用于檢測Hg²⁺的核酸納米金生物傳感器的制作方法

專利名稱：用于檢測Hg²⁺的核酸納米金生物傳感器的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物化學技術領域，涉及一種快速檢測Hg2+的生物傳感器。
背景技術：
目前汞檢測的主要方法是光譜法，包括原子(吸收、發射、熒光等)光譜方法以及 分光光度法等。近年來，原子光譜與電感耦合發射光譜的聯用，提高了檢測的靈敏度，拓寬 了檢測的線性范圍，而電感耦合等離子體質譜使檢測更加靈敏，數據分析更加方便。但是， 此類儀器較為昂貴，在大多數實驗室中的推廣應用因此受到限制。除光譜法外，以冠醚類小 分子為代表的化學傳感方法也有一定的發展，但尚有靈敏度低、可重復性差等不足之處，檢 測的可靠性和準確性也不足。近年來，納米材料的發展為解決這一問題提供了新的思路。納米金顆粒具有優異 的光學性質、電學性質、化學活性和生物兼容性，在生物領域得到廣泛應用。研究表明，納米 金溶液的顏色與納米金顆粒的間距以及納米金聚集體的大小有關。納米金顆粒的間距若 明顯超過其平均直徑，納米金呈分散狀態，宏觀上表現為紅色；該間距若小于平均直徑，則 納米金易團聚，呈聚集態，宏觀上表現為紫色到藍色。利用納米金的這種性質，可設計一系 列生化反應以改變納米金顆粒間的距離，從而實現對靶物質的檢測。最近，Ono等(Ono A, TogashlH. Angew Chem Int Ed, 2004,43 (33) 4300-4302)利用 Hg2+與 DNA 的特異性作用， 設計了一種新型生物傳感方法，通過檢測兩端標記的DNA探針結合Hg2+后產生的熒光變化 實現對Hg2+的特異性檢測。該方法具有較高的特異性，可排除實際樣品體系中大多數離子 的干擾，但是檢測靈敏度不高，而且需要進行DNA雙標記，還依賴于熒光儀器，檢測成本仍 然較高。

發明內容
本發明的目的是克服現有Hg2+檢測技術存在的問題和不足，提供了一種用于Hg2+ 快速檢測的新工具，即核酸納米金生物傳感器，利用Hg2+存在時，T-T堿基能夠互補配對的 原理，配合膠體金放大系統，用來檢測Hg2+，因而能快速檢測Hg2+、不需要儀器，使用方便，且 靈敏度高。本發明所述的一種用于檢測Hg2+的核酸納米金生物傳感器，包括檢測試紙條、檢 測核酸試劑和上樣緩沖液；所述檢測試紙條從左到右依次由固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素 膜和吸水紙組成；所述玻璃纖維上涂有納米金標記的第一核酸，其序列如SEQ ID NO. 1所示，該核酸 序列的5’端標記巰基并與膠體金顆粒偶聯，3’端標記生物素；所述硝酸纖維素膜上設有質控線和檢測線；質控線上固定有第三核酸，其序列如 SEQ ID NO. 3所示，該核酸序列的5’端標記生物素，與鏈霉親和素反應后，固定在硝酸纖維 素膜的質控線上；檢測線上固定有鏈霉親和素；
其中，第三核酸序列與第一核酸序列特異性互補；所述檢測核酸試劑含有第二核酸，其序列如SEQ ID NO. 2所示，從5’端開始第6 個堿基處與第一核酸序列有T-T堿基的錯配；所述檢測核酸試劑與待檢測溶液及上樣緩沖 液一起滴在所述樣品墊上；所述上樣緩沖液為4X核酸雜交液，含0. 6M氯化鈉，0. 06M檸檬酸鈉。根據本發明所述的核酸納米金生物傳感器的進一步特征，所述質控線與檢測線相 距 3-10mm。根據本發明所述的核酸納米金生物傳感器的進一步特征，所述固定于膠板上的樣 品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙的相鄰部分彼此重疊l_5mm。根據本發明所述的核酸納米金生物傳感器的進一步特征，所述膠體金的粒徑為 8-100nm。根據本發明所述的核酸納米金生物傳感器的進一步特征，所述的納米金的制備方 法包括選用粒徑為8-lOOnm的膠體金顆粒，膠體金采用常規的氯金酸煮沸還原法制備，通 過控制還原劑的量在0. 01%-0. 05%以及攪拌速度在1000-50000轉之間來控制顆粒粒徑。根據本發明所述的核酸納米金生物傳感器的進一步特征，所述的納米金與核酸序 列的偶聯與封閉老化的方法包括將巰基修飾的第一核酸序列加入到5倍體積濃縮的納米 金溶液中，混合，在4-37°C反應10-24小時，用牛血清白蛋白封閉多余的活性位點，30分 鐘后加入NaCl和SDS使其終濃度分別至0. 15M和0. 01 %，老化10-20小時后，10000-16000 轉/分鐘離心20-60分鐘，棄上清，即可獲得所述的納米金標記寡核苷酸探針，將此納米金 標記寡核苷酸探針沉淀用重懸液重新懸浮，4°C保存。根據本發明所述的核酸納米金生物傳感器的進一步特征，所述的樣品墊是經過以 下處理的采用含TritonX-100、硼酸、PEG4000、BSA、蔗糖的混合液浸泡玻璃纖維4個小時 后，37 °C烘干過夜。本發明的技術原理是根據當Hg2+存在時，T-T堿基能夠互補配對的原理，設計特 異的核酸序列，用來檢測溶液中Hg2+的存在。本發明一共設計3條核酸序列核酸序列1共 有36個堿基，兩端互補配對，形成一個頸環結構，稱為Molecular Beacon (MB) 0此序列5’ 端標記巰基，3’端標記生物素，5’端巰基能與膠體金顆粒通過靜電結合，裝配在膠體金顆粒 表面。裝配好核酸的膠體金顆粒噴在金標墊上。核酸序列2為靶序列DNA，共24個堿基，此 序列從5’端開始第6個堿基處與MB序列有T-T堿基的錯配。此DNA溶液與要檢測的溶液 一起滴在樣品墊上，當待檢溶液中沒有Hg2+存在時，靶序列DNA不能與MB序列完全互補配 對，從而不能將MB的頸環打開，標記在MB —端的生物素不能被釋放出來，不能與T線上的 鏈霉親和素反應，從而T線不顯色，只有C線顯色；當檢測溶液中有Hg2+存在時，Hg2+的存在 使得錯配的T-T堿基能夠互補配對，從而將MB的頸環結構打開，隱蔽在膠體金顆粒表面的 生物素被暴露出來，與標記在T線上的鏈霉親和素結合，使膠體金停留在T線上，T線顯色， 同時C線也顯色。核酸序列3為對照序列，共30個堿基，與MB序列完全互補配對。此序列 5’端標記生物素，與鏈霉親和素反應后，劃在硝酸纖維素膜的質控線上。當金標墊上的膠體 金顆粒被釋放出來的時候，膠體金顆粒上標記的核酸序列1與質控線上的核酸序列3結合， 從而使得質控線顯色。本發明的優點在于巧妙的利用分子信標能分辨單核苷酸錯配以及Hg2+存在時能
4使T-T堿基互補配對的原理，設計出了一種高靈敏度、低費用、不需要使用任何儀器的膠體 金試紙條生物傳感器。既解決了以往檢測方法中需要大型儀器的缺陷，又能保證檢測靈敏 度，而且制備簡便、檢測迅速，不需要專業的技術人員。


圖1為本發明所述的核酸納米金生物傳感器對于Hg2+標準溶液梯度的檢測實驗結 果；圖2為本發明所述的核酸納米金生物傳感器對于不同金屬離子的檢測實驗結果。
具體實施例方式實施例一本發明所述的核酸納米金生物傳感器的制備1、三種核酸序列的設計根據本發明的技術原理，設計的三段核酸序列是核酸序列1 :SEQ ID NO. 15，-巰基修飾-ACACGCTAATCAAGCTTTAACTCATAGTTAGCGTGT-3，生物素修飾核酸序列2 :SEQ ID NO. 25， -ACGCTTACTATGAGTTAAAGCTTG-3，核酸序列3 :SEQ ID NO. 35，-生物素修飾-ACGCTAACTATGAGTTAAAGCTTGCTTAAG-3，2.納米金(膠體金)的制備向250ML的圓底燒瓶中稱取100g 0. 01 %的HAuCL4溶液，磁力攪拌加熱至沸騰； 然后向上述溶液中迅速加入4ml 的檸檬酸三鈉，溶液變為紅色后，繼續煮沸lOmin，停 止加熱繼續攪拌直至冷卻；膠體金溶液4°C避光保存，納米金通過520nm最大吸光度值鑒定。金標核酸的制備用100 ill去離子水溶解10D核酸序列1，加入到1ml 5倍體積濃縮的膠體金溶液 中，4°C 24小時；的牛血清白蛋白封閉30分鐘后，加入NaCl和的SDS，分別至終濃 度為0. 15M和0. 01 %，4°C過夜，11500轉/分鐘離心20分鐘，棄上清，沉底用500ul重懸液 (20mM Na3P04,5%BSA,0. 25% Tween，和10%蔗糖)重懸，重復洗三遍后用200ul的重懸液 重新懸浮，制成懸浮液。3.樣品墊的處理玻璃纖維浸泡含有TritonX-100、硼酸、PEG4000、BSA、蔗糖的溶液后，37°C烘干備用。4.金標墊的制備將本發明制備的金標核酸序列1涂于玻璃纖維上，37°C干燥2個小時，制成金標
墊，備用。5.硝酸纖維素膜上質控線和檢測線的處理用32iU去離子水溶解10D生物素標記的核酸序列3，使其濃度為100 y M，取 15 ill 100iiM的核酸序列3，加入15ia(lmg/ml)鏈和親霉素，室溫下反應2小時后，采用
5劃膜噴金儀涂于硝酸纖維素膜質控線上，37°C干燥兩個小時。用30ia(lmg/ml)鏈霉親和素，采用劃膜噴金儀涂于硝酸纖維素膜檢測線上， 37 °C干燥兩個小時。6.膠體金試紙條的組裝將固定有寡核苷酸探針的硝酸纖維素膜、吸水紙、涂有納米微粒標記寡核苷酸探 針的玻璃纖維、樣品墊依次固定于膠板上，相鄰部分彼此重疊2mm，經切割成寬4mm后即得 到本發明所述的核酸納米金生物傳感器。實施例二 本發明所述的核酸納米金生物傳感器的質量控制與檢測效果采用實施例一所制成的核酸納米金生物傳感器，進行以下實驗，驗證其檢測效果。1.配制 Hg2+ 標準溶液梯度,濃度分別為 1 P M、500nM、100nM、50nM、20nM、10nM。2.配制 100nM 的 Hg2+、Mn2.、Cd2+、Pb2+、Mg2+、Zn2\ Fe2\ Ca2\ Fe3\ Al3+、Ag+ 溶液。3.用去離子水溶解10D核酸序列2，使其濃度為lOOnM。4.取10 ill上述核酸序列2與90 ill待檢的Hg2+溶液混合，滴于上述納米金生物 傳感器的樣品墊上，10分鐘可判斷結果。(見圖1)結果顯示隨著Hg2+濃度的增加，檢測線條帶越來越深，肉眼可見(圖1左)，用金 標試紙條讀數儀的結果也一致，隨著Hg2+濃度的增加，檢測線的曲線也逐漸增大(圖1右)， 質控線顯色。5.取10 ill上述核酸序列2與90 ill待檢的其他離子溶液混合，滴于上述納米金 生物傳感器的樣品墊上，10分鐘可判斷結果。(見圖2)結果顯示在lOOnM濃度下，只有Hg2+存在時，檢測線顯色，其他離子均不顯色，肉 眼可見(圖2左)，用金標試紙條讀數儀的結果也一致，只有Hg2+存在時，檢測線有曲線，其 他離子存在時，檢測線沒有曲線(圖2右)，質控線顯色。質量控制標準(1)C線(質控線)出現紅色的線證明納米金生物傳感器有效。(2)T線(檢測線)出現紅色的線與否，是陽性陰性判別的標準。結果判定標準(1)C線出現紅色的線，同時T線出現紅色的線，說明被檢樣品中Hg2+含量超標；(2)C線出現紅色的線，同時T線沒有出現紅色的線，說明被檢樣品中Hg2+含量沒 有超標；(3) C線沒有出現紅色的線，說明納米金生物傳感器失效。
權利要求
一種用于檢測Hg2+的核酸納米金生物傳感器，其特征在于包括檢測試劑條、檢測核酸試劑和上樣緩沖液；所述檢測試紙條從左到右依次由固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙組成；所述玻璃纖維上涂有納米金標記的第一核酸，其序列如SEQ ID NO.1所示，該核酸序列的5’端標記巰基并與膠體金顆粒偶聯，3’端標記生物素；所述硝酸纖維素膜上設有質控線和檢測線；質控線上固定有第三核酸，其序列如SEQ ID NO.3所示，該核酸序列的5’端標記生物素，與鏈霉親和素反應后，固定在硝酸纖維素膜的質控線上；檢測線上固定有鏈霉親和素；其中，第三核酸序列與第一核酸序列特異性互補；所述檢測核酸試劑含有第二核酸，其序列如SEQ ID NO.2所示，從5’端開始第6個堿基處與第一核酸序列有T-T堿基的錯配；所述檢測核酸試劑與待檢測溶液及上樣緩沖液一起滴在所述樣品墊上；所述上樣緩沖液為4X核酸雜交液，含0.6M氯化鈉，0.06M檸檬酸鈉。
2.根據權利要求1所述的核酸納米金生物傳感器，其特征在于所述質控線與檢測線 相距 3-10mm。
3.根據權利要求1所述的核酸納米金生物傳感器，其特征在于所述固定于膠板上的 樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙的相鄰部分彼此重疊l_5mm。
4.根據權利要求1所述的核酸納米金生物傳感器，其特征在于所述膠體金的粒徑為 8-100nm。
5.根據權利要求1所述的核酸納米金生物傳感器，其特征在于，所述的納米金的制備 方法包括選用粒徑為8-lOOnm的膠體金顆粒，膠體金采用常規的氯金酸煮沸還原法制備， 通過控制還原劑的量在0. 01% -0. 05%以及攪拌速度在1000-50000轉之間來控制顆粒粒徑。
6 根據權利要求1所述的核酸納米金生物傳感器，其特征在于，所述的納米金與核酸 序列的偶聯與封閉老化的方法包括將巰基修飾的第一核酸序列加入到5倍體積濃縮的 納米金溶液中，混合，在4-370C反應10-24小時，用1 %牛血清白蛋白封閉多余的活性位 點，30分鐘后加入NaCl和SDS使其終濃度分別至0. 15M和0. 01 %，老化10-20小時后， 10000-16000轉/分鐘離心20-60分鐘，棄上清，即可獲得所述的納米金標記寡核苷酸探針， 將此納米金標記寡核苷酸探針沉淀用重懸液重新懸浮，4°C保存。
7.根據權利要求1所述的核酸納米金生物傳感器，其特征在于，所述的樣品墊是經過 以下處理的采用含TritonX-100、硼酸、PEG4000、BSA、蔗糖的混合液浸泡玻璃纖維4個小 時后，37°C烘干過夜。
全文摘要
本發明涉及一種用于檢測Hg2+的核酸納米金生物傳感器，包括檢測試紙條、檢測核酸試劑和上樣緩沖液；檢測試紙條從左到右依次由固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙組成；玻璃纖維上涂有納米金標記的第一核酸；硝酸纖維素膜上設有質控線和檢測線；質控線上固定有第三核酸，該核酸序列的5’端標記生物素，與鏈霉親和素反應后，固定在硝酸纖維素膜的質控線上；檢測線上固定有鏈霉親和素；第三核酸序列與第一核酸序列特異性互補；檢測核酸試劑含有第二核酸，從5’端開始第6個堿基處與第一核酸序列有T-T堿基的錯配。本發明所述的核酸納米金生物傳感器能快速檢測Hg2+、不需要儀器，使用方便，且靈敏度高。
文檔編號C12Q1/68GK101851677SQ20101016977
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月30日 優先權日2010年4月30日
發明者列浦昌, 方志遠, 曾令文, 蕭卓, 頓博影, 黃婧 申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院