專利名稱：用于檢測egfr基因拷貝數和7號染色體倍性的試劑的制作方法
技術領域：
本發明屬生命科學和生物技術領域，特別是一種用于檢測表皮生長因子受體 (epidermal growth factor receptor, EGFR)基因拷貝數和7號染色體倍性的試劑。
背景技術：
在我國，無論男性還是女性，肺癌均已成為癌癥死亡的主要原因。肺癌高死亡率的 主要原因有二個一是肺癌缺乏有效的早期診斷手段，70%以上的病人在確診時已屬晚期； 二是晚期肺癌(尤其是非小細胞肺癌，NSCLC)對化療的敏感性差，現有的各種化療方案對 NSCLC的總體有效率僅為30%左右。Gefitinib (即易瑞沙)是一種苯胺喹唑啉化合物，是強有力的選擇性酪氨酸激酶 抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI)，可阻斷表皮生長因子受體誘導的體外腫瘤細 胞的生長。期臨床試驗顯示，Gefitinib對標準治療失敗的部分NSCLC有良好療效。值得 注意的是，患者對Gefitinib的治療反應差別很大，因此，研究肺癌患者不同治療反應的機 制以及篩選能從治療中獲益的患者有重要的臨床意義。表皮生長因子受體(印idermal growth factor儀(3印忉1~』6 1 )又稱昍1 -1，其基 因組定位于人類7號染色體，在多種上皮性腫瘤高表達，其過表達與腫瘤細胞的增殖、活動 性、粘連性、侵襲性、凋亡抑制和血管生成相關，最終導致細胞的轉化、增殖，抵抗細胞凋亡、 促進細胞生存，與腫瘤的發生、發展、臨床分期、生存期、預后和對治療反應相關。馬薩諸塞總醫院癌癥中心(Massachusetts General Hospital Cancer Center, MGHCC)的 Lynch 等以及達納法伯癌癥研究所(Dana Farber Cancer Institute, DFCI)的 Paez等研究發現有變異EGFR基因的患者表現出對gefitinib更好的治療反應。但是， Danafarber癌癥研究所的Bruce Johnson (首先報道EGFR突變的研究者之一)表示，在臨 床試驗中，從抑制劑治療中獲益的患者超過了僅有EGFR突變的人數。這些新的結果提示， 測定EGFR基因拷貝數在選擇治療時可能起著一定的作用。另有研究顯示，EGFR基因突變和 拷貝數增加兩種改變同時存在的患者使用酪氨酸激酶抑制劑的療效顯著，說明對EGFR基 因拷貝數和基因突變進行聯合檢測可能更有助于藥物敏感性和預后的判斷。因此，在臨床 上無論是檢測EGFR基因突變，還是檢測基因拷貝數增加，對于患者用藥的選擇及預后判斷 都有著重要的意義，即通過FISH方法檢測EGFR基因擴增陽性患者選擇使用TKI類藥物可 取得較好的臨床療效。熒光原位雜交(Fluorescencein situ hybridization，FISH)是在原有的放射性 原位雜交技術基礎上發展起來分子細胞遺傳學技術。其基本原理是通過熒光標記的DNA探 針與待測樣本的DNA進行原位雜交，在熒光顯微鏡下對熒光信號進行辨別和計數，從而對 染色體和基因異常的細胞、組織樣本進行檢測和診斷。FISH技術操作簡便，檢測快速，結果 直觀易于觀察；具有有效的靈敏度和特異性，能檢測到一些常規遺傳學分析不能發現基因 的變異，而且重復性好。因此，FISH基因已廣泛應用于基因組結構研究、染色體精細結構變 異分析、病毒感染分析、人類產前診斷、腫瘤遺傳學研究等。
發明內容
本發明的目的在于提供一種用于檢測EGFR基因拷貝數和7號染色體倍性的試劑， 其特征在于，所述試劑包括用于檢測EGFR基因拷貝數的熒光探針RP11-339F13和用于檢測 7號染色體倍性的熒光探針RP11-144H20 ；其中，RP11-339F13為覆蓋EGFR基因全長的BAC克隆，用羅丹明熒光素標記，其末 端序列如下(1)RP11-339F13 正向序列(Forward sequence)cagagacaggagcggaggcttctcctggtgaccactctgcttaaaaacttcatcagatccgtagtttcagag cccccctgaaccccatcccttacctctaccagttgcaggtgggtctctggggtggggctgccctccccaccagcacccc aagggctaaaaggttgaggggagaacaccatcatttgtacagggggatcctggaagatgaggcctgagaaagccctgcgg ggcccctcaccttctccctagctgtggccaagagtgtctggccttgcctgcctcaggaccagcccaaagtggaggtgag aggtgagccccagcccccaggggaagggtgatggtggtcttggtctcagcatggttctggtagaggtgggttattttgaa gatgatgaaccttaagcctctttctgatcttgctttaaataaatacttctgaacaacagcaacaacagaatagtgttgatagg aaagccctccactccaccagaaccacgcggccttctcgtcctcccctcctccacttccttcctaagtcactgctccatgagctct tccacaggagatttacaaaatagaacacaaacaatccagttcccgcctctcactctgaactcctcccaagactcgtggggtgcg gcagcccctgggaacacccagcccttcaaggtcaaacacagcccccgcccctcactctggggtaccctgccagaataagcc ccgacagccatgtggagcagagccttc(2)RP11-339F13 反向序列ccgcccggccagccgccccgtccgggagggaggtgggggggtccaaggtaaggaaggccctagagtcta ggaagagactggccagtgcattaaccattgtagtgtaatggatttgatgttactttatgctcacaagttggacaca cacacagggacccagatcaaattggaggggaaggtcaaagtcagcttcccaaaggaactgaagcttagactgatttttaaaggc tgagttaaaataaactgggtaaaaataaagaaggaaagagaaaagcaaatgtaaaatatctgtgcagcatgaagtagcaaaa tatattcagagaatgtaagaagctgaaatgagggcctcaactaagcgtgggaatgcagatggtgacatagcaatgctgagg taggctccccaggaccgaggccggcttgttgcggggagaggggaggggcactctaggatgatctctggcgtaagcagcag gtaacgcgg
5
tgccaggacatggctgagttttacataaacatttgttcaagcaaatatgggatcattcactgaaacgga gaattcaaagtgaggtctagatttggtggcaagatacaactgattcgaggttaggaaaggagagttggaggaacaggaggaag cggcctctcatctgcaaaccctgagttcctggaacacttgtttgttagggagggaagtgtggcccagccacaatcctttg aacatcttcctcttccatcctctgggttctgcatttc ；RP11-144H20為7號染色體著絲粒特異的BAC克隆，用異硫氰酸熒光素標記，其末 端序列如下(3)RP11-144H20 正向序列gaattcagcagtttggaaacactctttttgtcaattctgcaagtcgacatttgggaggtcattgagctc aaaggtgaaaaagtgaatatcccataataaaaagtagaagaaatctattgcattgaggcctatggtgaaagaggaaaaatattc agaaaaaatctagaaagaagctttctgagaaactgctttgtgatgtgtgcattcacctaacagagttaatcctttcagtgaaa tcagcagtttgcaaacactgttttcatccattctgtaaaaggacatttgctagttcattaacaccaatggcaaaaaagcaaatat cactggagaaaaactagaaggaatctatctgagaaaccactttttgatgtgtgcattcacctcgcagagttaaacttttattttc atggagcaggttgtaaacactctttttgtagaaactgcaaagggatatttgggagcgcatttaggcttatggtaaaaaggaaatat cttaagttgaaaactagaaacaagctttctgagaaacttctttgtgatgtgcacattcatatcacagagtaaaacctttactttg gattcagtagtttggaagccctgttgttgtagaatgtgtgaagggatacttgggagctcattgaggccatccggtaaaaagtgaat atcccaggataaaaactaaaaggaaacaatctgagaaaccactatgtcatgtgtgcattcacctcgcagaattaaaactttc ttttc(4) RP11-144H20 反向序列ctgagaattcttccgtctagcattcaatgaagaaatcccgtttccaacgaaggcctcaaacaggtccat atttccacttgcagactttacaaacagtgtgtttccaaactcctctatgaaaagaaaggttaaactctgtgagttgaacg cacacatcacaaagcactttctgagaatgattctgtctggttattatacgaagatatttccttttctgcaattgtcctcaaat cgcttgaaatctccacctgaaaatgccacagcaagagtgtttcaaatctgctctctctaaagcaaggttcaactctgtgagttgaatac
Q.CQ.CQ.Q.CQ.CQ.Q.Q.Q.Q.agttcctgagaactcttcttagtctagcatgaaaggaagaaaccccgtttgcaacgaagccctcaaaga ggtccaaatatcc
6
acttgcagacataacaagcagagtgtttctaaactgctctaagaaaagaaaggttaaactctgtgagtt gaaggcacacatcacaaagtagtttctgagaatgattctgtctagtttttatttgaagatatttccttttctactgttggca tcaaatcgcttgaaatctccacttgcaaattccacaaaaagagtgtttcaaatctgctctgtgtaaagggacgttccactctgtgagttg aatacacacagcacaaagaagttactgagaattcttctgtctagcatgaaatgaagaaatcccgtttccaacgaaggcctcaat gcggtcca。本發明一方面確定了覆蓋EGFR基因全長的BAC克隆，即RP11-339F13，用羅丹明 熒光素標記后作為探針；另一方面選用7號染色體著絲粒特異的BAC克隆RP11-144H20來 檢測染色體倍性，用FITC標記后作為探針。使用本發明試劑可以快速、簡便地檢測細胞內 EGFR基因拷貝數及7號染色體倍性，有助于藥物敏感性和預后的判斷，對指導于非小細胞 肺癌等腫瘤分子靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)的使用具有重要意義。
圖1是EGFR基因(紅色)和7號染色體(綠色)著絲粒特異探針在中期分裂相 的定位圖。
具體實施例方式實施例1 菌體培養1)原始菌液(人基因組細菌人工染色體(BAC)克隆，購自invitrogen公司)涂平 板，37°C培養過夜。2)挑取單菌落，至5ml LB培養基(胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物0. 05g/L，氯化 鈉 10g/L, ρΗ7· 0)，37°C，220 轉 / 分搖菌過夜。3)將5ml菌液全部加入400ml LB培養基中擴大培養，37°C，220轉/分搖菌過夜。實施例2 質粒的提取1)將溫育的轉化細胞轉移至含抗生素氨芐(100 μ g/ml) LB平板上，當液體被吸收 后，倒置平板，37°C培養12 16h。2)挑取單個菌落，37°C于IOml LB培養基中培養24h。3)8000rpm 離心 10 15min，去上清。4) 200 μ 1 Solution I (50mM葡萄糖，IOmM EDTA pH8. 0, IOmM Tris ρΗ8· 0)振蕩混勻。5) 400 μ 1 Solution II (0· 2M NaOH，1 % SDS，現配現用)振蕩 7s，冰上靜置 lOmin。6) 300 μ 1 Solution III (3Μ 醋酸鉀，ρΗ4· 8)振蕩 5s，冰上靜置 10 15min。7) 13000轉/分離心lOmin，上清液轉入1. 5ml的離心管。8)加入等體積平衡酚，振蕩至乳濁狀，1000轉/分離心8min。9)吸上層水相，加等體積的異丙醇，振蕩30s，-20°C下沉淀DNA2h以上。10) 12000轉/分離心lOmin，去上清，室溫下充分干燥。11) 70%預冷酒精洗滌2 5min，10000轉/分離心lOmin，室溫下充分干燥。
13)加入 RNase 處理 lh。14)加入等體積的氯仿混勻，IOOOOrpm離心IOmin。16)吸上層水相至新的離心管中，2倍體積的無水乙醇沉淀過夜。17) 12000rpm離心15min，去上清液，室溫下充分干燥。18)加入適當體積的TE buffer溶液，室溫下溶解30 60min。19)質粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測。實例3 標記探針采用切口平移(Nick translation)的方法標記，過程如下20 μ 反應體系中含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP 禾 Π Fluorophore-Iabeled dUTP(EGFR基因用Cy3，7號染色體著絲粒用FITC)，各0. 2yM，DNase I 0. 5U、DNA聚合酶I 2U、0. 5 1. 0μ g質粒 DNA0PCR儀中，15°C下標記1. 5-3h后加1 μ 1 0. 5Μ EDTA (ρΗ8. 0)終止反應。過程中需 取5 μ 1產物用2 %的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，若DNA片段大小在500-600bp，則停止反 應；若片段大于該范圍，則需增加DNase I的量以及反應的時間，直至符合目標大小。制得 RP11-339F13 探針和 RP11-144H20 探針。實例4:FISH檢測1.預處理程序1)將載玻片浸入2 % 3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (3-aminopropyltriethoxysi lane, Sigma Chemical Co.，St. Louis, MO)丙 溶液中 5 分 鐘，隨后在丙酮及蒸餾水中漂洗，自然干燥載玻片(或使用商業化防脫玻片)。2)從福爾馬林固定石蠟包埋的乳腺癌組織中獲取多塊2-4微米切片，分別置于以 上經氨基烷基硅烷(aminoalkylsilane)處理過的載玻片上。3)將組織切片置于65°C下過夜烘烤或烘烤6小時。4)將組織切片浸于二甲苯中室溫脫蠟2次，每次10分鐘，隨后浸入100%乙醇中 5分鐘。5)將組織切片依次室溫置于100%乙醇、85%乙醇和70%醇中各兩分鐘復水。將 組織切片室溫浸入去離子水中3分鐘，用無絨紙巾吸取多余的水分。6)準備一缸蒸餾水并將其置于電磁爐上燒開，將玻片浸入沸水中處理組織切片 15分鐘。7)取0. 4ml蛋白酶K儲存液(20mg/ml)溶于40ml 20XSSC(pH7. 0)得到蛋白酶K 工作液(200yg/ml)；將組織切片浸泡在蛋白酶K工作液中，37°C下孵育8分鐘(看消化情 況而定)。8)組織切片經蛋白酶K消化后，將組織切片玻片依次置于70%乙醇、85%乙醇和 100%乙醇中各2分鐘脫水。9)自然干燥玻片。10)按照FISH操作步驟進行FISH實驗。2. FISH操作步驟2. 1探針混合物準備
8
2. 1. 1室溫下將如下液體加入到微量離心管中。7 μ 1 雜交緩沖液1 μ 1 去離子水2 μ 1 熒光探針2. 1. 2離心1-3秒(迷你離心機)。2. 1. 3渦旋混勻后再次短暫離心。2. 2探針與樣本雜交2. 2. 1將10μ 1的探針混合物滴于玻片雜交區域，立即加蓋蓋玻片，避免蓋玻片與 玻片之間產生氣泡。2. 2. 2加好探針的載玻片在烤片機上83°C變性5分鐘。2. 2. 3從烤片機上拿下載玻片，立即用封片膠封邊。2. 2. 4將玻片置于預熱的濕盒中，42°C保溫箱中雜交過夜。2. 3玻片洗滌2.3. 1移去封片膠和蓋玻片，立即將玻片置于盛有2XSSC溶液的瓶中，晃動玻片 1-3秒，10分鐘后取出玻片。2. 3. 2將玻片置于盛有2XSSC/0. 1% NP-40溶液的瓶中，晃動玻片1_3秒，5分鐘 后取出玻片。2. 3. 3將玻片室溫浸泡在70%乙醇中，3分鐘后取出玻片。2. 4結果觀察2.4. 1暗處自然干燥玻片。2.4.2將154 1 DAPI復染劑滴加于雜交區域位置，立即蓋上蓋玻片。暗處放置 10-20分鐘。2. 4. 3在Olympus BX51熒光顯微鏡下選用合適的濾波片組觀察玻片。軟件拍攝和 分析圖片。實施例5:結果判讀熒光原位雜交信號在正常細胞內顯示為2紅2綠(2R2G)，在異常細胞顯示紅色信 號數量大于2，綠色信號數量不少于2。1.正常結果熒光原位雜交信號在正常細胞內顯示為2紅2綠(2R2G)。2. EGFR基因檢測的陽性判斷方法如下隨機觀察細胞(至少觀察100個細胞)，統計紅信號個數和綠信號個數。1)當紅綠信號比值小于2，而有不少于40%的細胞中紅色信號個數大于或等于4 個時，表示EGFR基因高多體性擴增，為陽性結果；2)當出現以下三種情況之一時，表示EGFR基因擴增，為陽性結果紅綠信號比值大于或等于2 ；不少于10%的細胞中有大于或等于15個紅色信號； 包含成簇的紅色信號。圖1所示為利用本發明試劑中的探針對對正常人外周血培養細胞的中期染色體進行的 FISH, EGFR基因(紅色)和7號染色體(綠色)著絲粒特異探針在中期分裂相的定位如圖所示。
9
權利要求
用于檢測EGFR基因拷貝數和7號染色體倍性的試劑，其特征在于，所述試劑包括用于檢測EGFR基因拷貝數的熒光探針RP11 339F13和用于檢測7號染色體倍性的熒光探針RP11 144H20；其中，RP11 339F13為覆蓋EGFR基因全長的BAC克隆，用羅丹明熒光素標記，其末端序列如下(1)RP11 339F13正向序列(Forward sequence)cagagacaggagcggaggcttctcctggtgaccactctgcttaaaaacttcatcagatccgtagtttcagagcccccctgaaccccatcccttacctctaccagttgcaggtgggtctctggggtggggctgccctccccaccagcaccccaagggctaaaaggttgaggggagaacaccatcatttgtacagggggatcctggaagatgaggcctgagaaagccctgcggggcccctcaccttctccctagctgtggccaagagtgtctggccttgcctgcctcaggaccagcccaaagtggaggtgagaggtgagccccagcccccaggggaagggtgatggtggtcttggtctcagcatggttctggtagaggtgggttattttgaagatgatgaaccttaagcctctttctgatcttgctttaaataaatacttctgaacaacagcaacaacagaatagtgttgataggaaagccctccactccaccagaaccacgcggccttctcgtcctcccctcctccacttccttcctaagtcactgctccatgagctcttccacaggagatttacaaaatagaacacaaacaatccagttcccgcctctcactctgaactcctcccaagactcgtggggtgcggcagcccctgggaacacccagcccttcaaggtcaaacacagcccccgcccctcactctggggtaccctgccagaataagccccgacagccatgtggagcagagccttc(2)RP11 339F13反向序列ccgcccggccagccgccccgtccgggagggaggtgggggggtccaaggtaaggaaggccctagagtctaggaagagactggccagtgcattaaccattgtagtgtaatggatttgatgttactttatgctcacaagttggacacacacacagggacccagatcaaattggaggggaaggtcaaagtcagcttcccaaaggaactgaagcttagactgatttttaaaggctgagttaaaataaactgggtaaaaataaagaaggaaagagaaaagcaaatgtaaaatatctgtgcagcatgaagtagcaaaatatattcagagaatgtaagaagctgaaatgagggcctcaactaagcgtgggaatgcagatggtgacatagcaatgctgaggtaggctccccaggaccgaggccggcttgttgcggggagaggggaggggcactctaggatgatctctggcgtaagcagcaggtaacgcggtgccaggacatggctgagttttacataaacatttgttcaagcaaatatgggatcattcactgaaacggagaattcaaagtgaggtctagatttggtggcaagatacaactgattcgaggttaggaaaggagagttggaggaacaggaggaagcggcctctcatctgcaaaccctgagttcctggaacacttgtttgttagggagggaagtgtggcccagccacaatcctttgaacatcttcctcttccatcctctgggttctgcatttc；RP11 144H20為7號染色體著絲粒特異的BAC克隆，用異硫氰酸熒光素標記，其末端序列如下(3)RP11 144H20正向序列gaattcagcagtttggaaacactctttttgtcaattctgcaagtcgacatttgggaggtcattgagctcaaaggtgaaaaagtgaatatcccataataaaaagtagaagaaatctattgcattgaggcctatggtgaaagaggaaaaatattcagaaaaaatctagaaagaagctttctgagaaactgctttgtgatgtgtgcattcacctaacagagttaatcctttcagtgaaatcagcagtttgcaaacactgttttcatccattctgtaaaaggacatttgctagttcattaacaccaatggcaaaaaagcaaatatcactggagaaaaactagaaggaatctatctgagaaaccactttttgatgtgtgcattcacctcgcagagttaaacttttattttcatggagcaggttgtaaacactctttttgtagaaactgcaaagggatatttgggagcgcatttaggcttatggtaaaaaggaaatatcttaagttgaaaactagaaacaagctttctgagaaacttctttgtgatgtgcacattcatatcacagagtaaaacctttactttggattcagtagtttggaagccctgttgttgtagaatgtgtgaagggatacttgggagctcattgaggccatccggtaaaaagtgaatatcccaggataaaaactaaaaggaaacaatctgagaaaccactatgtcatgtgtgcattcacctcgcagaattaaaactttcttttc(4)RP11 144H20反向序列ctgagaattcttccgtctagcattcaatgaagaaatcccgtttccaacgaaggcctcaaacaggtccatatttccacttgcagactttacaaacagtgtgtttccaaactcctctatgaaaagaaaggttaaactctgtgagttgaacgcacacatcacaaagcactttctgagaatgattctgtctggttattatacgaagatatttccttttctgcaattgtcctcaaatcgcttgaaatctccacctgaaaatgccacagcaagagtgtttcaaatctgctctctctaaagcaaggttcaactctgtgagttgaatacacacaacacaaaaaagttcctgagaactcttcttagtctagcatgaaaggaagaaaccccgtttgcaacgaagccctcaaagaggtccaaatatccacttgcagacataacaagcagagtgtttctaaactgctctaagaaaagaaaggttaaactctgtgagttgaaggcacacatcacaaagtagtttctgagaatgattctgtctagtttttatttgaagatatttccttttctactgttggcatcaaatcgcttgaaatctccacttgcaaattccacaaaaagagtgtttcaaatctgctctgtgtaaagggacgttccactctgtgagttgaatacacacagcacaaagaagttactgagaattcttctgtctagcatgaaatgaagaaatcccgtttccaacgaaggcctcaatgcggtcca。
全文摘要
本發明公開了一種用于檢測EGFR基因拷貝數和7號染色體倍性的試劑，所述試劑包括用于檢測EGFR基因拷貝數的熒光探針RP11-339F13和用于檢測7號染色體倍性的熒光探針RP11-144H20；其中，RP11-339F13為覆蓋EGFR基因全長的BAC克隆，用羅丹明熒光素標記；RP11-144H20為7號染色體著絲粒特異的BAC克隆，用異硫氰酸熒光素標記。使用本發明試劑可以快速、簡便地檢測細胞內EGFR基因拷貝數及7號染色體倍性，有助于藥物敏感性和預后的判斷，對指導于非小細胞肺癌等腫瘤分子靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)的使用具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK101899504SQ20101016886
公開日2010年12月1日 申請日期2010年5月11日 優先權日2010年5月11日
發明者方國偉, 董正偉, 郭興中, 郭堯 申請人:合肥艾迪康臨床檢驗所有限公司