專利名稱：井岡霉素發酵生產方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物工程技術領域的方法，具體是一種井R霉素發酵生產方 法。
背景技術：
井網霉素國外又稱“有效霉素”(Validamycin)，是我國及東南亞水稻主產區用于 防治水稻紋枯病的最佳生物農藥之一，施用后無耐藥現象，同時還是生產阿卡波糖(拜糖 平)和伏格列波糖(倍欣)兩種糖尿病臨床用藥的直接原料。本次采用菌株是上海農藥所 J艮道白勺吸水鏈霄菌井_變禾中 5008 菌株(Streptomyces hygroscopicus var. jinggangensis 5008)，該菌株能同時產生井R霉素和靜絲霉素兩類抗生素，其有效成分井R霉素現階段在 我國的年需求量超過6萬噸，年產值超5億元，是迄今為止我國使用最廣的一種農用抗生
o經對現有技術文獻檢索發現，在井R霉素工業化生產的30多年中，人們多采用菌 種選育和培養基優化來提高井R霉素發酵產量。1970年Iwasa首次報道了有效霉素并對吸 水鏈霉菌檸檬變種發酵生產有效霉素A和B進行了探索，最終獲得的優化后產量為620mg/ L。2003年陳力力和魯迎新采用微波誘變選育井R霉素生產菌，獲得了遺傳穩定的高產菌 株，產量較出發菌株提高了 20%左右。2007年，虞龍和安肖探索使用金屬離子和氣體離子 交替注入誘變方法，得到了較高的正突變率和突變增幅，獲得了比出發菌株提高54. 4%的 遺傳穩定的高產菌株。目前井R霉素的工業生產中多采用玉米粉、黃豆餅粉等廉價碳氮源外加適量鉀鈉 鹽為主要培養基發酵生產該抗生素。從碳源代謝的角度來看，吸水鏈霉菌5008用于產次級 代謝物井R霉素的碳源比例已經達到相對較高的水平，同時也顯示僅僅通過碳氮源優化和 菌株誘變的方法來提高井R霉素的產量遇到了瓶頸。經過對現有技術的檢索發現，中國專利文獻號CN101298623中記載了一種提高發 酵溫度來增加井R霉素產量的發酵方法，但該技術同時存在發酵后期菌體數量下降較快影 響井R霉素總產量的問題。而且提高溫度必然會影響工業化發酵過程的成本。因井岡霉 素發酵結束后，會產生一定量的菌渣，其主要成分是未完全利用的培養基和發酵后剩余菌 體；另外，中國專利文獻號CN101134976記載了一種使用循環發酵法生產井網霉素的方法， 但其主要目的是實現無菌渣和無廢水排放減少環境污染，在井R霉素節能增產方面未見改 善。因此，在現有優化后的發酵水平基礎上，控制能耗成本的前提下，如果能通過添加微量 的細胞刺激物影響次級代謝的水平，從而實現次級代謝物的高效發酵也許將會是突破井岡 霉素產量瓶頸的重要手段。
發明內容
本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種井R霉素發酵生產方法，通過添 加微量乙醇的方法，刺激吸水鏈霉菌代謝，特別是次級代謝系統，使井R霉素的產量進一步提高。本發明的方法在不加大能耗的前提下，縮短了發酵周期，提高了設備利用率，獲得較 高的井R霉素產量，降低了生產成本，在工業化生產中具有應用價值。本發明是通過以下技術方案實現的，包括以下步驟(1)將孢子懸浮液進行菌種活化與平板培養制成孢子活化液，具體為將_70°C保存的吸水鏈霉菌井網變種5008菌株的孢子懸浮液融化，將其涂布于含 有固體培養基的平板上，然后將平板倒置，并于37°C培養5-8天后取平板表面覆蓋的孢子， 制成孢子活化液；所述的吸水鏈霉菌井岡變種5008菌株(Str印tomyces hygroscopicus var. jinggangensis 5008)屬于放線菌門、放線菌綱、放線菌亞綱、放線菌目、鏈霉菌科、鏈霉菌 屬，其生物保藏信息為中國普通微生物菌種保藏管理中心(地址北京市朝陽區北辰西路 1號院)，菌種保藏號CGMCC4. 1026。所述的孢子懸浮液為平板培養5-8天的孢子，加入5-10mL 20%甘油(v/v)混勻得 到的懸浮液。所述的固體培養基的組分為黃豆餅粉20g/L、甘露醇20g/L以及瓊脂20g/L，余量 為蒸餾水。(2)將孢子活化液接種于種子培養基中進行初步培養，得到種子培養液，具體為將種子培養基和孢子活化液按照體積比為1000 1的比例配比后接種到種子培 養基中，接種后于37°C下進行發酵培養15-30h ；所述的種子培養基的組分為玉米粉30g/L、黃豆餅粉22g/L、酵母粉10g/L、NaCl 2g/L以及KH2P040. 8g/L，余量為蒸餾水。(3)將種子培養液接種于發酵培養基中進行發酵培養，實現井R霉素的發酵生產， 具體為將發酵培養基和種子培養液按照體積比為10 1的比例配比后接種到發酵 培養基中，接種后于37°C下培養，培養5-30h時加入微量乙醇使其在培養基中濃度達到 0. 01-0. 5% (每100mL培養基中添加0. 01-0. 5mL無水乙醇)，繼續培養72_108h后發酵結 束，進行井R霉素測定。所述的發酵培養基的組分為玉米粉100g/L、黃豆餅粉25g/L、酵母粉5g/L、NaCl lg/L以及KH2P041. 5g/L，余量為蒸餾水。本發明利用微生物生長外源刺激物酒精可以抑制或激活某些次級代謝物分泌的 規律，使用了添加低濃度乙醇的發酵培養基來提高井R霉素的發酵產量和生產速率。本發 明確定了乙醇的最適添加時間為發酵開始12h，最適添加濃度為0. 05%,96h發酵培養后井 岡霉素的絕對積累量從12g/L提高到了約20g/L，降低了生產成本。而且為獲得井R霉素可 在96h終止發酵，使發酵提前一天結束，縮短了發酵時間，獲得了更高的相對效價。
圖1為實施例中乙醇的添加時間對井岡霉素發酵產量的動態影響圖。圖2為實施例中乙醇的添加濃度對井岡霉素發酵產量的動態影響圖。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1發酵培養基中乙醇添加時間對井R霉素產量的影響考察，選擇3個時段種子液 接種前即Oh、發酵開始后12h、發酵開始后24h，分別添加不同濃度乙醇進行發酵試驗。實施 步驟和結果如下1.實施步驟(1)菌種活化與平板培養將黃豆餅粉、甘露醇、瓊脂按2%的濃度配成平板培養基，滅菌倒平板冷卻后待用。 將-70°C保存的井R霉素產生菌吸水鏈霉菌5008的孢子懸浮液融化，將其涂布于固體培養 基平板上，然后將平板倒置，于37°C培養5-8天后可以看到平板表面形成大量的青色孢子。 往孢子長勢良好的平板上加入5mL無菌水，使用涂布棒輕輕刮動平板表面覆蓋的孢子，使 其懸浮于無菌水中。(2)種子培養將不銹鋼彈簧卷曲成環狀，置于250mL錐形瓶底部，裝入50mL種子培養基(成分 玉米粉3g、黃豆餅粉2. 2g、酵母粉lg、NaCl 0. 2g、KH2P040. 08g、蒸餾水100mL)，滅菌。待培 養基冷卻至室溫，吸取孢子懸浮液50 y L加入搖瓶中接種。接種后，將搖瓶至于37°C下、轉 速220rpm培養24h，至少設置3個平行樣。(3)發酵培養對照組發酵搖瓶選擇放入彈簧的250mL錐形瓶，瓶內裝入50mL發酵培養基(成 分玉米粉10g、黃豆餅粉2. 5g、酵母粉0. 5g、NaCl 0. lg、KH2P040. 15g、蒸餾水lOOmL)。轉 接時首先將三個平行種子液混合均勻，然后使用滅過菌的5mL移液管吸取5mL種子液轉移 到發酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉速220rpm培養，至少設置3個平行樣。培養進行到 24h、48h、72h、96h、120h每個搖瓶分別取出2mL培養液進行井岡霉素檢測。乙醇添加組設置了三個乙醇添加時間0h、12h、24h，設置相對較寬的添加濃度范 圍0. 001 %,0. 01 %、0. 1 %。Oh添加組發酵搖瓶選擇放入彈簧的250mL錐形瓶，瓶內裝 入50mL發酵培養基，滅菌冷卻后直接加入不同劑量的乙醇(0. 001%,0.01%,0. )，因 0. 001 %組乙醇添加量較少，可先無菌水稀釋10倍后添加，另兩個濃度組可直接添加分析 純乙醇。每個劑量組至少3個平行樣，然后將9個搖瓶轉接種子液。轉接時首先將三個平 行種子液混合均勻，然后使用滅過菌的5mL移液管吸取5mL種子液轉移到發酵搖瓶中，將搖 瓶至于37°C下、轉速220rpm培養，至少設置3個平行樣。培養進行到24h、48h、72h、96h、 120h每個搖瓶分別取出2mL培養液進行井R霉素檢測。12h添加組發酵搖瓶選擇放入彈 簧的250mL錐形瓶，瓶內裝入50mL發酵培養基。轉接時首先將三個平行種子液混合均勻， 然后使用滅過菌的5mL移液管吸取5mL種子液轉移到發酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉速 220rpm培養。培養進行到12h時，將搖瓶取出在超凈臺中加入不同劑量的乙醇(0.001%、 0.01%,0. 1% )，每個劑量組至少3個平行樣，然后將9個搖瓶放置搖床內按37°C、220rpm 繼續培養，培養再進行12h即到達24h取樣點，依次在24h、48h、72h、96h、120h每個搖瓶分 別取出2mL培養液進行井R霉素檢測。24h添加組發酵搖瓶選擇放入彈簧的250mL錐形瓶，瓶內裝入50mL發酵培養基。轉接時首先將三個平行種子液混合均勻，然后使用滅過菌 的5mL移液管吸取5mL種子液轉移到發酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉速220rpm培養。 培養進行到24h時，將搖瓶取出在超凈臺中先取出2mL培養液作為井R霉素檢測樣品(24h 取樣點)，然后搖瓶內加入不同劑量的乙醇(0. 001%,0.01%,0. 1%)，每個劑量組至少3個 平行樣，然后將9個搖瓶放置搖床內按37°C、220rpm繼續培養，培養再進行一天即到達48h 取樣點，依次在48h、72h、96h、120h每個搖瓶分別取出2mL培養液進行井岡霉素檢測。(4)井岡霉素產量檢測樣品處理發酵液2mL于10000g離心5min，菌體上清分離。發酵上清液0. 5mL加入 等體積的氯仿，劇烈震蕩數分鐘直至形成乳濁液。室溫靜置15min，以最大轉速離心5min， 轉移上清至新管中，稀釋5倍(200 u L+800 u L蒸餾水)，樣品0. 22 y m濾膜過濾、最大轉速 離心5min后作為HPLC上樣樣品。井岡霉素標品處理井岡霉素配成10g/L(0. lg/10mL), 取 100ii L、200ii L、300ii L、400ii L、500ii L 加水至 lmL(濃度約 lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、 5g/L，乘以標品純度即為標品準確的實際濃度)。流動相配置使用5mmol/L pH 7. 0的磷 酸鹽緩沖液作為流動相(磷酸鹽緩沖液色譜純甲醇=98 2體積比)，NaH2P04 2H20 0. 78g+100mL 水(取 51mL)、Na2HP04 12H20 1. 79g+100mL 水(取 49mL)，得到 100mL 混合液， 混勻定容至lOOOmL，用稀釋10倍的母液調pH 7. 0。流動相抽濾、超聲波處理20min，液相上 磷酸鹽流動相時先使用10%的甲醇過渡。液相檢測條件流速lmL/min，檢測波長210nm， 使用依利特Hypersil 0DS25um、4. 6mmX 250mm分析柱，控制柱溫25°C，保留時間約為8min。 根據峰面積比對標準曲線得到井R霉素含量，因樣品處理時均稀釋5倍所以比對得到的含 量乘以5得到井R霉素的發酵產量。2.實施結果分析通過實施結果比對知乙醇添加組最高發酵產量形成于96h，不同處理組與對照 組乙醇不同添加時間下井岡霉素的最高產量分別為對照組12. 45士 1.407g/L、0. 001%濃 度下乙醇Oh添加組12. 58士 1. 743g/L、0. 001%濃度下乙醇12h添加組13. 68士 1.662g/ L、0. 001 %濃度下乙醇24h添加組13. 04 士 1. 323g/L、0. 01 %濃度下乙醇Oh添加組 13. 76士 1. 338g/L、0. 01%濃度下乙醇 12h 添加組 18. 30士 1. 617g/L、0. 01%濃度下乙醇 24h 添加組13. 03士2. 212g/L、0. 1 %濃度下乙醇Oh添加組10. 69士 1. 020g/L、0. 濃度下乙醇 12h添加組11. 76士 1. 683g/L、0. 濃度下乙醇24h添加組11. 47士2. 964g/L，由此可見在 幾種乙醇不同添加量的處理組都存在12h添加組井R霉素產量高的現象。其中乙醇添加量 在0. 01%時相對于對照組井R霉素產量有較大提高，所以對其在不同添加時間的動態影響 作圖(見圖1)。經試驗結果分析發現，井R霉素生產菌吸水鏈霉菌5008在發酵進行到12h 時處于細胞代謝最旺盛的對數生長期，相對于Oh和24h添加乙醇，12h添加乙醇對井R霉素 的產量影響更為明顯，比其他時間段添加產量可提高40%，與對照組相比可提高50%。實施例2發酵培養基中在12h添加乙醇可促進井R霉素產量提高，接下來更加詳細地比 較了不同乙醇添加量對井R霉素產量的影響，先選擇4個相對較低添加濃度0. 001%, 0. 005%,0. 01%,0. 05%。實施步驟和結果如下1.實施步驟(1)菌種活化與平板培養
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將黃豆餅粉、甘露醇、瓊脂按2%的濃度配成平板培養基，滅菌倒平板冷卻后待用。 將-70°C保存的井R霉素產生菌吸水鏈霉菌5008的孢子懸浮液融化，將其涂布于固體培養 基平板上，然后將平板倒置，于37°C培養5天后可以看到平板表面形成大量的青色孢子。往 孢子長勢良好的平板上加入5mL無菌水，使用涂布棒輕輕刮動平板表面覆蓋的孢子，使其 懸浮于無菌水中。(2)種子培養將不銹鋼彈簧卷曲成環狀，置于250mL錐形瓶底部，裝入50mL種子培養基(成分 玉米粉3g、黃豆餅粉2. 2g、酵母粉lg、NaCl 0. 2g、KH2P040. 08g、蒸餾水100mL)，滅菌。待培 養基冷卻至室溫，吸取孢子懸浮液50 y L加入搖瓶中接種。接種后，將搖瓶至于37°C下、轉 速220rpm培養18h，至少設置3個平行樣。(3)發酵培養對照組發酵搖瓶選擇放入彈簧的250mL錐形瓶，瓶內裝入50mL發酵培養基(成 分玉米粉10g、黃豆餅粉2. 5g、酵母粉0. 5g、NaCl 0. lg、KH2P040. 15g、蒸餾水lOOmL)。轉 接時首先將三個平行種子液混合均勻，然后使用滅過菌的5mL移液管吸取5mL種子液轉移 到發酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉速220rpm培養，至少設置3個平行樣。培養進行到 12h、14h、18h、24h、48h、72h、96h、120h每個搖瓶分別取出2mL培養液進行井岡霉素檢測。乙醇添加組發酵搖瓶選擇放入彈簧的250mL錐形瓶，瓶內裝入50mL發酵培養 基。轉接時首先將三個平行種子液混合均勻，然后使用滅過菌的5mL移液管吸取5mL種子 液轉移到發酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉速220rpm培養。培養進行到12h時，作為12h 取樣點先每瓶取出2mL發酵液，然后在超凈臺中加入不同劑量的乙醇(0.001%、0.005%、 0. 01%、0. 05% )，0. 001%和0. 005%兩個濃度組添加時先把乙醇用無菌水稀釋10倍后再 添加，0. 01 %和0. 05%兩個濃度組直接添加分析純乙醇。每個劑量組至少3個平行樣，再將 21個搖瓶放置搖床內按371、220印111繼續培養，依次在1411、1811、2411、4811、7211、9611、12011每 個搖瓶分別取出2mL培養液進行井R霉素檢測。(4)井岡霉素產量檢測同實施例1。(5)吸水鏈霉菌5008生物量檢測樣品處理2mL樣品離心后沉淀下來的菌體用STE緩沖液(pH 8. 0)懸浮、離心、洗 滌兩次后，恢復到2mL(STE溶解)混勻，分裝2個離心管(250 y L/管+250 u LSTE)，一管加 50mg/mL溶菌酶溶液20 y L，另一管為空白對照。將處理樣、空白樣一起放入37°C水浴保溫 lh，不斷振蕩。加入lOyL 10% SDS進一步裂解細胞并充分振蕩(低濃度條件下用對照可以 消除SDS的干擾)。12000g離心lOmin，吸取上清液根據濃度情況稀釋25倍至測定范圍內， 利用Bradford法測定蛋白濃度。其中STE緩沖液組成為lmol/LTris-HCl (pH 8.0)2. 5mL、 0. 5mol/L EDTA 0. 5mL、5mol/L NaCl 5mL 定容至 250mL。樣品測定分別取試管，其中一支加入l.OmL空白樣，另外一支加入同體積的處理 樣，加入5mL考馬斯亮藍G250搖勻放置5min，595nm處測吸光度，用測得的吸光值從標準曲 線上查得相當于牛血清蛋白的mg數，乘以稀釋倍數(2X25)得蛋白量表征的生物量。(6)發酵培養基殘糖測定樣品處理2mL發酵液離心取100 y L上清液，48h前樣品(包括48h)梯度稀釋1000倍，72h后樣品(包括72h)梯度稀釋500倍；標品處理葡萄糖烘干1天，0. lg加水 10mL(10g/L)稀釋 100 倍(100mg/L)，取三份 200 u L.400 u L.600 u L.800 u L, 1000 u L 加 水至 lmL(濃度20mg/L，40mg/L，60mg/L，80mg/L，lOOmg/L)。樣品測定加入 5%苯酚溶液 lmL,再與5mL濃H2S04混合均勻，快速加入邊加邊震蕩，放置反應lOmin，冷卻后在488nm處 測吸光度。比照標準曲線，分別乘以1000或500得殘糖量。2.實施結果分析乙醇添加量在0. 05%和0. 01%時，井R霉素產量較對照組有較大提高(圖2)，低 濃度范圍最適添加量為0. 05%。最高產量出現在0. 05%乙醇處理組發酵96h，從12g/L提 高至約20g/L，產量提高了 8g/L，漲幅超過60%。在最高產量點上，乙醇處理的吸水鏈霉菌 5008的生物量沒有顯著差異(96h樣品對照組胞內蛋白表征的生物量3. 974士0. 2474g/L， 0. 01% 乙醇處理組 3. 954士0. 09426g/L，0. 05% 乙醇處理組 3. 782士0. 6991g/L)，表明單位 細胞井R霉素的產量也得到了提高。工業化井R霉素生產過程中為防止乙醇對細胞的毒害 作用，發酵過程中沒有外源乙醇的加入，但由本實施例可以看到適量乙醇的添加對發酵生 產次級代謝物的刺激作用并由此可體現其工業應用價值。實施例3發酵培養基中在12h添加乙醇可促進井R霉素產量提高，接下來更加詳細地比較 了不同乙醇添加量對井R霉素產量的影響，選擇3個相對較高的添加濃度0. 1%,0.5%, 1%。實施步驟和結果如下1.實施步驟(1)菌種活化與平板培養將黃豆餅粉、甘露醇、瓊脂按2%的濃度配成平板培養基，滅菌倒平板冷卻后待用。 將-70°C保存的井R霉素產生菌吸水鏈霉菌5008的孢子懸浮液融化，將其涂布于固體培養 基平板上，然后將平板倒置，于37°C培養7天后可以看到平板表面形成大量的青色孢子。往 孢子長勢良好的平板上加入5mL無菌水，使用涂布棒輕輕刮動平板表面覆蓋的孢子，使其 懸浮于無菌水中。(2)種子培養將不銹鋼彈簧卷曲成環狀，置于250mL錐形瓶底部，裝入50mL種子培養基(成分 玉米粉3g、黃豆餅粉2. 2g、酵母粉lg、NaCl 0. 2g、KH2P040. 08g、蒸餾水100mL)，滅菌。待培 養基冷卻至室溫，吸取孢子懸浮液50 y L加入搖瓶中接種。接種后，將搖瓶至于37°C下、轉 速220rpm培養30h，至少設置3個平行樣。(3)發酵培養對照組發酵搖瓶選擇放入彈簧的250mL錐形瓶，瓶內裝入50mL發酵培養基(成 分玉米粉10g、黃豆餅粉2. 5g、酵母粉0. 5g、NaCl 0. lg、KH2P040. 15g、蒸餾水lOOmL)。轉 接時首先將三個平行種子液混合均勻，然后使用滅過菌的5mL移液管吸取5mL種子液轉移 到發酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉速220rpm培養，至少設置3個平行樣。培養進行到 24h、48h、72h、96h、120h每個搖瓶分別取出2mL培養液進行井岡霉素檢測。乙醇添加組發酵搖瓶選擇放入彈簧的250mL錐形瓶，瓶內裝入50mL發酵培養 基。轉接時首先將三個平行種子液混合均勻，然后使用滅過菌的5mL移液管吸取5mL種子 液轉移到發酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉速220rpm培養。培養進行到12h時，作為12h
8取樣點先每瓶取出2mL發酵液，然后在超凈臺中直接加入不同劑量的分析純乙醇(0. 1%, 0.5%,1% ),每個劑量組至少3個平行樣，再將21個搖瓶放置搖床內按37°C、220rpm繼續 培養，依次在24h、48h、72h、96h、120h每個搖瓶分別取出2mL培養液進行井岡霉素檢測。(4)井岡霉素產量檢測同實施例1。(5)吸水鏈霉菌5008生物量檢測同實施例2。(6)發酵培養基殘糖測定同實施例2。2.實施結果分析乙醇添加量在0. 1%、0.5%、1%時，井網霉素產量較對照組均無提高的現象(圖 2)，特別是濃度時對井R霉素產量已有明顯的抑制作用。殘糖量測定發現在乙醇添加量 達到0. 時，發酵初期糖代謝開始受到一定抑制a^^i0h、24h、48h、72h、96h、120h的 殘糖量分別為 90. 35士0. 8763g/L、46. 50士0. 3125g/L、12. 75士2. 475g/L、8. 190士2. 812g/ L、7. 900士0. 775g/L、6. 680士3. 003g/L ;0. 1 % 乙醇組分別為 90. 35士0. 8763g/ L、56. 70 士 0. 9712g/L、32. 04 + 3. 329g/L、13. 56+ 1. 574g/L、9. 760 + 2. 278g/L、 7. 270士2. 171g/L)，相對較高濃度的乙醇(>0.1%)添加會產生相反的效應，引起農藥產 量的下降，不利于工業化生產。所以在實際應用過程中應嚴格控制乙醇添加濃度和添加時 間，才能提高經濟效益降低工業生產成本。
權利要求
一種井岡霉素發酵生產方法，其特征在于，包括以下步驟第一步、將孢子懸浮液進行菌種活化與平板培養制成孢子活化液；第二步、將孢子活化液接種于種子培養基中進行初步培養，得到種子培養液；第三步、將種子培養液接種于發酵培養基中進行發酵培養，實現井岡霉素的發酵生產。
2.根據權利要求1所述的井R霉素發酵生產方法，其特征是，所述的第一步具體為 將-70°C保存的吸水鏈霉菌井R變種5008菌株的孢子懸浮液融化，將其涂布于含有固體培 養基的平板上，然后將平板倒置，并于37°C培養5-8天后取平板表面覆蓋的孢子，制成孢子 活化液。
3.根據權利要求2所述的井R霉素發酵生產方法，其特征是，所述的吸水鏈霉菌井岡 變禾中 5008 菌株(Streptomyces hygroscopicus var. jinggangensis 5008)屬于放線菌|、二、 放線菌綱、放線菌亞綱、放線菌目、鏈霉菌科、鏈霉菌屬。
4.根據權利要求1或2所述的井R霉素發酵生產方法，其特征是，所述的孢子懸浮液為 平板培養5-8天的孢子，加入5-10mL體積比濃度為20%甘油混勻得到的懸浮液。
5.根據權利要求2所述的井R霉素發酵生產方法，其特征是，所述的固體培養基的組 分為黃豆餅粉20g/L、甘露醇20g/L以及瓊脂20g/L，余量為蒸餾水。
6.根據權利要求1所述的井R霉素發酵生產方法，其特征是，所述的第二步具體為將 種子培養基和孢子活化液按照體積比為1000 1的比例配比后接種到種子培養基中，接種 后于37°C下進行發酵培養15-30h。
7.根據權利要求1或6所述的井R霉素發酵生產方法，其特征是，所述的種子培養基的 組分為玉米粉30g/L、黃豆餅粉22g/L、酵母粉10g/L、NaCl 2g/L以及KH2P040 . 8g/L，余量 為蒸餾水。
8.根據權利要求1所述的井R霉素發酵生產方法，其特征是，所述的第三步具體為將 發酵培養基和種子培養液按照體積比為10 1的比例配比后接種到發酵培養基中，接種后 于37°C下培養，培養5-30h時后每100mL培養基中添加0. 01-0. 5mL無水乙醇使其在培養基 中濃度達到0. 01-0. 5%，繼續培養72-108h后發酵結束。
9.根據權利要求1或8所述的井R霉素發酵生產方法，其特征是，所述的發酵培養基的 組分為玉米粉100g/L、黃豆餅粉25g/L、酵母粉5g/L、NaCl lg/L以及KH2P041. 5g/L，余量 為蒸餾水。
全文摘要
一種生物工程技術領域的井岡霉素發酵生產方法，通過將孢子懸浮液進行菌種活化與平板培養制成孢子活化液；再將孢子活化液接種于種子培養基中進行初步培養，得到種子培養液；最后將種子培養液接種于發酵培養基中進行發酵培養，實現井岡霉素的發酵生產。本發明使井岡霉素的產量進一步提高。本發明的方法在不加大能耗的前提下，縮短了發酵周期，提高了設備利用率，獲得較高的井岡霉素產量，降低了生產成本，在工業化生產中具有應用價值。
文檔編號C12R1/55GK101851653SQ20101017383
公開日2010年10月6日 申請日期2010年5月17日 優先權日2010年5月17日
發明者周文文, 鐘建江 申請人:上海交通大學