一種植物抗逆性相關膜蛋白BjCRP1及其基因和應用的制作方法

文檔序號：583520閱讀：396來源：國知局

專利名稱：一種植物抗逆性相關膜蛋白BjCRP1及其基因和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程領域，具體地，本發明涉及一種植物抗逆性相關膜蛋白 BjCRPl及其基因和應用。
背景技術：
印度芥菜(Brassica juncea)是目前篩選出的一種生長快、生物量大的Cd、Zn、 Pb忍耐-富集型植物。雖然它體內累積Cd能力沒有目前世界上公認的Zn、Cd超累積植物 Thlaspi caerulescens高，但其生長速率和地上部生物量遠遠高于Thlaspicaerulescens，因而相同條件下印度芥菜對Cd的吸收總量高于Thlaspi caerulescens，在植物修復中具有更大的潛力。植物超富集重金屬機理主要涉及植物對金屬離子高的吸收、運輸能力，區域化作用及螯合作用等方面，其中跨膜運載蛋白的表達、調控對重金屬超富集這一特性起了關鍵作用。目前許多在金屬離子的區域化(如在液泡內)或胞外輸出起作用的膜運載蛋白基因和基因家族被鑒定出來，如 CPx 型 ATP 酶(Williams et al. ,Biochim BiophysActa，2000， 1465 104-126), NRAMP 家族成員(Vidal et al.，Cell, 1993,73 :469_485)、CE 家族成員 (Pence et al. , Proc Natl Acad Sci USA, 2000,97 4956-4960 ；Persans et al. , Proc Natl Acad Sci USA, 2001,98 :9995_10000)、ATP 結合和運載蛋白(ABC 運載蛋白)(Rea，Exp Bot，1999，50 :895-913)、雙價陽離子P質子反向運載蛋白如擬南芥的CAX(Hirschi，Plant Cell,1999，11 2113-2122)和 AtMHXl(Shaul et al.，EMBO J,1999，18 :3973_3980)。

發明內容
本發明的目的是提供一種植物抗逆性相關膜蛋白及其編碼基因。本發明另一目的是提供包括上述基因的重組載體。本發明的再一目的是提供上述蛋白和基因的應用。根據本發明的植物抗逆性相關膜蛋白BjCRPl的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。根據本發明的植物抗逆性相關基因，其編碼上述膜蛋白BjCRPl，例如，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。根據本發明的重組載體包含上述基因，例如，所述載體為pET32a_BjCRPl。根據本發明的蛋白可以用于提高植物的抗重金屬、抗鹽、抗旱性。根據本發明的基因可以用于提高植物的抗重金屬、抗鹽、抗旱性。因此，根據本發明的提高植物抗重金屬、抗鹽、抗旱的方法包括將上述基因轉入植物、并表達的步驟。實驗結果表明，在含有不同濃度的CdCl2培養基中，含空載體pET32a的BL21生長情況明顯不如含重組載體pET32a-BjCRPl的BL21的生長情況。0. 5mmol/L和1. 0mmol/L的 CdCl2處理時，BL21 (pET32a-BjCRPl)達到生長高峰時0D600的值分別為0. 9143和0. 4514，而BL21(pET32a)在同樣的條件下達到生長高峰時0D600值僅為0. 3014和0. 1494。當CdCl2濃度為1.5mmol/L時，BL21 (pET32a_BjCRPl)和BL21 (pET32a)的均不能正常生長，這表明了 BL21 (pET32a-BjCRPl)耐受 CdCl2 的最高值為 1. 5mmol/L。在含不同濃度NaCl的LB液體培養基中，在NaCl為0. 4mol/L時，脅迫時間達到5個小時之前，BL21 (pET32a)的生長明顯受到抑制，之后生長情況明顯好轉， BL21(pET32a-BjCRPl) 一直都處于對數生長期，基本不受NaCl的影響。BL21(pET32a)在 NaCl 濃度為 0. 6mol/L 和 0. 8mol/L 時，幾乎不能生長，BL21 (pET32a_BjJ10_2)在 NaCl 為 0. 6mol/L,生長高峰時 0D600 值為 0. 4743，在 NaCl 為 0. 8mol/L 時和 BL21 (pET32a) 一樣也不能生長。因此，認為BL21 (pET32a-BjJ10-2)耐受NaCl的臨界值是0. 8mol/L。不同濃度PEG6000溶液脅迫處理的結果表明，PEG6000的濃度在10 % -20 % 時，重組菌和對照菌均能正常生長，重組菌生長略優于對照菌，但不如對NaCl和CdCl2 的抗性明顯，說明BL21菌株本身具有一定的抗PEG脅迫能力。當PEG濃度為30%時， BL21 (pET32a-BjJ10-2)和BL21 (pET32a)生長明顯受到抑制，但濃度差異不大，表明重組菌 BL21 (pET32a-BjJ10-2)抗PEG脅迫的能力較弱。BjCRPl轉基因煙草的重金屬Cd和高鹽NaCl脅迫實驗表明，與空載體對照相比過表達BjCRPl顯著提高了轉基因植株抗重金屬Cd(200 u M/L)和NaCl (250mmol/L)的脅迫能力。而在正常培養條件下二者無明顯差異。說明BjCRPl基因的表達能使重組菌株和植物同時獲得顯著的抗重金屬(CdCl2) 和抗高鹽(NaCl)特性，目前功能顯著的既抗重金屬又抗高鹽的植物基因還少有報道。該抗性的證明為BjCRPl基因在植物抗逆基因工程中的應用提供了基礎，將在培育綜合抗逆性 (重金屬和/或高鹽/或/干旱)增強的植物(小麥、玉米、水稻和蔬菜)中發揮重要作用。

圖1 :BjCRPl推測的跨膜結構域(TMHMM軟件)。圖2 :BjCRPl基因完整開放閱讀框的RT-PCR擴增結果。圖3 克隆產物PGM-BjCRPl酶切電泳檢測結果。圖4 重組子PET-BjCRPl酶切電泳檢測結果。圖5 :BjCRPl原核表達蛋白的PAGE圖譜，第1_5泳道分別為IPTG誘導0h、2h、4h、 6h和8h的蛋白上清表達量；第6-9泳道分別為IPTG誘導0h、2h、4h和6h的蛋白沉淀表達量，為可以看出該蛋白為融合蛋白，上清表達量明顯大于沉淀，該蛋白為27. 5道爾頓，箭頭所指為表達的該蛋白。圖6 :BjCRPl原核表達上清蛋白的PAGE圖譜，第1_5泳道分別為IPTG誘導0h、2h、 4h、6h和8h的蛋白上清表達量，第6泳道為BL21空菌株經IPTG誘導6h的表達量，第7泳道為BL21 (pET32a)經IPTG誘導6h的表達量可以看出該蛋白在經IPTG誘導6小時后表達量達到最大，箭頭所指為表達的該蛋白。圖7 半定量RT-PCR檢測BjCRPl基因在不同脅迫條件下的轉錄豐度，5_6片葉齡的印度芥菜分別用 200 u M CdCl2、250mMNaCl、1000 u M ZnCljP 20% PEG6000 處理 12h，與對照無脅迫處理進行比較。發現BjCERPl基因在葉部顯著響應重金屬(Cd、Zn)和高鹽(NaCl) 及干旱PEG的脅迫而增強表達，在根部，除Cd脅迫外，其它脅迫均使BjCRPl基因轉錄水平
顯著增強表達。
圖 8 非脅迫和不同濃度 CdCl2 脅迫下 BL21 (pET32a)與 BL21 (pET32a_BjJ10_2) 的生長曲線，(a)非脅迫條件下BL21 (pET32a)與BL21 (pET32a-BjCRPl)的生長曲線；(b)0. 5mmol/L CdCl2 脅迫下 BL21 (pET32a)與 BL21 (pET32a_BjCRPl)的生長曲線；(c) 1. Ommol/L CdCl2 脅迫下 BL21 (pET32a)與 BL21 (pET32a_BjCRPl)的生長曲線； (d) 1. 5mmol/L CdCl2 脅迫下 BL21 (pET32a)與 BL21 (pET32a_BjCRPl)的生長曲線。圖9 不同濃度NaCl 脅迫下BL21(pET32a)與 BL21 (pET32a_BjJ10_2)的生長曲線， (a)0. 4mol/L NaCl脅迫下BL21 (pET32a)與BL21 (pET32a_BjCRPl)的生長曲線；(b)0. 6mol/ L NaCl 脅迫下 BL21(pET32a)與 BL21 (pET32a_BjCRPl)的生長曲線；(c) 0. 8mol/L NaCl 脅迫下 BL21(pET32a)與 BL21 (pET32a_BjCRPl)的生長曲線。圖 10 不同濃度PEG6000脅迫下BL21 (pET32a)與BL21 (pET32a_BjCRPl)的生長曲線，(a) 10% PEG6000 月辦迫下 BL21 (pET32a)與 BL21 (pET32a_BjCRPl)的生長曲線；(b)20% PEG6000 脅迫下 BL21 (pET32a)與 BL21 (pET32a_BjCRPl)的生長曲線；(c)30% PEG6000 脅迫下 BL21(pET32a)與 BL21 (pET32a_BjCRPl)的生長曲線。圖11 :pBI121-BjCRPl-GFP表達質粒的結構示意圖，nos-pro，胭脂堿合成酶啟動子；Nptll，新酶素磷酸轉移酶基因；nos-ter，胭脂堿合成酶終止子；CaMV 35S Pro，花椰菜花葉病毒35S啟動子；GFP，綠色熒光蛋白基因；RB，右臂；LB，左臂。圖12 植物表達載體重組子pBI121-BjCRPl_GFP酶切電泳檢測結果，M，lOObpDNA 分子量Marker ；1-4,分別為4個重組克隆質粒的酶切鑒定結果，其中克隆3含正確BjCRPl 插入片段。圖13 半定量RT-PCR檢測轉化煙草植株整合的BjCRPl基因轉錄水平上獲得表達，1，2，兩個獨立的pBI121-BjCRPl-GFP轉基因株系；3，野生型煙草；4，pBI121_GFP轉基因煙草。用特異引物擴增報告基因GFP約800bp片斷，循環數為25，Actin為看家基因，用來控制上樣模板量。圖14 在200 u M CdCl2脅迫條件下，BjCRPl與空載體轉基因煙草外植體分化再生苗能力比較。圖14(a)無CdCl2* 200iiMCdCl#§養條件下不同基因型分化再生苗示例，圖 14 (b)無CdCl2和200 u MCdCl2培養條件下不同基因型分化再生苗數據分析。圖15 在200 u M CdCl2和250mM NaCl脅迫條件下不同基因型轉基因煙草生長15 天的莖葉與生根情況的比較。
具體實施例方式下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。實施例1 植物抗逆性相關蛋白BjCRPl及其編碼基因的獲得根據印度芥菜及近緣物種RAMP4家族保守區核苷酸序列設計引物如下5’ -CGCGG ATCCGTTATCTGCAATTATGACAAC-3’ (F)(下劃線是 BamH I 的酶切位點)，5，CCGCTCGAGTTATGA CATGCCTCCGCTAG-3，(R)(下劃線是Xho I的酶切位點)。經含200 u mol CdCl2的l/2H0agland’ s營養液脅迫的印度芥菜幼苗，提取總RNA。用PrimeScript TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 并按試劑盒說明書進行操作取1-5 u g印度芥菜總RNA，得到第一條鏈cDNA。取1 ill步驟3)獲得的反轉錄產物為模板，在5’端引物和3’端引物的引導下，用
5PCR的方法合成BjCRPl的cDNA。反應結束后，對PCR產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到分子量約為250bp的條帶，與預期結果相符，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(上海生工)回收該片段。將該回收片段與載體PGM-T連接，將連接產物轉化大腸桿菌T0P10感受態細胞，根據PGM-T載體上的羧芐青霉素抗性標記篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質粒，命名PGM-BJJ10-2。以該重組質粒載體上的T7和SP6啟動子序列為引物對其進行核苷酸序列測定測序結果表明擴增到得BjCRPl開放讀碼框(0RF)共207個堿基，編碼具有68個氨基酸的蛋白質，TMHMM軟件推測BjCRPl的跨膜結構域如圖1所示，第38位至第60位氨基酸為跨膜區，N端1-37位氨基酸在膜內，C端61-68位氨基酸在膜外。實施例2原核表達載體的構建和表達蛋白檢測1、原核表達載體PET-BjCRPl的構建將測序正確的含BjCRPl基因片段的PGM-T直接用BamH I、Xho I兩種酶進行雙酶切，回收酶切片段與用BamH I、Xho I兩種酶進行雙酶切過的克隆載體pET32_a (+)連接，轉化大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS,并通過質粒酶切鑒定，篩選出陽性克隆并進行測序，從中篩選出序列沒有突變的pET-BjCRPl重組子。2、BjCRPl表達蛋白檢測將重組質粒，空質粒均轉入到大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中，分別挑取含有 pET-BjCRPl質粒、含空質粒以及不含質粒的空菌株，加入10mL LB液體培養基(含相應抗生素)在滅菌的三角瓶中37°C 200rpm過夜培養；將菌液按1 50稀釋，加入終濃度為0. 2% 的葡萄糖，繼續37°C 200rpm培養2h，使之0D600達到0. 5-0. 6，收集lmL菌液備用。加入終濃度為1. OmM的IPTG，在37°C誘導表達0h、2h、4h、6h和8h，各收集菌液lmL，離心后棄上清留菌體置于-20°C備用。取出-20°C保存的菌體，加入100 ill 10mM Tris-HC1(PH8. 0)，冰上放置；再加
巰基乙醇，混勻；超聲波處理50次；12000rpm，4°C離心15min，去上清和沉淀；沉淀加入100 u 1 10mMTris-HCl (PH8. 0)和2 yl 2% 0 -巰基乙醇混勻充分，再加入20 u 1 4X上樣緩沖液，上清直接加入20 yl 4X上樣緩沖液。將蛋白樣品(菌液)溶入上樣緩沖液中，置于沸水中lOmin，離心lOsec ；分別配置 12%的分離膠，5%的濃縮膠，待其室溫聚合完畢后拔出梳子并上樣；濃縮膠部分以80V恒壓，分離膠部分以120V恒壓電泳。待溴酚藍電泳至凝膠底部后，停止電泳，然后剝膠、固定和染色、脫色。BjCRPl原核表達蛋白的PAGE圖譜如圖5所示，BjCRPl原核表達上清蛋白的 PAGE圖譜人圖6所示，經IPTG誘導6h的表達量可以看出該蛋白在經IPTG誘導6小時后表達量達到最大，箭頭所指為表達的該蛋白。實施例3半定量RT-PCR檢測BjCRPl在重金屬、高鹽和干旱脅迫條件下的轉錄豐度變化選取5-6片葉齡的印度芥菜幼苗分別用200 iiM CdCl2、250mMNaCl、1000 ii MZnCl2 和20% PEG6000處理12h后，與對照無脅迫處理的苗子用無菌水進行漂洗2_3次后，迅速根葉分離，液氮速凍進行總RNA提取。分別用BjCRPl特異引物上游引物5，-TTTTGTTCCTGA GACCACCAC-3，；下游引物 5，-TATGACATGCCTCCGCTAG-3，和肌動蛋白 0-Actin 引物上游引物5，-CTTAACCCTAAGGC
6TAACAG-3’ ；下游引物5，-TCCTCCGATCC AGACACT-3，進行擴增。3 -Actin 作為內參，以控制模版量的一致。首先用1 P 1對照逆轉后的cDNA模板，分別用Actin引物和BjCRPl弓丨物進行分管PCR擴增。反應結束后，對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖7)。發現 BjCERPl基因在葉部顯著響應重金屬(Cd、Zn)和高鹽(NaCl)及干旱PEG的脅迫而增強表達，在根部，除Cd脅迫外，其它脅迫均使BjCRPl基因轉錄水平顯著增強表達。說明BjCERPl 基因不僅顯著響應重金屬(Cd，Zn)的脅迫上調表達，而且顯著響應高鹽(NaCl)和干旱因子 PEG的脅迫上調表達，在植物抗重金屬和鹽及干旱脅迫方面可能均扮演重要角色。實施例4重組大腸桿菌BL21 (pET32a-BjCRPl)的抗逆性分析將重組質粒pET32a-BjCRPl和對照空質粒pET32a分別轉化到表達菌株BL21 (DE3) plysS中，在含有氯霉素和氨芐霉素的瓊脂平板上篩選陽性菌落。分別挑取新活化的 BL21 (pET32a-BjCRPl)和對照BL21 (pET32a)單菌落，接種于LB培養基中，37°C下振蕩培養過夜。分別取過夜培養物按1 50比例接種到含有氯霉素和氨芐霉素的LB液體培養基中培養至0D600值均為0. 6用于脅迫實驗。1.重組大腸桿菌BL21(pET32a_BjCRPl)的抗重金屬脅迫。分別取BL21(pET32a-BjCRPl)和對照 BL21 (pET32a) 600 ii 1，加到含有 CdCl2 和抗生素的30ml LB液體培養基中，CdCl2終濃度分別為0. 5mmol/L、l. Ommol/LU. 5mmol/L,同時設置不含脅迫因素的對照，每個處理設置3個重復，37°C振蕩培養，每隔lh測定0D600值，共測9個小時。結果表明BL21 (pET32a-BjCRPl)和BL21 (pET32a)在不含脅迫因素的LB培養基中培養立即進入對數生長期，生長勢頭相當，達到生長高峰時的0D600值均在1. 7左右(圖 8a)，而當轉接到含有不同濃度的CdCl2培養基中時，BL21(pET32a)的生長情況明顯不如 BL21 (pET32a-BjCRPl) ,0. 5mmol/L 和 1. Ommol/L 的 CdCl2 處理時，BL21 (pET32a_BjCRPl) 達到生長高峰時0D600的值分別為0. 9143和0. 4514，而BL21 (pET32a)在同樣的環境下達到生長高峰時0D600值僅為0. 3014和0. 1494(圖8b，c)，同時也可以看出CdCl2處理的濃度增大，BL21(pET32a-BjCRPl)達到生長最高值的時間明顯縮短。當CdCl2濃度為 1. 5mmol/L 時，BL21 (pET32a_BjCRPl)和 BL21 (pET32a)的均不能正常生長(圖 8d)，這說明 BL21(pET32a-BjCRPl)耐受 CdCl2 的最高值在 1-1. 5mmol/L 之間。2.重組大腸桿菌 BL21 (pET32a-BjJ10_2)的 NaCl 脅迫。分別取BL21(pET32a-BjCRPl)和對照 BL21 (pET32a) 600 ii 1，加到含 NaCl 和抗生素的30mlLB液體培養基中，NaCl終濃度分別為0. 4mol/L、0. 6mol/L、0. 8mol/L,每個處理設置 3個重復，37°C振蕩培養，每隔lh測定0D600值，共9個小時。結果表明，在NaCl為0. 4mol/L時，脅迫時間達到5個小時之前，BL21 (pET32a)的生長明顯受到抑制，之后生長情況明顯好轉，BL21(pET32a-BjCRPl) 一直都處于對數生長期，基本不受 NaCl 的影響(圖 9a)。BL21 (pET32a)在 NaCl 為 0. 6mol/L 和 0. 8mol/L 時，幾乎不能生長，BL21 (pET32a-BjCRPl)在 NaCl 為 0. 6mol/L,生長高峰時 0D600 值為 0. 4743，基本為 BL21 (pET32a)的 3 倍(圖 9b)，在 NaCl 為 0. 8mol/L 時和 BL21 (pET32a) 一樣也不能生長(圖9c)。因此，認為BL21 (pET32a-BjCRPl)耐受NaCl的臨界值是0. 8mol/L。3.重組大腸桿菌BL21(pET32a_BjCRPl)的干旱脅迫。分別取BL21 (pET32a-BjCRPl)和對照 BL21 (pET32a) 600ml，加到含 PEG6000 和抗生素的30mlLB液體培養基中，PEG6000終濃度分別為10%、20%、30%。37°C振蕩培養24h 后，再分別取脅迫后的菌液600 u 1轉接到30mlLB培養基中37°C下振蕩培養，每個處理設置 3個重復，每隔lh測定其0D600值。結果表明，PEG6000的濃度在10% -20%時，重組菌和對照菌均能正常生長，生長高峰時0D值均達到1. 0 (圖10a，b)，說明BL21菌株本身具有一定的抗PEG脅迫能力，但重組菌生長略優于對照菌。當PEG濃度為30%時，BL21(pET32a-BjCRPl)和BL21 (pET32a)生長明顯受到抑制，但濃度差異不大(圖10c)，表明重組菌BL21 (pET32a-BjCRPl)表明重組菌 BL21 (pET32a-BjJ10-2)抗PEG脅迫的能力較弱。實施例5BjCRPl轉基因煙草的抗逆性分析步驟1 植物表達載體的構建與農桿菌轉化依據雙價載體pBI121-GFP (見圖11)上的多克隆限制性酶切位點Xbal/BamHI序列，設計了 BjCRPl 的 0RF 區 PCR 引物上游引物 5，-gggTCTAGAATGGTTATCTGCAATTATGACAAC-3’ ；下游引物 5’-ggcGGATCCTTATGACATGCCTCCGCTAG-3’ ，以原核表達載體PET-BjCRPl載體上的BjCRPl全長cDNA序列為模板分別擴增其0RF區域，擴增的DNA片段經Xbal/BamHI酶切后，與Xbal/BamHI雙酶切的pBI121_GFP載體進行環化連接，轉化感受態大腸桿菌DH5 a，在含有50 u g/mL卡那霉素的LB培養基上進行篩選。37°C過夜培養。分別挑取5_10個單克隆，培養擴增，提取質粒進行Xbal/BamHI雙酶切(圖12)，分別取含有插入片段的克隆進行測序 (上海生工)驗證，所測序列與已知序列一致，得到pBI121-BjCRPl-GFP植物表達載體，其中含有CaMV 35S組成性表達強啟動子和GFP綠色熒光蛋白報告基因，所表達的BjCRPl與 GFP構成融合蛋白。應用熱激法(TzVi Tzfira et al,Plant Molecular BiologyReporter, 1997，15 219-235)將 pBI121-BjCRPl_GFP 導入農桿菌(Agrobacteriatumefaciencs) EHA105中，在含有30 u g/mL利福平(Rif)和50 u g/mL卡那霉素(Kan)的LB培養基上進行篩選，并通過菌斑PCR技術對單克隆轉化農桿菌進行確證。步驟2 煙草轉化選用煙草品種W38 (Nicotiana tabacum c. v. W38)作為轉基因受體，采用葉盤法(Horsch RB et al, Science, 1985，227 :1229_1231)轉化煙草品種 W38。以 MS(Murashige&Shoog)為基本培養基，其中分化再生培養基為TQ :MS+lmg/L6-BA+0. lmg/ L NAA+100mg/L卡那霉素+250mg/L Cef (頭孢霉素)+8g/L瓊脂，PH5. 8 ；生根培養基為 1/2MS+0. lmg/L NAA+100mg/L 卡那霉素 +250mg/L Cef+8g/L 瓊脂，PH5. 8。挑取攜帶pB121-BjCRPl_GFP改良載體的農桿菌EHA105的單菌落，接種于5ml含 Rif20mg/1和Kan 50mg/L的YEB液體培養基中，28°C振蕩培養過夜。取活化過夜的農桿菌，按1 50的比例稀釋到含Rif30mg/L和Kan 50mg/L的LB液體培養基中，繼續培養至0D600 值大約為0. 6-0. 8。5000rpm離心5min，收集菌體，用1/2MS液體培養基洗滌菌體一次，并將其稀釋至0D600值0. 3-0. 35。選取約30天苗齡的煙草無菌苗，切下成熟葉片，用直徑6mm的打孔器制取葉盤外植體。將新制備的外植體投入已準備好的農桿菌菌液中，振蕩侵染15-20分鐘后，取出用濾紙吸干附著于葉盤表面的殘液，然后放在表面鋪有一層濾紙的不含抗生素的I培養基上暗處共培養兩天，然后再轉到L培養基上進行篩選培養，每隔2-3周用I；培養基繼代一次。待抗性芽長到1-1. 5cm時，將其切下換到培養基上誘導生根并獲得抗性植株。
選取3-4片葉齡的轉基因煙幼苗與野生型幼苗進行總RNA提取，和cDNA合成。用 GFP 上游引物 pi :5，-cccGGATCCAAGGAGATATAAC-3，和下游引物 p2 :5，-CCCGAGCTCTTATTTG TATAGTTCATCC-3，做PCR，反應體系25 y L反應體系，取cDNA模板1 y L，PCR反應的條件為 94°C預變性 lOmin ；94°C lmin，55°C 2min，72°C 2min，25 個循環；72°C延伸 lOmin。如圖 13， BjCRPl轉基因品系(泳道1，2)和空載體轉基因苗(泳道4)有GFP擴增片段約800bp，對照WT無擴增帶，說明融合基因BjCRPl-GFP已分別整合到煙草基因組中，并在轉錄水平上獲得表達。步驟3 :T0代煙草重金屬及鹽抗性分析重金屬Cd對轉基因植株組織培養分化再生的影響分別剪取約1cm2的空載體 (PBI121-GFP)及BjCRPl (pBI121-BjCRPl-GFP)轉基因植株葉片，接種于TQ分化培養基(附加有200iiM/L CdCl2)上，每瓶接種10片，各接種3瓶，25°C，16h/d光照培養。約35d (天) 后，計算分化苗個數(圖14)。圖14(a)示例在無Cd脅迫條件下，空載體與BjCRPl轉基因煙草外植體再生苗無明顯差異，而在200PM/L CdCl2脅迫條件下，BjCRPl過表達煙草再生苗明顯多于對照。圖 14(b)示空載體與BjCRPl轉基因煙草再生苗在正常和Cd脅迫條件下的統計分析。在正常培養條件下，對照與BjCRPl轉基因煙草再生苗數無差異(t檢測，p > 0. 05)，而在Cd脅迫條件下，BjCRPl轉基因煙草再生苗數顯著高于空載體對照生苗(t檢測，p < 0. 01)。重金屬和鹽脅迫條件下轉基因植株的抗性分析分別剪取約1cm2的空載體 (PBI121-GFP)及BjCRPl (pBI121-BjCRPl-GFP)轉基因植株葉片，接種于I；分化培養基上， 25V，16h/d光照培養。待再生植株長至2-3cm時挑選整齊一致的再生苗，分別接種于1\， Tl+200 u M CdCl2和Tl+250mM NaCl生根培養基，每瓶接種4-5棵，各接種3瓶。15天后觀察長勢和生根情況(圖15)。圖15示例在重金屬CdCl2和NaCl脅迫條件下，BjCRPl轉基因煙草長勢生根情況明顯優與空載體對照。過表達BjCRPl煙草在脅迫條件下，根部已有許多根再生，空載體對照幾乎無根再生出。在正常培養條件下，二者無明顯差異，根部均有大量根生出。說明過表達BjCRPl明顯提高了轉基因煙草的抗重金屬Cd和高鹽NaCl的脅迫能力。
權利要求
一種植物抗逆性相關膜蛋白BjCRP1，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一種植物抗逆性相關基因，其特征在于，編碼權利要求1所述的膜蛋白BjCRPl。
3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示 o
4.包含權利要求2所述基因的重組載體。
5.根據權利要求4所述重組載體，其特征在于，所述載體為pET32a-BjCRPl。
6.權利要求1所述蛋白在提高植物抗重金屬、抗鹽、抗旱方面的應用。
7.權利要求2所述基因在提高植物抗重金屬、抗鹽、抗旱方面的應用。
8.一種提高植物抗重金屬、抗鹽、抗旱的方法，其特征在于，所述方法包括將權利要求 2所述基因轉入植物、并表達的步驟。
全文摘要
本發明涉及植物基因工程領域，具體地，本發明涉及一種植物抗逆性相關膜蛋白BjCRP1及其基因和應用。根據本發明的植物抗逆性相關膜蛋白BjCRP1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。BjCRP1基因的表達能使重組菌株和植物同時獲得顯著的抗重金屬(CdCl2)和抗高鹽(NaCl)特性，目前功能顯著的既抗重金屬又抗高鹽的植物基因還少有報道。該抗性的證明為BjCRP1基因在植物抗逆基因工程中的應用提供了基礎，將在培育綜合抗逆性(重金屬和/或高鹽/或/干旱)增強的植物(小麥、玉米、水稻和蔬菜)中發揮重要作用。
文檔編號C12N15/63GK101851284SQ20101017191
公開日2010年10月6日申請日期2010年5月7日優先權日2010年5月7日
發明者楊學舉, 郎明林, 郝夢雨申請人:河北農業大學

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