專利名稱：一種檢測克倫特羅的免疫試劑盒及其專用抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測克倫特羅的免疫試劑盒及其專用抗體。
背景技術：
克倫特羅(Clenbuterol，CLE)，俗稱瘦肉精，是一種β興奮劑。因其能改善脂肪 型動物的肉與脂肪的比例，并能加速動物生長，而被廣泛添加于動物飼料中，并且可以殘留 在動物體內。然而這種藥物對人有嚴重的副作用。輕則導致心跳及心律不正常，重則可引 發心臟病。目前，我國及許多國家已禁止其作為飼料添加劑使用。在克倫特羅的檢測方法方面，目前最為常用的方法包括高效液相色譜法(HPLC)、 氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)、液相色譜-質譜聯用(LC-MS)、酶聯免疫吸附分析法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)等方法。HPLC法具有檢測精確度高、假陽性率低的 優點，主要缺點是儀器價格昂貴、操作比較繁瑣，耗時長，檢測費用昂貴；且前期樣品的萃取 條件的選擇也對檢測靈敏度和準確性有較大影響。GC-MS靈敏度很高，假陽性率低。該方法 的主要缺點是樣品需要衍生化這樣復雜的前期處理。LC-MS的缺點與GC-MS —樣，操作步驟 繁瑣，需要貴重儀器，所以一般用作對陽性結果的確認手段。酶聯免疫吸附分析法是當前應 用最廣、發展最快的免疫酶技術之一，主要優點在于檢測迅速，樣品前處理簡單，檢測系統 操作簡單，成本低，同時便于進行大規模檢測。化學發光免疫檢測技術不同于酶聯免疫吸附 分析法，它是化學發光法和免疫分析法結合的產物，因此同時具有化學發光檢測技術的高 靈敏性和免疫分析技術的高特異性。化學發光免疫分析法的基本原理與ELISA相似，不同 之處在于酶標記物的反應體系是化學發光反應。目前，用于免疫檢測的抗體都是單克隆抗體或多克隆抗體。單克隆抗體或多克隆 抗體的制備必須通過細胞培養獲得，整個生產過程復雜，消耗時間長，費用高，且不易進行 操作。單鏈抗體是將抗體重鏈可變區和輕鏈可變區基因通過一個短肽鏈連接后融合表達出 來的抗體片斷，具有分子量小、特異性高、結合力強、易于利用基因工程技術操作等優點。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種單鏈抗體及其編碼基因。本發明所提供的單鏈抗體，由重鏈可變區、連接重鏈可變區和輕鏈可變區的短肽、 輕鏈可變區依次連接組成，所述重鏈可變區的氨基酸序列如序列1自N末端起第15-132位 氨基酸殘基所示，所述輕鏈可變區的的氨基酸序列如序列1自N末端起第148-266位氨基 酸殘基所示。上述單鏈抗體中，所述連接重鏈可變區和輕鏈可變區的短肽的氨基酸序列如序列 1自N末端起第133-147位氨基酸殘基所示。所述編碼基因為如下1)、2)、3)、4)或5)所示1)所述重鏈可變區的編碼基因為自序列表中序列2的5'末端起第43-396位核 苷酸所示的DNA分子；
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2)所述輕鏈可變區的編碼基因為自序列表中序列2的5'末端起第442-798位核 苷酸所示的DNA分子；3)所述連接重鏈可變區和輕鏈可變區的短肽的編碼基因為自序列表中序列2的 5'末端起第397-441位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列2自5'末端起第43-798位核苷酸所示的DNA分子；5)在嚴格條件下與1)、2)或3)或4)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA 分子。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系和表達盒也屬于 本發明的保護范圍。上述任一所述單鏈抗體在檢測克倫特羅或沙丁胺醇中的應用也屬于本發明的保 護范圍。本發明的另一個目的是提供一種檢測克倫特羅或沙丁胺醇的免疫試劑盒。本發明所提供的檢測克倫特羅或沙丁胺醇的免疫試劑盒，為下述1)、2)、3)或4) 中任一所述試劑盒1)試劑盒中包括克倫特羅半抗原與載體蛋白的偶聯物、上述任一所述單鏈抗體和 酶標記抗抗體；其中，所述偶聯物作為包被原；2)試劑盒中包括克倫特羅半抗原的酶標記物、上述任一所述單鏈抗體和抗抗體； 其中，所述抗抗體作為包被原；3)試劑盒中包括克倫特羅半抗原的酶標記物、上述任一所述單鏈抗體；其中，所 述單鏈抗體作為包被原；4)試劑盒中包括克倫特羅半抗原與載體蛋白的偶聯物、上述任一所述單鏈抗體的 酶標記物；其中，所述偶聯物作為包被原。上述任一所述免疫試劑盒中，所述試劑盒中包括克倫特羅標準品溶液、洗滌液和 樣品濃縮液；所述克倫特羅標準品為鹽酸克倫特羅；所述克倫特羅標準品溶液為如下各濃度的溶液0ng/L、50ng/L、150ng/L、450ng/ L、1350ng/L 和 4050ng/L ；每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的將IOml吐溫20，5g疊氮化鈉和 990ml磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 005M-0. 015M, 具體為0. 01M, pH值為7. 2-7. 6，具體為7. 4 ；所述樣品濃縮液為濃度為0. 03mol/L-0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液，具體為 0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液。上述任一所述免疫試劑盒中，所述克倫特羅半抗原與載體蛋白的偶聯物是按照如 下方法制備得到的將每5mg克倫特羅半抗原溶于0. IM鹽酸水溶液中，得到克倫特羅半抗 原的水溶液，并預冷至0°C;向克倫特羅半抗原的水溶液中加入IOmg NaNO2,4°C條件下攪拌 5h，形成溶液I ；將20mg載體蛋白溶于0. IM磷酸鹽緩沖溶液中，得到載體蛋白的溶液；將載 體蛋白的溶液加到溶液I中，4°C條件下攪拌6h，得到所述克倫特羅半抗原與載體蛋白的偶 聯物；所述克倫特羅半抗原為克倫特羅；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、 鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、兔血清白蛋白、血藍蛋白或卵清白蛋白；
所述抗抗體為鼠抗HIS標簽單克隆抗體。本發明的另一個目的是提供一種檢測克倫特羅或沙丁胺醇的方法。本發明所提供的檢測克倫特羅或沙丁胺醇的方法，包括如下步驟1)將待測樣品進行前處理，得到待測樣本溶液；2)用上述任一所述免疫試劑盒對所述待測樣本溶液進行檢測；所述前處理的方法為下述a)、b)、c)和d)中的任一a)所述待測樣品為豬尿或血清樣品；將所述豬尿或血清樣品直接作為待測樣本 溶液，或將所述豬尿或血清樣品離心或過濾，取上清液或濾液，得到待測樣本溶液；b)所述待測樣品為飼料；將每Ig所述待測樣品與IOmL 0. OlM鹽酸水溶液混勻， 調整PH值至6. 5 8，2000r/min離心5min，取100 μ L上清液；將所述100 μ L上清液與 400 μ L樣品稀釋液混勻，即得到待測樣本溶液；c)所述待測樣品為液態奶；將每ImL液態奶、2mL蒸餾水和100 μ L 5Μ鹽酸水溶液 混合，在40°C保持3 5min，2000r/min離心5min，取上清液，記作上清液I ；將所述上清液 I與100 μ L 5Μ氫氧化鈉水溶液和6. 8mL蒸餾水混合，2000r/min離心15min，取上清液，記 作上清液II ；用400 μ L樣品稀釋液稀釋所述上清液II，得到的溶液即為待測樣本溶液；d)所述待測樣品為豬肉或豬肝；將每6g所述待測樣品的均質化組織與12mL 3% (質量百分含量)的三氯乙酸水溶液混合，并顛倒混勻30min，10000r/min離心5min或 3000r/min離心lOmin，取上清液；將所述上清液與異丙醇和乙酸乙酯的混合溶液等體積比 混合，振蕩提取 20min,放置 2min, 10000r/min 離心 5min 或 3000r/min 離心 IOmin,取 3mL 上層有機相，氮氣吹干，用ImL樣品稀釋液溶解，得到的溶液即為所述待測樣本溶液；所述 異丙醇和乙酸乙酯的混合溶液中，異丙醇與乙酸乙酯的體積比為4 6；所述樣品稀釋液為將所述樣品濃縮液稀釋20倍得到的。上述試劑盒既可以為酶聯免疫試劑盒，又可為發光免疫試劑盒，當為發光免疫試 劑盒時，試劑盒中還包括底物顯色液；所述底物顯色液由A液和B液組成；A液由(1)中所述 物質(即發光劑)中的至少一種和(2)中所述物質(即發光增強劑)中的至少一種組成 ⑴魯米諾、異魯米諾和4-氨基己基-N-乙基異魯米諾，(2)對_碘苯酚、鄰_碘苯酚和對 甲苯酚；B液為過氧化氫溶液或尿素過氧化氫溶液。所述發光底物液分為A液和B液保存， 在臨用前按11混合使用。上述試劑盒的檢測原理如下當在酶標板微孔條上預包被克倫特羅半抗原與載體蛋白的偶聯物時，加入樣本溶 液或標準品溶液后，再加入克倫特羅單鏈抗體溶液，樣本中殘留的克倫特羅或克倫特羅標 準品與酶標板上包被的克倫特羅半抗原與載體蛋白的偶聯物競爭克倫特羅單鏈抗體，加入 酶標記二抗進行放大作用，催化底物發光，樣本發光強度值與樣本中克倫特羅的含量成負 相關，與標準曲線比較即可得出樣本中克倫特羅的含量。當在酶標板微孔條上預包被二抗時，加入克倫特羅單鏈抗體孵育后，加入樣本溶 液或標準品溶液，再加入酶標記克倫特羅半抗原溶液，樣本中的克倫特羅或克倫特羅標準 品與酶標記克倫特羅半抗原競爭克倫特羅特異性抗體，用催化底物發光，樣本發光強度值 與樣本中克倫特羅的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中克倫特羅的含量。當在酶標板微孔條上預包被克倫特羅單鏈抗體時，加入樣本溶液或標準品溶液
6后，再加入酶標記克倫特羅半抗原溶液，樣本中殘留的克倫特羅或克倫特羅標準品與酶標 記抗原競爭包被在酶標板上的克倫特羅單鏈抗體，用催化底物發光，樣本發光強度值與克 倫特羅的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中克倫特羅的含量。當在酶標板微孔條上預包被克倫特羅半抗原與載體蛋白的偶聯物時，加入樣本溶 液或標準品溶液后，再加入酶標記克倫特羅單鏈抗體溶液，樣本中的克倫特羅或克倫特羅 標準品與酶標板上包被的克倫特羅抗原競爭克倫特羅單鏈抗體，用催化底物發光，樣本發 光強度值與樣本中克倫特羅的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中克倫特羅的 含量。本發明提供的試劑盒檢測方法為當包被原為克羅特倫偶聯抗原時，向酶標板微孔中加入標準品溶液或樣本溶液再 加入抗體，溫育后洗滌拍干，再加入酶標二抗，溫育后洗滌拍干，催化底物發光、用化學發光 檢測儀測定發光強度值；當包被原為克倫特羅偶聯抗原時，向酶標板微孔中加入標準品溶液或樣本溶液再 加入酶標記抗體，溫育后洗滌拍干，催化底物發光、用化學發光檢測儀測定發光強度值；當包被原為克倫特羅單鏈抗體時，向酶標板微孔中加入標準品溶液或樣本溶液再 加入酶標記克倫特羅半抗原，溫育后洗滌拍干，催化底物發光、用化學發光檢測儀測定發光 強度值；當包被原為二抗時，向酶標板微孔中加入克倫特羅單鏈抗體，溫育后洗滌拍干，再 加入標準品溶液或樣品溶液后加入酶標克倫特羅半抗原，溫育后洗滌拍干，催化底物發光、 用化學發光檢測儀測定發光強度值。本發明提供的檢測結果分析過程為以所獲得的樣品發光強度⑶與第一個標準(0標準)的發光強度(Btl)的比值(B/ B0)為縱坐標，以FB標準品濃度的對數為橫坐標，通過專業分析軟件繪制標準曲線，并求出 IC50,以20%的抑制作為最低檢測限。本發明中檢測結果的分析也可以采用回歸方程法，計算出樣品溶液濃度。本發明中檢測結果的分析還可以利用計算機專業軟件，此法更便于大量樣品的快 速分析，整個檢測過程只需較短時間，1.5h內即可以完成。本發明的單鏈抗體(scFv)是用基因工程方法將抗體重鏈可變區(VH)和輕鏈可變 區(VL)通過一段連接肽(Linker)連接而成的重組抗體，是保持了親本抗體的抗原親和活 性和特異性的最小功能性抗體片段，可通過基因工程技術體外表達得到，可在細菌中很經 濟地大規模生產，從而使得免疫檢測抗體的生產變得非常容易、簡便和經濟，進而大大減少 檢測試劑的費用，比雜交瘤細胞培養得到單抗的方法要簡單得多。本發明抗體的親和常數 為8 . 06X 109L/mol、半數抑制量(IC5tl)為0. 076ng/mL。本發明為食品中克倫特羅殘留檢測 方法的建立提供高效價、高特異性的抗體來源。標準品精密度試驗中，本發明試劑盒的每批試劑盒各測定10次標準品變異系數 在3. 5% 8. 2%之間；樣本準確度和精密度實驗中，豬尿樣品的添加回收率為87. 5% 95. 5% ；豬肉樣品的添加回收率為79. 9% 92. 6%。豬尿樣品的批內變異系數為4. 8% 8.2%，批間變異系數為10. 9% 11. 2%;豬肉樣品的批內變異系數為4. 9% 9. 1%，批間 變異系數為10. 5% 11. 1%。交叉反應檢測實驗中，本發明試劑盒對克倫特羅和沙丁胺醇
7的特異性好。綜上表明，本發明試劑盒的靈敏度高、準確度高、精密度高、對克倫特羅和沙丁 胺醇的特異性好。另外，本發明試劑盒成本低廉。用本發明的試劑盒檢測樣品中克倫特羅 和沙丁胺醇的含量，具有操作簡便快捷、樣品前處理簡單的特點，能同時快速檢測大批量樣 品，可實現現場高通量快速檢測。因此，本發明的抗體及試劑盒及檢測方法在克倫特羅和沙 丁胺醇的檢測中將發揮重大作用。
圖1為克倫特羅試劑盒標準曲線。圖2為克倫特羅單鏈抗體的Western-Blotting結果。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、抗體的制備及功能檢測一、克倫特羅單鏈抗體的制備(一 )抗體的篩選及改造取6個月雄性Balb/c小鼠，Trizol —步法提取脾細胞總RNA，純化得到mRNA， 再逆轉錄得到cDNA。使用Oligo(dT)引物，以cDNA為模板分別擴增得到重鏈可變區 (VH)、輕鏈可變區(VL)基因，經重迭延伸聚合酶鏈式反應(SOE-PCR)通過一段柔性肽段 ((Gly4Ser)3-Linker)將VH、VL裝配為scFv ；將酶切scFv連接入核糖體展示載體(pRDV) 中，通過PCR技術在scFv的5'端引入T7啟動子和核糖體結合位點，3'端引入間隔區tolA 序列而構建出核糖體展示模板，通過體外表達得到mRNA-核糖體-抗體三元復合物，構建出 單鏈抗體核糖體展示文庫，借助ELISA和PCR技術經四輪循環篩選出特異性克倫特羅單鏈 抗體基因，其中在第二輪循環時，借助錯配PCR和交替延伸PCR技術進行抗體改造，并引入 酶切位點。該單鏈抗體的編碼基因序列如序列表中序列2所示，自序列2的5'末端起第 43-396位核苷酸編碼重鏈可變區，自序列2的5'末端起第442-798位核苷酸編碼輕鏈可 變區，自序列2的5'末端起第397-441位核苷酸編碼短肽。該單鏈抗體由重鏈可變區、連接所述重鏈可變區和輕鏈可變區的短肽、輕鏈可變 區順次連接組成。該抗體的氨基酸序列如序列表中序列1所示，自序列1的N端起第15-132 位氨基酸殘基為重鏈可變區的氨基酸序列，自序列1的N端起第148-266位氨基酸殘基為 輕鏈可變區的氨基酸序列，自序列1的N端起第133-147位氨基酸殘基為短肽序列。( 二)抗體的制備表達載體pET20b購自德國N0VAGEN公司；大腸桿菌BL21購自德國N0VAGEN公司； 蛋白純化用HisLink Protein Purification Resin購自美國Promega公司，產品目錄號 為 V8823。合成序列表中序列2自5'末端起第43-798位核苷酸所示基因，并在兩端引入酶 切位點Xba I和Not I，用限制性內切酶Xba I和Not I酶切，回收目的基因片段；用限制 性內切酶Xba I和Not I酶切表達載體pET20b，回收載體大片段；連接，連接產物轉化大腸桿菌，篩選培養，挑取單克隆；將單克隆接入液體培養基進一步培養，提取質粒，酶切和測序 驗證，結果測得的序列如序列表中序列2自5'末端起第43-798位核苷酸所示，表明重組載 體中基因插入方向和序列均正確，將陽性重組載體記作重組表達載體pET20b/ScFv。采用氯化鈣法將重組表達載體pET20b/ScFv轉化大腸桿菌BL21，抗性篩選，經菌 液PCR及質粒酶切驗證，得到含有重組表達載體pET20b/ScFv的重組大腸桿菌，記作重組大 腸桿菌 BL21/pET20b/ScFv。2XTY培養液的組成由胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl和水組成，每1升2XTY培養 液中胰蛋白胨的濃度為1.6%、酵母提取物的濃度為l%、NaCl的濃度為0.5%;各百分含量 均為質量百分含量。含氨芐青霉素、氯霉素和葡萄糖的2XTY培養液是按照如下方法得到的向2XTY 培養液中添加氨芐青霉素、氯霉素和葡萄糖，使氨芐青霉素在溶液中的終濃度為IOOyg/ ml，使氯霉素在溶液中的終濃度為34 μ g/ml，使葡萄糖在溶液中的終濃度為1 % (質量百分 含量)。發酵重組菌將重組大腸桿菌BL21/pET20b/ScFv的單個陽性菌落接種至含氨芐 青霉素、氯霉素和葡萄糖的2 X TY培養液中，37°C振搖，至培養體系的A6tltl為0. 6時，收集細 菌；將細菌重懸于2ml LB液體培養基中，按1 20的體積比將菌懸液接種至50ml含相同 濃度抗生素的LB液體培養基中(含相同濃度抗生素的LB液體培養基的組成氨芐青霉素、 氯霉素、酵母提取物、蛋白胨、NaCl和水組成；溶液中各成分的濃度為酵母提取物0. 5%, 蛋白胨1 %，NaCl 1 %，氨芐青霉素100 μ g/ml，氯霉素34 μ g/ml)，37°C振搖，至培養體系的 A600 為 0. 6 時，加 IPTG(0. 7mmol/L)誘導，30°C振搖 2. 5h，在 4°C下 5000r/min 離心 lOmin， 收獲細菌。用洗滌液(將20mmol Tris和0. 15mol NaCl用水溶解，用HCL調PH值至8. 0， 再用水定容至1L，得到1升洗滌液)洗滌1次，加溶菌液(將20mmol TrisUOml Triton Χ-100、250 μ mol PMSF、62. 5 X IO4U溶菌酶用水溶解，用HCL調PH值至8. 0，再用水定容至 1L，得到1升溶菌液)，30°C放置15min，然后在冰上超聲處理(輸出功率80% ) 10s，停10s， 反復3次，至細胞不再粘稠。在4°C 2000Xg離心20min，分別收集上清及沉淀。將沉淀用結 合緩沖液I (將20mmol Tris,0. 5mol Nacl和5mmol咪唑用水溶解，用HCL調PH值至8. 0， 再用水定容至1L，得到1升結合緩沖液I)洗滌一次，而后，懸于結合緩沖液II (將20mmol Tris,0. 5mol Nacl、5mmol咪唑和6mol尿素用水溶解，用HCL調PH值至8. 0，再用水定容至 1L，得到1升結合緩沖液II)中，4°C，12000 X g離心20min,收集上清，經0. 45mm濾膜過濾， 收集濾液，得到抗體的粗制液。純化利用表達載體上帶有的組氨酸標簽(His-tag)標記通過親和層析純化單鏈 抗體蛋白。將 HisLink Protein Purification Resin 裝柱，以 10 倍柱體積的 binding buffer (將 lOOmmolHEPES、IOmmol 咪唑和 500mmol NaCl 用水溶解，再調節 pH 值至 7. 5，然 后用水定容至1升，得到1升binding buffer)平衡純化柱，取抗體的粗制液上樣，然后用5 倍柱體積的wash buffer (將lOOmmolHEPES、IOOmmol咪唑和用水溶解，再調節pH值至7. 5， 然后用水定容至1升，得到1升wash buffer)洗脫雜蛋白，最后用10倍柱體積的elution buffer (將lOOmmolHEPES、250mmol咪唑用水溶解，再調節pH值至7. 5，然后用水定容至1 升，得到1升elution buffer)洗脫目標蛋白，收集洗脫液，透析，得到純化的抗體。(三)抗體的功能檢測
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1、用ELISA方法，檢測抗體的半抑制率(IC5tl)a、將實施例2中制備得到的偶聯物(CLE-OVA)用包被緩沖液溶解，得到CLE-OVA 的溶液(該溶液中CLE-OVA的濃度為1 μ g/ml)。包被緩沖液pH9. 6,0. lmol/L的碳酸鈉緩 沖液。向96孔板的孔中加入CLE-OVA的溶液，100 μ L每孔，37°C溫育2h ；傾去包被液，用 PBST溶液(PBS+0. 05% Tween20)洗滌3次，250 μ L每孔，每次30s，甩干孔中液體；b、然后向每孔中加入200μ L2% BSA封閉液，37°C溫育2h，傾去孔內液體；用PBST 溶液(PBS+0. 05% Tween20)洗滌3次，250 μ L每孔，每次30s，甩干孔中液體。C、向孔中加入單鏈抗體溶液和不同濃度的鹽酸克倫特羅標準品溶液，各50 μ L每 孔，37°C孵育1小時。以只加入單鏈抗體溶液不加入鹽酸克倫特羅標準品溶液的孔作陽性 對照。單鏈抗體溶液的制備用樣品稀釋液稀釋實驗(二)中的純化抗體得到溶液，抗體 在溶液中的濃度為5ng/mL ；樣品稀釋液為0. 002mol/L的磷酸鹽緩沖液。不同濃度的鹽酸克倫特羅溶液的制備用樣品稀釋液稀釋鹽酸克倫特羅得到溶 液。d、用PBST溶液(PBS,0. 05% Tween20)洗滌3次，250 μ L每孔，甩干孔中液體，加 入HRP標記的鼠抗His標簽單克隆抗體，37°C孵育1小時；e、用 PBST 溶液(PBS,0. 05%Tween20)洗滌 3 次，250 μ L 每孔；加入 TMB 顯色，37°C 反應10分鐘，加入2M硫酸終止顯色反應，每孔50 μ L，使用酶標儀進行讀數。實驗設3次重復。結果如下1)吸光度值與每孔所加入的標準品溶液中鹽酸克倫特羅的濃度成反比；證明，所 表達純化得到的單鏈抗體具有針對鹽酸克倫特羅的結合特異性，并呈現線性關系，說明該 抗體可用于對鹽酸克倫特羅的免疫檢測。2)半抑制率(IC5tl)陽性對照孔(即不添加鹽酸克倫特羅標準品溶液的孔)的吸 光度值為Btl，各實驗孔的吸光度值為B，當BziBtl為50%時所對應的鹽酸克倫特羅標準品溶 液的濃度即為半抑制率(IC50)。該單抗的半抑制率(IC5tl)為0.076ng/mL。2、抗體的親和常數測定方法取定量的一定稀釋度的抗體，分別加入逐漸增加的抗原里，可使抗體的結合 達到飽和，以結合部分(B)為縱坐標，抗原濃度(mol/L)為橫坐標繪制飽和曲線，求出抗體 飽和程度為50%時的游離抗原濃度，其倒數即為該抗體在此稀釋度下的親和常數。結果抗體的親和常數為8. 06 X IOVmol03、Western-Blotting 取純化的單鏈抗體10 μ L加入等量的2 X上樣緩沖液，煮 沸5min后進行SDS-PAGE電泳；將切好的凝膠塊、NC膜和濾紙在轉印緩沖液中浸泡，并轉 入轉印夾中，200mA恒流轉印Ih。轉印結束后，取出NC膜以IOmL 3%的BSA(PBS配制)封 閉2h。取一與膜相當大小的塑料袋，將膜放入其中，加入2mL抗原溶液(用PBST對克倫特 羅-HRP按進行1 2000稀釋)，封口。4°C過夜，次日用PBST洗膜3次，每次lOmin，取一 層保鮮膜，加ImL ECL發光液(等量A、B液混合)，將NC膜浙干洗液后，靠膠的一面朝下， 浸入發光液中，室溫放置lmin，用保鮮膜將NC膜包好，靠膠的一面朝上，放入暗匣中，于暗室中用X光片曝光。該試驗結果在30kD處出現了特異性的蛋白條帶(見圖2)，與單鏈抗體 的大小相符，說明純化后的單鏈抗體能夠與克倫特羅特異性結合。圖2中，泳道1表示蛋白 低分子量Marker，泳道2表示克倫特羅單鏈抗體。同時以轉入空載體pET20b的大腸桿菌BL21作為對照。對照Western blot未檢 測出任何與克倫特羅結合的蛋白條帶。實施例2、化學發光免疫分析試劑盒及其制備與應用一、化學發光免疫分析試劑盒由下述物質組成1、包被克倫特羅半抗原與載體蛋白偶聯物的酶標板；2、克倫特羅單鏈抗體抗體工作液的濃度為5ng/mL，抗體工作液是用樣品稀釋液 稀釋實施例1中的純化抗體得到的到的；3、克倫特羅標準品標準品溶液濃度分別為0ng/L、50ng/L、150ng/L、450ng/L、 1350ng/L和4050ng/L ；克倫特羅標準品為鹽酸克倫特羅(Clenbuterolhydrochloride)，購 自Sigma-Aldrich公司；產品目錄號為C275 ；用樣品稀釋液稀釋成上述各濃度；4、酶標二抗辣根過氧化物酶(HRP)標記的鼠抗HIS標簽單克隆抗體；購自美國 Sigma-Aldrich公司，產品目錄號為A7058。5、底物顯色液由A液和B液組成，A液為魯米諾與對-碘苯酚混合溶液，B液為 過氧化氫水溶液；在該發光體系中加入增強劑對_碘苯酚可增加化學發光強度，并在較長 時間保持穩定，從而大大提高免疫分析的靈敏度。所述發光底物液分為A液和B液保存，在 臨用前按11混合使用。6、洗滌液每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的將IOml吐溫20、5g疊 氮化鈉和990ml磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 01M, PH值為7.4;7、樣品濃縮液0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液；將其進行20倍稀釋，成為樣品稀釋液
后使用。二、試劑盒的制備半抗原為鹽酸克倫特羅(CLE)，鹽酸克倫特羅(CLE)購自美國Sigma-Aldrich公 司，產品目錄號為C275。1、包被原及其制備用重氮化法將半抗原CLE偶聯與載體蛋白OVA上，由于CLE具有芳伯氨基的半抗 原，在強酸和冷卻條件下芳伯氨基生成親電動重氮鹽，與載體蛋白中的強給電子集團發生 反應，生成重氮產物，形成包被抗原CLE-0VA。制備過程如下將5mg鹽酸克倫特羅溶于0. IM鹽酸水溶液中，得到鹽酸克倫特羅的水溶液，并 預冷至0°C ；向克倫特羅的水溶液中加入IOmg NaNO2,4°C條件下攪拌5h，形成溶液I ；將 20mg0VA溶于0. IM磷酸鹽緩沖溶液中，得到OVA的溶液。將OVA的溶液加到溶液I中，4°C 條件下攪拌6h，得到的溶液中含有克倫特羅與OVA的偶聯物(記作CLE-0VA)；用葡聚糖凝 膠G-25進行純化后，測包被原的濃度，存于4°C備用。2、包被有包被原的酶標板及其制備用包被緩沖液將步驟1制得的克倫特羅與載體蛋白的偶聯物稀釋成5. 0μ g/mL， 每孔加入100 μ L，37°C溫育2h，傾去包被液，用洗滌液稀釋20倍后洗滌3次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μ L封閉液，37°C溫育2h，傾去孔內液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。包被緩沖液pH9. 6,0. 05mol/L的碳酸鈉緩沖液；封閉液每1升封閉液按照如下方法配制將5ml馬血清、Ig疊氮化鈉、30g酪蛋 白混合，用磷酸鹽緩沖液溶解并定容至1000ml，得到封閉液；其中，磷酸鹽緩沖液的濃度為 0. 02M, pH 值為 7. 2。三、試劑盒檢測方法(一)樣品前處理(1)豬尿和血清樣品處理可以直接進行檢測分析；或者在樣品比較混濁時， 2000r/min離心5min或過濾，用上清液檢測。(2)飼料樣品處理將飼料樣品粉碎，稱取Ig置于50mL試管中；加入0. OlM鹽酸 10mL，充分混勻5min ；用鹽酸或氫氧化鈉溶液調整pH值在6. 5 8的范圍；2000r/min離心 5min或過濾；取100 μ L上清液加入400 μ L樣品稀釋液，混勻后取50 μ L用于檢測。(3)液態奶樣品處理稱取ImL液態奶置于IOmL離心管中，加入2mL蒸餾水；加 100 μ L 5Μ鹽酸(至pH 3. 0)，加溫至40°C 3 5min直到奶樣變性，2000r/min離心5min，將 上清液轉移至另一只離心管中，加入100 μ L (2滴)5Μ氫氧化鈉，加入蒸餾水6. 8mL, 2000r/ min離心15min，取100 μ L上清液用400 μ L樣品稀釋液稀釋后取50 μ L用于檢測。(4)豬肉、豬肝樣品處理用超聲儀或類似儀器將組織均質化，稱取6g均質化后 的樣品置于20mL試管中，加12mL 3 %的三氯乙酸，在旋渦振蕩器上振蕩lmin，顛倒混勻 30min, 10000r/min 離心 5min 或 3000r/min 離心 IOmin,將 6mL 上清液轉入 20mL 試管，加 6mL (異丙醇+乙酸乙酯，4+6)振蕩提取20min，放置2min，10000r/min離心5min或3000r/ min離心lOmin，取3mL上層有機相，氮氣吹干，用ImL樣品稀釋液充分溶解，取50 μ L用于 檢測。(二)用試劑盒檢測1、標準曲線的制作向包被有包被原的酶標板微孔中加入克倫特羅標準品溶液50μ L，再加入克倫特 羅單鏈抗體工作液50 μ L，用蓋板膜封板，37°C恒溫箱中反應30min，倒出孔中液體，每孔加 入250 μ L洗滌液，30s后倒出孔中液體，如此重復操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入辣 根過氧化物酶標記的抗HIS抗體工作液100 μ L，37°C恒溫箱中反應30min，倒出孔中液體， 重復洗滌步驟，加入底物顯色液用化學發光檢測儀進行測定。用每個濃度的標準品溶液的發光強度平均值(B)與第一個標準品溶液(O標準) 的發光強度值(Btl)的比值(B/BJ作為縱坐標，以克倫特羅標準品濃度(μ g/L)的對數為橫 坐標，繪制標準曲線，得到的標準曲線如圖1所示。2、樣品中克倫特羅濃度的測定向包被有包被原的酶標板微孔中加入檢測樣本溶液50 μ L，再加入克倫特羅單 鏈抗體工作液50 μ L，用蓋板膜封板，37°C恒溫箱中反應30min，倒出孔中液體，每孔加入 250 μ L洗滌液，30s后倒出孔中液體，如此重復操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入HRP 標記的抗HIS抗體工作液100 μ L，37°C恒溫箱中反應30min，倒出孔中液體，重復洗滌步驟， 加入底物顯色液用化學發光檢測儀進行測定。
用每個檢測樣本溶液的發光強度平均值(B)除以第一個標準品溶液(0標準)的 發光強度值(Btl)的比值，則可從標準曲線上讀出檢測樣本溶液的吸光度值，再根據標準品 溶液的濃度值換算出樣本溶液中克倫特羅的殘留量。四、試劑盒的效果檢測(一)標準品精密度試驗用實驗一中所述試劑盒進行檢測，檢測方法如實驗三中所述。從3個不同批次的 試劑盒中各抽取10個試劑盒(即10個酶標板)進行實驗，每個酶標板抽出20個微孔，測 定20μ g/L的標準品的溶液的發光強度值，計算變異系數，結果見表1。變異系數的計算方法變異系數(CV)=測定結果的標準差與其平均值的百分比。表1標準品精密度試驗結果(CV% )
權利要求
一種單鏈抗體，由重鏈可變區、連接重鏈可變區和輕鏈可變區的短肽、輕鏈可變區依次連接組成，所述重鏈可變區的氨基酸序列如序列1自N末端起第15 132位氨基酸殘基所示，所述輕鏈可變區的的氨基酸序列如序列1自N末端起第148 266位氨基酸殘基所示。
2.根據權利要求1所述的單鏈抗體，其特征在于所述連接重鏈可變區和輕鏈可變區 的短肽的氨基酸序列如序列1自N末端起第133-147位氨基酸殘基所示。
3.權利要求1或2所述單鏈抗體的編碼基因。
4.根據權利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下1)、2)、3)、4) 或5)所示1)所述重鏈可變區的編碼基因為自序列表中序列2的5'末端起第43-396位核苷酸 所示的DNA分子；2)所述輕鏈可變區的編碼基因為自序列表中序列2的5'末端起第442-798位核苷酸 所示的DNA分子；3)所述連接重鏈可變區和輕鏈可變區的短肽的編碼基因為自序列表中序列2的5'末 端起第397-441位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列2自5'末端起第43-798位核苷酸所示的DNA分子；5)在嚴格條件下與1)、2)或3)或4)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子。
5.含有權利要求3或4所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系和表達盒。
6.權利要求1或2所述單鏈抗體在檢測克倫特羅或沙丁胺醇中的應用。
7.—種檢測鹽酸克倫特羅或沙丁胺醇的免疫試劑盒，為下述1)、2)、3)或4)中任一所 述試劑盒1)試劑盒中包括克倫特羅半抗原與載體蛋白的偶聯物、權利要求1或2所述單鏈抗體 和酶標記抗抗體；其中，所述偶聯物作為包被原；2)試劑盒中包括克倫特羅半抗原的酶標記物、權利要求1或2所述單鏈抗體和抗抗體； 其中，所述抗抗體作為包被原；3)試劑盒中包括克倫特羅半抗原的酶標記物、權利要求1或2所述單鏈抗體；其中，所 述權利要求1或2所述單鏈抗體作為包被原；4)試劑盒中包括克倫特羅半抗原與載體蛋白的偶聯物、權利要求1或2所述單鏈抗體 的酶標記物；其中，所述偶聯物作為包被原。
8.根據權利要求7所述的免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒中包括克倫特羅標準 品溶液、洗滌液和樣品濃縮液；所述克倫特羅標準品為鹽酸克倫特羅；所述克倫特羅標準品溶液為如下各濃度的溶液0ng/L、50ng/L、150ng/L、450ng/L、 1350ng/L和 4050ng/L ；每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的將IOml吐溫20，5g疊氮化鈉和990ml 磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 005M-0. 015M，具體為 0. 01M, pH 值為 7. 2-7. 6，具體為 7. 4 ；所述樣品濃縮液為濃度為0. 03mol/L-0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液，具體為0. 04mol/L 的磷酸鹽緩沖液。
9.根據權利要求7或8所述的免疫試劑盒，其特征在于所述克倫特羅半抗原與載體蛋白的偶聯物是按照如下方法制備得到的將每5mg克倫特羅半抗原溶于0. IM鹽酸水溶液 中，得到克倫特羅半抗原的水溶液，并預冷至0°C ；向克倫特羅半抗原的水溶液中加入IOmg NaN02，4°C條件下攪拌5h，形成溶液I ；將20mg載體蛋白溶于0. IM磷酸鹽緩沖溶液中，得到 載體蛋白的溶液；將載體蛋白的溶液加到溶液I中，4°C條件下攪拌6h，得到所述克倫特羅 半抗原與載體蛋白的偶聯物；所述克倫特羅半抗原為鹽酸克倫特羅；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、 鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、兔血清白蛋白、血藍蛋白或卵清白蛋白；所述抗抗體為鼠抗HIS標簽單克隆抗體。
10. 一種檢測鹽酸克倫特羅或沙丁胺醇的方法，包括如下步驟1)將待測樣品進行前處理，得到待測樣本溶液；2)用權利要求7-9中任一所述免疫試劑盒對所述待測樣本溶液進行檢測；所述前處理的方法為下述a)、b)、c)和d)中的任一a)所述待測樣品為豬尿或血清樣品；將所述豬尿或血清樣品直接作為待測樣本溶液， 或將所述豬尿或血清樣品離心或過濾，取上清液或濾液，得到待測樣本溶液；b)所述待測樣品為飼料；將每Ig所述待測樣品與IOmL0. OlM鹽酸水溶液混勻，調整 pH值至6. 5 8，2000r/min離心5min,取100 μ L上清液；將所述100 μ L上清液與400 μ L 樣品稀釋液混勻，即得到待測樣本溶液；c)所述待測樣品為液態奶；將每ImL液態奶、2mL蒸餾水和100μ L 5M鹽酸水溶液混 合，在40°C保持3 5min，2000r/min離心5min，取上清液，記作上清液I ；將所述上清液I 與100 μ L 5Μ氫氧化鈉水溶液和6. 8mL蒸餾水混合，2000r/min離心15min，取上清液，記作 上清液II ；用400 μ L樣品稀釋液稀釋所述上清液II，得到的溶液即為待測樣本溶液；d)所述待測樣品為豬肉或豬肝；將每6g所述待測樣品的均質化組織與12mL3% (質 量百分含量)的三氯乙酸水溶液混合，并顛倒混勻30min，10000r/min離心5min或3000r/ min離心lOmin，取上清液；將所述上清液與異丙醇和乙酸乙酯的混合溶液等體積比混合， 振蕩提取20min，放置2min，10000r/min離心5min或3000r/min離心lOmin，取3mL上層有 機相，氮氣吹干，用ImL樣品稀釋液溶解，得到的溶液即為所述待測樣本溶液；所述異丙醇 和乙酸乙酯的混合溶液中，異丙醇與乙酸乙酯的體積比為4 6；所述樣品稀釋液為將所述樣品濃縮液稀釋20倍得到的。
全文摘要
本發明公開了一種檢測克倫特羅的免疫試劑盒及其專用抗體。該種單鏈抗體，由重鏈可變區、連接重鏈可變區和輕鏈可變區的短肽、輕鏈可變區依次連接組成，所述重鏈可變區的氨基酸序列如序列1自N端起第15-132位氨基酸殘基所示，所述輕鏈可變區的氨基酸序列如序列1自N端起第148-266位氨基酸殘基所示。本發明抗體的親和常數為8.06×109L/mol、半數抑制量(IC50)為0.076ng/mL。本發明為食品中克倫特羅殘留檢測方法的建立提供高效價、高特異性的抗體來源。本發明試劑盒的靈敏度高、準確度高、精密度高、對克倫特羅和沙丁胺醇的特異性好。另外，本發明試劑盒成本低廉。因此，本發明的抗體及試劑盒及檢測方法在克倫特羅和沙丁胺醇的檢測中將發揮重大作用。
文檔編號C12N1/21GK101955541SQ201010165190
公開日2011年1月26日 申請日期2010年5月6日 優先權日2010年5月6日
發明者劉丹, 吳小平, 徐飛, 李杰超, 李艷偉, 楊光, 江海洋, 沈建忠, 王奇昌, 王富偉, 王戰輝, 王照鵬 申請人:北京維德維康生物技術有限公司