據肺炎衣原體的Pl基因序列為肺炎衣原體各不同菌株型所共有，以保證從種的水平上 檢測不用來源的肺炎衣原體的可靠性；以及本試劑盒的檢測靈敏度為lOOccu/ml，既提供 了結果觀察直觀、簡便快速的檢測途徑也保證了檢測的特異性和靈敏度。
圖1是環介導恒溫擴增產物離心后待測樣品目測沉淀結果試管底部可見明顯白 色沉淀，陰性對照沒有沉淀；其中1 陰性對照；2 陽性結果；圖2是環介導恒溫擴增產物加入SYBR Green后染色結果待測樣品溶液呈現綠 色，陰性對照為橙色；其中1 陰性對照；2 陽性結果；圖3是環介導恒溫擴增產物經1. 5%瓊脂糖凝膠電泳后檢測結果待測樣品出現 階梯狀條帶，陰性對照沒有條帶；其中1 marker ；2 陰性對照；3 陽性結果；圖4是本試劑盒的靈敏度檢測試驗結果；其中M :marker ；N 陰性對照；1 模板 濃度為105CCu/ml ；2 模板濃度為104CCu/ml ；3 模板濃度為103CCu/ml ；4 模板濃度為 102ccu/ml ο
具體實施例方式下面就具體實施例對本發明作進一步闡述采用本發明的環介導恒溫擴增快速檢測試劑盒對臨床樣品進行檢測，檢測程序包 括下列步驟1、待檢樣品DNA提取(1)取200 μ L待檢樣品或100 μ L菌培養液置于1. 5mL無菌離心管中，加入600 μ L 懸浮液(15% ChelexlOO 樹脂、100mmol/L Tris-HCl ρΗ8· 0、0· lmmol/L EDTA、0.1% 疊氮 鈉)，振蕩器上充分混勻30秒；(3)于沸水浴中煮沸10分鐘，后于冰上迅速冷卻；(4)放入離心機10000轉/分鐘離心5 10分鐘，取上清到無菌離心管中，即為待 檢模板DNA。
2、肺炎衣原體的環介導恒溫擴增反應(1)其中用于環介導恒溫擴增反應的試劑盒包括環介導恒溫反應管，它包括12. 5 μ L的擴增體系預混合物、1 μ L 5 15pmol/ μ L 的引物F3、lyL 5 15pmol/yL 的弓丨物B3、lyL 20 40pmol/μ L 的引物FIP、1 μ L 20 40pmol/y L的引物BIP,5. 5 μ L的無菌雙蒸水。其中，擴增體系預混合物中含有2. 5 μ L IOXThermoPol反應緩沖液、 4μ L10mmol/L dNTP、l μ L 100mmol/L 硫酸鎂、5 μ L 5mol/L 甜菜堿；10 X ThermoPol 反應緩 沖液含有200mM pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、IOOmM的氯化鉀、IOOmM的硫酸銨、 20mM的硫酸鎂和1 %的曲拉通X-100 ；其中所述dNTP中含有的dATP、dTTP、dCTP、dGTP的質量比為1 1 1 1。以及8U/y L的Bst DNA聚合酶。(2)在裝有22 μ L LAMP反應液的反應管中加入2 μ L待檢樣品模板DNA和1 μ L Bst DNA聚合酶。(3)于恒溫水浴箱或金屬浴中60 65°C放置45 90分鐘。(4)于80 95°C放置3 5分鐘中止反應，取出觀察結果。3、結果觀察(1)室溫10，OOOg離心5分鐘，陽性結果在試管底部可見白色沉淀(圖1)；(2)加入顯色劑，陽性結果為綠色(圖2)；(3) 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，陽性結果有梯狀電泳條帶(圖3)。選擇以上三種檢測方法中的任意一種方法進行檢測。4、靈敏度檢測 取不同稀釋度的模板DNA，濃度分別為ΙΟ5、ΙΟ4、103、102ccu/ml，按上述步驟進行檢 測，結果顯示(如圖4所示)本檢測試劑盒的檢測靈敏度為lOOccu/ml。
權利要求
一種環介導恒溫擴增檢測肺炎衣原體的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)基因提取步驟，從待檢樣品中提取模板DNA；(2)環介導恒溫擴增反應步驟，將上述模板DNA加入反應體系中進行擴增反應，其中所使用的引物序列如下F3 5-AGCCAAGCCTACTGGATC-3B3 5-AACGAGATTGAACGCTGT-3FIP 5-ACCACTCTGCATCGTGTAAATGTACTACTGCCGTAGATAGACC-3BIP 5-GGCTTCATTGCCTTAAACATTTGGAGAGTTTCCTCTAATGTAACCAT-3；(3)結果檢測步驟，選擇以下三種擴增產物檢測方法中的任意一種進行檢測A將擴增產物離心目測白色沉淀來檢測結果；B加入顯色液觀察反應液顏色來檢測結果；C1.5％瓊脂糖凝膠電泳，通過電泳帶形分析檢測結果。
2.根據權利要求1所述的環介導恒溫擴增檢測肺炎農原體的方法，其特征在于，上述 步驟(2)中環介導恒溫擴增反應條件為60 65 °C 45 90分鐘； 80 95°C 3 5分鐘。
3.一種用于權利要求1所述的環介導恒溫擴增檢測肺炎衣原體的方法的檢測試劑盒，其特征在于，包括以下成分成分濃度加樣量擴增體系預混合物2 X12. 5 μ L弓丨物 F35 15pmol/y L1 μ L弓丨物 Β35 15pmol/y L1 μ L引物 FIP20 40pmol/yL1 μ L引物 BIP20 40pmol/yL1 μ LBst DNA 聚合酶8U/ μ L1 μ L雙蒸水5.5yL。
4.根據權利要求3所述的環介導恒溫擴增檢測肺炎衣原體的檢測試劑盒，其特征在 于，其中擴增體系預混合物中含有2. 5μ L IOXThermoPol反應緩沖液、4 μ L 10mmol/L dNTP、l μ L 1 OOmmo 1/L 硫酸鎂、5 μ L 5mol/L 甜菜堿。
全文摘要
本發明公開了一種簡單快速、檢測效率高的環介導恒溫擴增檢測肺炎衣原體的方法及檢測試劑盒，主要方案步驟為設計了引物組序列，采用利用檢測試劑盒對待檢樣品進行環介導恒溫擴增反應，其環介導恒溫擴增產物檢測方法包括室溫10,000g離心5分鐘后陽性結果在試管底部可見白色沉淀；加入顯色劑，陽性結果為綠色；1.5％瓊脂糖凝膠電泳結果有梯狀電泳條帶；可以選擇以上三種環介導恒溫擴增產物檢測方法中的任意一種方法進行檢測。該方法具有檢測準確、靈敏度高、特異性強、簡便、快速的特點，檢測靈敏度為100ccu/ml，可以快速準確地鑒定特異的目標菌，從而解決了傳統檢測方法無法滿足臨床檢測發展要求的現狀。
文檔編號C12Q1/04GK101886122SQ201010174440
公開日2010年11月17日 申請日期2010年5月10日 優先權日2010年5月10日
發明者于丹, 孫宜峰, 曾冰冰 申請人:珠海市銀科醫學工程有限公司