專利名稱：快速溶解殼聚糖、以高底物濃度酶法制備殼寡糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及殼寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)，具體涉及通過一種高速剪切分散機(jī)快速溶 解殼聚糖并在高底物濃度條件下酶法生產(chǎn)殼寡糖的方法。
背景技術(shù)：
殼寡糖(Chitooligosaccharides)是殼聚糖經(jīng)過水解生成的聚合度為2 20的低聚糖，是一種由氨基葡萄糖或少量N-乙酰氨基葡萄糖組成的低聚物。殼寡糖不僅保持了 殼聚糖大分子所具有的某些功能性質(zhì)，而且還具有許多殼聚糖所不具備的獨(dú)特的生理活性 和功能性質(zhì)，在食品、醫(yī)藥、化妝品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有著極其廣泛的應(yīng)用，已成為國際上新興 的一種功能性低聚糖。尤其引人注目的是其在抑制腫瘤細(xì)胞的生長，激活巨噬細(xì)胞的吞噬 功能，活化腸道內(nèi)的雙歧桿菌，提高機(jī)體免疫力等方面有很高的活性。同時殼寡糖還具備殼 聚糖所不具備的良好的吸濕性、保濕性、溶解性與抗菌性，可以作為食品添加劑如防腐劑和 果蔬保鮮劑等。目前，國內(nèi)外殼寡糖制備方法主要有化學(xué)降解法、物理降解法和酶催化水解法?；瘜W(xué)法制備的產(chǎn)物分子量分布寬，聚合度5以上的殼寡糖收率低，存在結(jié)構(gòu)被破壞的危險。物 理法降解有限，只能得到低分子量的殼聚糖；酶法制備過程溫和，分子量分布相對容易控 制，產(chǎn)物安全性高，是一種比較理想的制備殼寡糖的方法。隨著膜分離技術(shù)等在殼寡糖生 產(chǎn)中的應(yīng)用，酶法生產(chǎn)殼聚糖的工藝不斷得到完善。近十年來，國內(nèi)外有一些酶法報道文 章或?qū)＠麍蟮?，但在方法中由于受殼聚糖溶解限制和本身的黏度，殼聚糖的酶法制備底?濃度一般為 5% ；在一種以發(fā)酵超濾耦合為特征的制備殼寡糖的方法(CN1928106A) 中，殼聚糖底物濃度2% 3% ；在專利《用固定化酶技術(shù)制備殼低聚糖或殼寡糖的方法》 (CN10104841A)中，底物殼聚糖溶液3 % 5 % ；在一種將殼聚糖的降解與膜分離耦合的 殼寡糖生產(chǎn)方法(CN1126756C)中，殼聚糖底物濃度0. 5% 3 % ；在《一種水溶性殼低聚 糖的制備方法》(CN1544479A)中，攪拌8h才使脫乙酰度71. 2 %的殼聚糖充分溶解得到 的底物濃度為 5%，溶解慢；在 CN1470168、CN1687139、CN1772915、CN1401652A 等的方法 中，底物濃度都不超過5% ；夏文水(CN1425696A)通過采取40°C 90°C的加溫措施并加 入2% 5%鹽酸，使得殼聚糖分子被水解，從而降低黏度以增加濃度到5% 10% ；黃代 勇(CN101240305A)在一種酶法降解殼聚糖生產(chǎn)殼寡糖的方法中，提到按底物濃度15% 20%配制，但沒有提出任何必要的增溶方法或手段，故達(dá)到上述濃度的可行性值得商榷。我 們的實(shí)驗(yàn)也表明，以脫乙酰度85%、黏均分子量300，000左右的殼聚糖在2%醋酸溶液中， 其溶解濃度不超過4%，如大于4%將形成難以攪拌的凝膠。總之，由于殼聚糖溶解過程緩 慢，形成底物濃度低，導(dǎo)致在反應(yīng)產(chǎn)物分離純化和干燥過程中生產(chǎn)能耗大，生產(chǎn)成本高，很 大程度上限制了酶法制備殼寡糖技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用。因此，有必要研究一種可以在較高底 物濃度下酶法生產(chǎn)殼寡糖的方法。(1)殼聚糖是一種高分子聚合物，分子量從幾十萬到上百萬，溶液的黏度很高，采 取普通的溶解方法溶解速度很慢，因此要解決殼聚糖的快速分散和溶解問題。
(2)由于殼聚糖溶解慢而產(chǎn)生底物濃度低，由此在酶法制備殼寡糖時產(chǎn)生高能耗， 增加生產(chǎn)成本，本發(fā)明著力解決如何提高酶反應(yīng)過程中殼聚糖底物濃度的問題。(3)較低的底物濃度不但使能耗水平上升也使產(chǎn)品的生產(chǎn)周期加長，從而降低生 產(chǎn)效率，因此要解決提高生產(chǎn)效率的問題。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可以有效克服現(xiàn)有技術(shù)條件下殼聚糖溶解速度慢、底 物濃度低、能耗大和生產(chǎn)成本高的瓶頸問題的快速溶解殼聚糖、以高底物濃度酶法制備殼 寡糖的方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案一種快速溶解殼聚糖、以高底物濃度酶法制備殼寡糖的方法，其特征在于包括下 列步驟(1)制備高底物濃度殼聚糖溶液以殼聚糖粉末和水加入到高速剪切分散機(jī)中，轉(zhuǎn)速1500rpm以上運(yùn)行1 5min 后，加入醋酸使其溶解，在溫度40°C 50°C時按10 50U/g的比例加入殼聚糖水解酶，運(yùn) 轉(zhuǎn)待溶液黏度< lOOOcp和pH > 4. 3時，轉(zhuǎn)速3000rpm，添加殼聚糖，同時補(bǔ)加冰醋酸，再 按上述殼聚糖水解酶的用量比例加入殼聚糖水解酶液，維持反應(yīng)體系的黏度< lOOOcp，pH < 4. 5，直至得到的殼聚糖溶液中殼聚糖底物濃度達(dá)到10% 20% ；(2)酶解反應(yīng)將步驟(1)制得的殼聚糖溶液按20 80U/g的比例加入殼聚糖水解酶，在攪拌 下，控制pH 4. 2 4. 8和溫度40°C 50°C反應(yīng)5 24h，降解至目標(biāo)分子量后終止反應(yīng)，最 終得到濃度為10% 20%的酶解產(chǎn)物液；(3)反應(yīng)產(chǎn)物分離用堿液調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至7.0 8.0，靜置30min 60min，形成絮凝物，離心 3000 4000rpm或過濾去水不溶性殼聚糖及其他雜質(zhì)；(4)超濾分級采用截留分子量30，000 1，OOODa的超濾膜進(jìn)行分級處理，同時除去分子量大的 殼聚糖和酶蛋白成分，得到超濾透過液；(5)納濾濃縮脫鹽用截留分子量500Da的納濾膜對超濾透過液進(jìn)行濃縮和脫鹽處理，濃縮比為 1/3 1/4，采用稀釋過濾的方式，脫鹽次數(shù)為2 4次，脫鹽率達(dá)70% 90%。(6)真空濃縮在真空度大于0. 085MPa的條件下進(jìn)行濃縮，濃縮溫度控制在70°C以下，以避免褐 變產(chǎn)生，使得到的濃縮液中固形物含量達(dá)25%以上；(7)噴霧干燥將步驟(6)得到的濃縮液在進(jìn)風(fēng)溫度170 200°C、出風(fēng)溫度70 90°C下噴霧干 燥，得到淡黃色殼寡糖粉末狀產(chǎn)品。步驟(1)中殼聚糖粉末和水的質(zhì)量比為5 100。步驟(1)中第一次加入醋酸的量為水體積的2%，補(bǔ)加的醋酸量為需補(bǔ)加醋酸的溶液體積的2%。步驟(4)中截留的大分子殼聚糖返回反應(yīng)器繼續(xù)酶解。本發(fā)明的有益效果通過高速剪切分散機(jī)和酶解的促溶作用，可以有效提高酶反應(yīng)過程中的底物濃度。常規(guī)制備方法中底物濃度一般不超過5 %，本方法將殼聚糖的濃度提 高到了 10% 20%，相比已有報道方法可以有效縮短殼聚糖的溶解時間。強(qiáng)酸降解增溶因 要強(qiáng)酸高溫的條件，會引起產(chǎn)物色澤加深，形成副產(chǎn)物復(fù)雜，而本方法條件溫和、沒有副反 應(yīng)發(fā)生，產(chǎn)物色澤好、質(zhì)量高。本方法因底物濃度高，使酶法反應(yīng)得到的產(chǎn)物殼寡糖濃度增大，經(jīng)過后續(xù)處理可大大降低生產(chǎn)中的能耗水平，符合國際社會提倡的節(jié)能減排、低碳綠色 的科技發(fā)展趨勢，同時高底物濃度的酶法生產(chǎn)殼寡糖有助于縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)效率， 降低生產(chǎn)成本。采用本發(fā)明介紹的方法制備殼寡糖產(chǎn)品質(zhì)量高，本發(fā)明使得殼聚糖酶法制 備殼寡糖具有生產(chǎn)意義上的技術(shù)可行性和可操作性。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
進(jìn)行詳細(xì)說明，但實(shí)施例并不限制本發(fā) 明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1以殼聚糖250g和水5L加入到高速剪切分散機(jī)中，轉(zhuǎn)速1500rpm以上運(yùn)行Imin后 加入IOOmL冰醋酸，運(yùn)行5min后，加2500U殼聚糖水解酶，控制溫度在43°C 48°C之間，待 黏度下降至lOOOcp以下、pH > 4. 3時，3000rpm運(yùn)行，不斷補(bǔ)加殼聚糖粉末，并補(bǔ)加冰醋酸 進(jìn)行溶解，同時再按上述殼聚糖水解酶的用量補(bǔ)加殼聚糖水解酶，補(bǔ)加的醋酸量為需補(bǔ)加 醋酸的溶液體積的2%，直至最終殼聚糖溶液的濃度達(dá)10%，pH4. 6。將溶液加入殼聚糖水 解酶10000U，在溫度42°C 48°C，攪拌反應(yīng)24h。用5M NaOH調(diào)節(jié)體系的pH至7. 0，靜置 60min，形成絮凝物，3000rpm離心去除水不溶性殼聚糖及其他雜質(zhì)。將上清液通過截留分 子量1，0000的超濾膜，去除大分子殼聚糖和酶蛋白等，透過液經(jīng)截留分子量500Da的納濾 膜濃縮脫鹽，濃縮比為1/3 1/4，采用稀釋過濾的方式，脫鹽次數(shù)為2 4次，脫鹽率大于 75%。將濃縮液在真空度大于0. 085Mpa、溫度55°C條件下減壓濃縮，使產(chǎn)物固形物含量達(dá) 到25%，濃縮液在進(jìn)風(fēng)溫度180°C、出風(fēng)溫度80°C時噴霧干燥得到淡黃色殼寡糖粉末。實(shí)施例2以殼聚糖250g和水5L加入到高速剪切分散機(jī)中，轉(zhuǎn)速1500rpm以上運(yùn)行Imin后 加入IOOmL冰醋酸，運(yùn)行5min后，加12，500U殼聚糖水解酶，控制溫度在45°C 50°C之間， 黏度下降至lOOOcp以下，3000rpm運(yùn)行，不斷補(bǔ)加殼聚糖粉末，補(bǔ)加冰醋酸運(yùn)行溶解，補(bǔ)力口 殼聚糖水解酶，直至最終殼聚糖溶液的濃度達(dá)15%，pH 4.6。將溶液在溫度45°C 50°C， 加殼聚糖水解酶40，000U，攪拌反應(yīng)5h。其余處理步驟同實(shí)施例1。實(shí)施例3按照實(shí)施例1的步驟，繼續(xù)補(bǔ)加殼聚糖使其最終底物濃度達(dá)到20%，酶解反應(yīng)中 殼聚糖水解酶的用量為20，000U，pH4. 5，溫度43°C 48°C，反應(yīng)時間為24h。最后得到淺黃 色殼寡糖粉末。實(shí)施例4按照實(shí)施例3的步驟，制備20%的殼聚糖底物溶液，酶解反應(yīng)中殼聚糖水解酶的用量為80，000U，pH 4. 5，43°C 48°C，反應(yīng)時間為5h。最后得到淺黃色殼寡糖粉末。實(shí)施例5按照實(shí)施例3的步驟，殼聚糖投放總量10kg，酶的用量按比例增加，制備得到殼寡 糖粉末。
權(quán)利要求
一種快速溶解殼聚糖、以高底物濃度酶法制備殼寡糖的方法，其特征在于包括下列步驟(1)制備高底物濃度殼聚糖溶液以殼聚糖粉末和水加入到高速剪切分散機(jī)中，在轉(zhuǎn)速1500rpm以上運(yùn)行1～5min后，加入醋酸使其溶解，在溫度40℃～50℃時按10～50U/g的比例加入殼聚糖水解酶，運(yùn)轉(zhuǎn)待溶液黏度＜1000cp和pH＞4.3時，轉(zhuǎn)速3000rpm，添加殼聚糖，同時補(bǔ)加冰醋酸，再按上述殼聚糖水解酶的用量比例加入殼聚糖水解酶液，維持反應(yīng)體系的黏度＜1000cp，pH＜4.5，直至得到的殼聚糖溶液中殼聚糖底物濃度達(dá)到10％～20％；(2)酶解反應(yīng)將步驟(1)制得的殼聚糖溶液按20～80U/g的比例加入殼聚糖水解酶，在攪拌下，控制pH 4.2～4.8和溫度40℃～50℃反應(yīng)5～24h，降解至目標(biāo)分子量后終止反應(yīng)，最終得到濃度為10％～20％的酶解產(chǎn)物液；(3)反應(yīng)產(chǎn)物分離用堿液調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至7.0～8.0，靜置30min～60min，形成絮凝物，離心3000～4000rpm或過濾去水不溶性殼聚糖及其他雜質(zhì)；(4)超濾分級采用截留分子量30,000～1,000Da的超濾膜進(jìn)行分級處理，同時除去分子量大的殼聚糖和酶蛋白成分，得到超濾透過液；(5)納濾濃縮脫鹽用截留分子量500Da的納濾膜對超濾透過液進(jìn)行濃縮和脫鹽處理，濃縮比為1/3～1/4，采用稀釋過濾的方式，脫鹽次數(shù)為2～4次，脫鹽率達(dá)70％～90％。(6)真空濃縮在真空度大于0.085MPa的條件下進(jìn)行濃縮，濃縮溫度控制在70℃以下，以避免褐變產(chǎn)生，使得到的濃縮液中固形物含量達(dá)25％以上；(7)噴霧干燥將步驟(6)得到的濃縮液在進(jìn)風(fēng)溫度170～200℃、出風(fēng)溫度70～90℃下噴霧干燥，得到淡黃色殼寡糖粉末狀產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速溶解殼聚糖、以高底物濃度酶解制備殼寡糖的方法，其 特征在于步驟(1)中殼聚糖粉末和水的質(zhì)量比為5 100。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速溶解殼聚糖、以高底物濃度酶解制備殼寡糖的方法，其 特征在于步驟(1)中第一次加入醋酸的量為水體積的2%，補(bǔ)加的醋酸量為需補(bǔ)加醋酸的 溶液體積的2%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的快速溶解殼聚糖、以高底物濃度酶法制備殼寡糖的方 法，其特征在于步驟(4)中截留的大分子殼聚糖返回反應(yīng)器繼續(xù)酶解。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速溶解殼聚糖、以高底物濃度酶法制備殼寡糖的方法，采用一種高速剪切分散機(jī)使殼聚糖快速分散溶解形成高濃度底物溶液，并利用添加部分可降解殼聚糖的水解酶將溶液黏度變稀，可使反應(yīng)體系中殼聚糖底物的濃度提高到10％～20％。酶反應(yīng)完成后，產(chǎn)物溶液用超濾方法除去殼聚糖水解酶蛋白及殼聚糖大分子，透過液經(jīng)納濾濃縮脫鹽，再通過真空濃縮過程可使產(chǎn)物殼寡糖固形物含量達(dá)到20％～35％。最后，濃縮液經(jīng)噴霧干燥得到淡黃色殼寡糖粉末。本方法有效解決了殼聚糖溶解時間長、產(chǎn)生的溶液濃度低，從而造成因低底物濃度反應(yīng)而引起的高能耗問題，大大降低了后續(xù)處理如分離純化、濃縮、干燥等過程中的能耗水平，減少了生產(chǎn)成本。
文檔編號C12P19/12GK101845471SQ20101017220
公開日2010年9月29日 申請日期2010年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月12日
發(fā)明者夏文水, 姜啟興, 彭秀蘭, 梁雙林, 白云鵬 申請人:江蘇雙林海洋生物藥業(yè)有限公司;江南大學(xué)