一種喹諾酮藥物抗體及其應用的制作方法

專利名稱：一種喹諾酮藥物抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種喹諾酮藥物抗體及其應用。
背景技術：
喹諾酮類(4-quinolones，QNs)，又稱吡酮酸類或吡啶酮酸類，是一類合成抗菌藥， 主要作用于革蘭陰性菌。喹諾酮按發明先后及其抗菌性能的不同，分為一、二、三、四代。第 一代喹諾酮類，具體品種有萘啶酸和吡咯酸等，因抗菌譜及臨床應用范圍均較窄，現已不使 用。第二代喹諾酮類，吡哌酸是國內主要應用品種，在抗菌譜方面有所擴大，但僅用于泌尿 道和腸道感染，目前已少用。第三代喹諾酮類有氟哌酸等一系列藥物，抗菌譜進一步擴大， 對葡萄球菌等革蘭陽性菌也有抗菌作用，對一些革蘭陰性菌的抗菌作用則進一步加強。第 四代喹諾酮類抗菌藥包括恩諾沙星、諾氟沙星、依諾沙星、氧氟沙星、環丙沙星、麻保沙星、 雙氟沙星、單諾沙星、培氟沙星和羅氟沙星等，已廣泛應用于動物源性食品的生產中。隨著氟喹諾酮類抗菌藥在獸醫臨床和水產養殖中的應用，其殘留問題已引起廣泛 的關注。QNs殘留除了其毒副作用對人直接危害外，更為嚴重的是其耐藥菌株正逐年上升， 新開發的氟喹諾酮類藥品的市場周期大大縮短。因此，必須重視氟喹諾酮類藥物在動物性 食品中的殘留問題。食品添加劑聯合專家委員會和歐盟都對于QNs的MRLs作了規定。目前 用于檢測QNs殘留的方法有微生物法、免疫分析法、高效液相色譜法(LC)、液相色譜-質 譜(LC-MS)法和酶聯免疫吸附分析(ELISA)。目前，用于免疫檢測的抗體都是單克隆抗體或 多克隆抗體。單克隆抗體或多克隆抗體的制備必須通過細胞培養獲得，整個生產過程復雜， 消耗時間長，費用高，且不易進行操作。單鏈抗體是將抗體重鏈可變區和輕鏈可變區基因通 過一個短肽鏈連接后融合表達出來的抗體片斷，具有分子量小、特異性高、結合力強、易于 利用基因工程技術操作等優點。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測喹諾酮藥物的單鏈抗體及其編碼基因。本發明所提供的單鏈抗體，由重鏈可變區、連接重鏈可變區和輕鏈可變區的短肽、 輕鏈可變區依次連接組成，所述重鏈可變區的氨基酸序列如序列1自N末端起第1-121位 氨基酸殘基所示，所述輕鏈可變區的的氨基酸序列如序列1自N末端起第137-249位氨基 酸殘基所示。上述單鏈抗體中，所述連接重鏈可變區和輕鏈可變區的短肽的氨基酸序列如序列 1自N末端起第122-136位氨基酸殘基所示。所述編碼基因為如下1)、2)、3)、4)或5)所示1)所述重鏈可變區的編碼基因為自序列表中序列2的5'末端起第1-363位核苷 酸所示的DNA分子；2)所述輕鏈可變區的編碼基因為自序列表中序列2的5'末端起第409-747位核 苷酸所示的DNA分子；
3)所述連接重鏈可變區和輕鏈可變區的短肽的編碼基因為自序列表中序列2的 5'末端起第364-408位核苷酸所示的DNA分子；4)自序列表中序 列2所示的DNA分子；5)在嚴格條件下與1)、2)或3)或4)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA 分子。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系和表達盒也屬于 本發明的保護范圍。上述任一所述單鏈抗體在檢測喹諾酮藥物中的應用也屬于本發明的保護范圍；所 述喹諾酮藥物為如下中的至少一種環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、達氟沙星、 氟甲喹、惡喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星和依諾沙星。本發明的另一個目的是提供檢測喹諾酮藥物的免疫試劑盒。本發明所提供的檢測喹諾酮藥物的免疫試劑盒，為下述1)、2)、3)或4)中任一所 述試劑盒1)試劑盒中包括喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物、上述任一所述單鏈抗體 和酶標記抗抗體；其中，所述偶聯物作為包被原；2)試劑盒中包括喹諾酮藥物半抗原的酶標記物、上述任一所述單鏈抗體和抗抗 體；其中，所述抗抗體作為包被原；3)試劑盒中包括喹諾酮藥物半抗原的酶標記物、上述任一所述單鏈抗體；其中， 所述單鏈抗體作為包被原；4)試劑盒中包括喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物、上述任一所述單鏈抗體 的酶標記物；其中，所述偶聯物作為包被原。上述任一所述免疫試劑盒中，所述試劑盒中包括喹諾酮藥物標準品溶液、洗滌液 和樣品濃縮液；所述喹諾酮藥物標準品為環丙沙星；所述喹諾酮藥物標準品溶液為如下各濃度的溶液0 μ g/L、1 μ g/L、3 μ g/L、9 μ g/ L、27y g/L、81y g/L ；每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的將IOml吐溫20，5g疊氮化鈉和 990ml磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 005M-0. 015M, 具體為0. 01M, pH值為7. 2-7. 6，具體為7. 4 ；所述樣品濃縮液為濃度為0. 03mol/L-0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液，具體為 0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物是按照如下方法制備的將每 0. Immol喹諾酮藥物半抗原和0. 12mmolNHS溶解在2mL DMF和HCl的混合溶液中，DMF禾口 HCl的混合溶液中DMF與HCl的體積比為1 1，磁力攪拌，得到溶液I ；向所述溶液I中滴 力口 ImL DCC和DMF的混合溶液，DCC和DMF的混合溶液中DCC的濃度為0. 15mmol/ml, 25°C 攪拌lh，4°C冰箱攪拌12h，離心，取上清液；將所述上清液逐滴加到5mL載體蛋白的溶液中， 25°C攪拌0. 5h，透析，得到所述喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物；所述載體蛋白的 溶液按照如下方法制備用PH值為8. 0、濃度為0. 2mol/L的碳酸緩沖液將45mg載體蛋白 溶解，并定容至5ml，得到所述載體蛋白的溶液；所述喹諾酮藥物半抗原為環丙沙星；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、兔血清白蛋白、血藍蛋白或卵清白蛋白；所述抗抗體為鼠抗HIS標簽單克隆抗體。所述樣品稀釋液為將所述樣品濃縮液稀釋20倍得到的。 本發明的另一個目的是提供一種檢測喹諾酮藥物的膠體金試紙。本發明所提供的檢測喹諾酮藥物的膠體金試紙，包括樣品吸收墊、膠體金墊、反應 膜和吸水墊，其依次連接；所述膠金墊包被有膠體金標記的上述任一所述單鏈抗體；所述 反應墊上含有檢測帶和質控帶，檢測帶位置包被有上述任一所述喹諾酮藥物半抗原與載體 蛋白的偶聯物，質控帶位置包被有鼠抗HIS標簽單克隆抗體。本發明的另一個目的是提供一種檢測樣品中喹諾酮藥物的方法。本發明所提供的檢測樣品中喹諾酮藥物的方法，為如下I)或II)所示I)檢測樣品中喹諾酮藥物的方法包括如下步驟1)將待測樣品進行前處理，得到待測樣本溶液；2)用上述任一所述免疫試劑盒對所述待測樣本溶液進行檢測；所述前處理的方法為下述a)、b)和C)中的任一a)所述待測樣品為畜禽的肉、畜禽的肝臟或水產；將每3g所述待測樣品的均質樣 品與9mL乙腈和氫氧化鈉水溶液的混合溶液混勻，4000r/min離心lOmin，取4mL上清液，加 入0. 02mol/L PBS緩沖液4mL，再加入二氯甲烷8mL，振蕩lOmin，4000r/min離心lOmin，取 下層有機相6mL，加入樣品稀釋液0. 5mL和正己烷lmL，渦動2min，4000r/min離心lOmin，取 下層清夜，即得到待測樣本溶液；所述乙腈和氫氧化鈉水溶液的混合溶液中乙腈與氫氧化 鈉水溶液的體積比為84 16，所述氫氧化鈉水溶液中氫氧化鈉的濃度為0. lmol/L;b)所述待測樣品為蛋；用乙腈對所述待測樣品進行提取，離心，取上清液；將所述 上清液脫脂，得到待測樣本溶液；具體為將每2g所述待測樣品的均質樣品與SmL乙腈振 蕩混合5min，4000r/min離心5min，取上清液2mL，氮氣吹干，用ImL正己烷溶解，渦動lmin， 加入樣品稀釋液lmL，渦動2min，4000r/min離心5min，取下層清夜，即得到待測樣本溶液；c)所述待測樣品為蜂蜜；將每Ig所述待測樣品與2mL PBS緩沖溶液振蕩混合 5min，再加入8mL 二氯甲烷，振蕩5min，4000r/min離心5min，取下層有機相4mL，氮氣吹干， 用ImL樣品稀釋液溶解，得到的溶液即為待測樣本溶液；II)檢測樣品中喹諾酮藥物的方法包括如下步驟1)將待測樣品進行前處理，得到待測樣本溶液；2)用上述任一所述膠體金試紙卡對所述待測樣本溶液進行檢測；所述前處理的方法為下述a)、b)和C)中的任一a)所述待測樣品為牛奶；將樣品稀釋液和牛奶混合，得到的混合溶液即為待測樣 本溶液；所述樣品稀釋液和牛奶的體積比為(3-5) 1或4 1;b)所述待測樣品為畜禽的肉、畜禽的肝臟或水產；將每Ig所述待測樣品的勻漿組 織與4mL 0. 02M、pH 7. 4的PBS緩沖液混合均勻，3000轉離心5min，取上清液，即為待測樣 本溶液；c)所述待測樣品為蜂蜜；將蜂蜜與提取劑混合，得到的混合溶液為待測樣本溶 液；具體為將每Ig蜂蜜與4mL提取劑混合均勻，得到的混合溶液即為待測樣本溶液；每1 升所述提取劑由5ml Tween-20和995ml 0. 02M的PBS緩沖液組成，提取劑的pH值為7. 4 ；
所述喹諾酮藥物為如下中的至少一種環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、 達氟沙星、氟甲喹、惡喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星和依諾沙星；所述樣品稀釋液為將所述樣品濃縮液稀釋20倍得到的上述試劑盒既可以為酶聯免疫試劑盒，又可為發光免疫試劑盒，當為酶聯免疫試 劑盒時，所述試劑盒中包括底物顯色液；所述底物顯色液由A液和B液組成，所述A液為濃 度為1. 5% -2. 5%的過氧化脲的水溶液，B液為濃度為0. 5% -1. 5%的四甲基聯苯胺的水 溶液；所述A液優選為濃度為2 %的過氧化脲的水溶液，B液優選為濃度為1 %的四甲基 聯苯胺的水溶液。本發明的單鏈抗體(scFv)是用基因工程方法將抗體重鏈可變區(VH)和 輕鏈可變區(VL)通過一段連接肽(Linker)連接而成的重組抗體，是保持了親本抗體的抗 原親和活性和特異性的最小功能性抗體片段，可通過基因工程技術體外表達得到，可在細 菌中很經濟地大規模生產，從而使得免疫檢測抗體的生產變得非常容易、簡便和經濟，進而 大大減少檢測試劑的費用，比雜交瘤細胞培養得到單抗的方法要簡單得多。本發明抗體的 親和常數為3. 74X 109L/mol、半數抑制量(IC5tl)為1. 5ng/mL。本發明為食品中喹諾酮藥物 殘留檢測方法的建立提供高效價、高特異性的抗體來源。本發明試劑盒和膠體金試紙卡具有靈敏度高、準確度高、精密度高、成本低、操作 簡單、檢測時間短、適合各種單位使用、儲存簡單、保質期長的優點；能同時快速檢測大批量 樣品，可實現現場高通量快速檢測。本發明試劑盒和膠體金試紙卡可以同時檢測環丙沙星、 恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、達氟沙星、氟甲喹、噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星、 依諾沙星多種藥物，將在喹諾酮類藥物的檢測中發揮重要作用。因此，本發明的抗體、試劑 盒、膠體金試紙及檢測方法在喹諾酮藥物的檢測中將發揮重大作用。


圖1為試劑盒標準曲線。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、抗體的制備及功能檢測一、喹諾酮藥物單鏈抗體的制備(一 )抗體的篩選取6個月雄性Balb/c小鼠，Trizol —步法提取脾細胞總RNA，純化得到mRNA，再逆 轉錄得到cDNA。使用全套引物，以cDNA為模板分別擴增得到重鏈可變區(VH)、輕鏈可變區 (VL)基因，經疊加延伸聚合酶鏈式反應(Overlap-PCR)將VH、VL基因隨機拼接為單鏈抗體 基因(ScFv)，然后將ScFv與載體pCANTAB5E連接得pCANTAB5E/ScFv，并轉化大腸桿菌TGl， 即得到鼠源非免疫單鏈抗體庫。用ELISA方法篩選得到帶有特異性的抗多種喹諾酮類藥物 的單鏈抗體的噬菌體顆粒，通過測序得到其相應的核苷酸序列。該單鏈抗體的編碼基因序列如序列表中序列2所示，自序列2的5'末端起第 1-363位核苷酸編碼重鏈可變區，自序列2的5'末端起第409-747位核苷酸編碼輕鏈可變區，自序列2的5'末端起第364-408位核苷酸編碼短肽。該單 鏈抗體由重鏈可變區、連接所述重鏈可變區和輕鏈可變區的短肽、輕鏈可變 區順次連接組成。該抗體的氨基酸序列如序列表中序列1所示，自序列1的N端起第1-121 位氨基酸殘基為重鏈可變區的氨基酸序列，自序列1的N端起第137-249位氨基酸殘基為 輕鏈可變區的氨基酸序列，自序列1的N端起第122-136位氨基酸殘基為短肽序列。(二)抗體的制備表達載體pET20b購自德國N0VAGEN公司；大腸桿菌Escherichia coli BL21購自 德國 N0VAGEN公司；蛋白純化用 HisLink Protein Purification Resin購自美國 Promega 公司，產品目錄號為V8823。合成序列表中序列2所示基因，并在兩端引入酶切位點Xba I和Not I，用限制性 內切酶Xba I和Not I酶切，回收目的基因片段；用限制性內切酶Xba I和Not I酶切表達 載體pET20b，回收載體大片段；連接，連接產物轉化大腸桿菌，篩選培養，挑取單克隆；將單 克隆接入液體培養基進一步培養，提取質粒，酶切和測序驗證，結果測得的序列如序列表中 序列2所示，表明重組載體中基因插入方向和序列均正確，將陽性重組載體記作重組表達 載體 pET20b/ScFv。采用氯化鈣法將重組表達載體pET20b/ScFv轉化大腸桿菌BL21，抗性篩選，經菌 液PCR及質粒酶切驗證，得到含有重組表達載體pET20b/ScFv的重組大腸桿菌，記作重組大 腸桿菌 BL21/pET20b/ScFv。2XTY培養液的組成由胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl和水組成，每1升2XTY培養 液中胰蛋白胨的濃度為1.6%、酵母提取物的濃度為l%、NaCl的濃度為0.5%;各百分含量 均為質量百分含量。含氨芐青霉素、氯霉素和葡萄糖的2XTY培養液是按照如下方法得到的向2XTY 培養液中添加氨芐青霉素、氯霉素和葡萄糖，使氨芐青霉素在溶液中的終濃度為IOOyg/ ml，使氯霉素在溶液中的終濃度為34 μ g/ml，使葡萄糖在溶液中的終濃度為1 % (質量百分 含量)。發酵重組菌將重組大腸桿菌BL21/pET20b/ScFv的單個陽性菌落接種至含氨芐 青霉素、氯霉素和葡萄糖的2 X TY培養液中，37°C振搖，至培養體系的A6tltl為0. 6時，收集細 菌；將細菌重懸于2ml LB液體培養基中，按1 20的體積比將菌懸液接種至50ml含相同 濃度抗生素的LB液體培養基中(含相同濃度抗生素的LB液體培養基的組成氨芐青霉素、 氯霉素、酵母提取物、蛋白胨、NaCl和水組成；溶液中各成分的濃度為酵母提取物0. 5%, 蛋白胨1 %，NaCl 1 %，氨芐青霉素100 μ g/ml，氯霉素34 μ g/ml)，37°C振搖，至培養體系的 A600 為 0. 6 時，加 IPTG(0. 7mmol/L)誘導，30°C振搖 2. 5h，在 4°C下 5000r/min 離心 lOmin， 收獲細菌。用洗滌液(將20mmol Tris和0. 15mol NaCl用水溶解，用HCL調PH值至8. 0， 再用水定容至1L，得到1升洗滌液)洗滌1次，加溶菌液(將20mmol TrisUOml Triton Χ-100、250 μ mol PMSF、62. 5 X IO4U溶菌酶用水溶解，用HCL調PH值至8. 0，再用水定容至 1L，得到1升溶菌液)，30°C放置15min，然后在冰上超聲處理(輸出功率80% ) 10s，停10s， 反復3次，至細胞不再粘稠。在4°C 2000Xg離心20min，分別收集上清及沉淀。將沉淀用結 合緩沖液I (將20mmol Tris,0. 5mol Nacl和5_1咪唑用水溶解，用HCL調PH值至8. 0， 再用水定容至1L，得到1升結合緩沖液I)洗滌一次，而后，懸于結合緩沖液11(將20mmolTris、0. 5mol Nacl、5mmol咪唑和6mol尿素用水溶解，用HCL調PH值至8. 0，再用水定容至 1L，得到1升結合緩沖液II)中，4°C，12000 X g離心20min,收集上清，經0. 45mm濾膜過濾， 收集濾液，得到抗體的粗制液。純化利用表達載體上帶有的組氨酸標簽(His-tag)標記通過親和層析純化單鏈 抗體蛋白。將 HisLink Protein Purification Resin 裝柱，以 10 倍柱體積的 binding buffer (將 lOOmmolHEPES、IOmmol 咪唑和 500mmol NaCl 用水溶解，再調節 pH 值至 7. 5，然 后用水定容至1升，得到1升binding buffer)平衡純化柱，取抗體的粗制液上樣，然后用5 倍柱體積的wash buffer (將lOOmmolHEPES、IOOmmol咪唑和用水溶解，再調節pH值至7. 5， 然后用水定容至1升，得到1升wash buffer)洗脫雜蛋白，最后用10倍柱體積的elution buffer (將lOOmmolHEPES、250mmol咪唑用水溶解，再調節pH值至7. 5，然后用水定容至1 升，得到1升elution buffer)洗脫目標蛋白，收集洗脫液，透析，得到純化的抗體。蛋白驗證Western blot 收集上述各階段產物，進行12 % SDS-PAGE電泳；將電 泳條帶印跡到NC膜上，再與HRP標記的環丙沙星雜交，檢測發光條帶。環丙沙星購自美國 Sigma-Aldrich公司，產品目錄號為33434
同時以轉入空載體pET20b的大腸桿菌BL21作為對照，并按照上述方法進行表達 和純化，和Western blot檢測。Western blot檢測結果表明1)實驗組得到的蛋白具有與環丙沙星結合的功能， 蛋白的分子量為29kD，與預期的蛋白分子量一致，表明目的蛋白為與環丙沙星結合的抗體。 2)對照組沒有檢測到任何與環丙沙星結合的蛋白條帶。(三)抗體的功能檢測1、用ELISA方法，檢測抗體的半抑制率(IC50)a、將實施例2中制備得到的偶聯物(CIP-BSA)用包被緩沖液溶解，得到CIP-BSA 的溶液(該溶液中CIP-BSA的濃度為1 μ g/ml)。包被緩沖液pH9. 6,0. lmol/L的碳酸鈉緩 沖液。向96孔板的孔中加入CIP-BSA的溶液，100 μ L每孔，37°C溫育2h ；傾去包被液，用 PBST溶液(PBS+0. 05% Tween20)洗滌3次，250 μ L每孔，每次30s，甩干孔中液體；b、然后向每孔中加入200μ L2% BSA封閉液，37°C溫育2h，傾去孔內液體；用PBST 溶液(PBS+0. 05% Tween20)洗滌3次，250 μ L每孔，每次30s，甩干孔中液體。c、向孔中加入單鏈抗體溶液和不同濃度的CIP標準品溶液，各50 μ L每孔，37°C孵 育1小時。以只加入單鏈抗體溶液不加入CIP標準品溶液的孔作陽性對照。單鏈抗體溶液的制備用樣品稀釋液稀釋實驗(二)中的純化抗體得到溶液，抗體 在溶液中的濃度為5ng/mL ；樣品稀釋液為0. 002mol/L的磷酸鹽緩沖液。不同濃度的CIP溶液的制備用樣品稀釋液稀釋CIP得到溶液。d、用PBST溶液(PBS,0. 05% Tween20)洗滌3次，250 μ L每孔，甩干孔中液體，力口 入HRP標記的鼠抗His標簽單克隆抗體，37°C孵育1小時；e、用 PBST 溶液(PBS，0. 05% Tween20)洗滌 3 次，250 μ L 每孔；加入 TMB 顯色，37°C 反應10分鐘，加入2M硫酸終止顯色反應，每孔50 μ L，使用酶標儀進行讀數。實驗設3次重復。結果如下
1)吸光度值與每孔所加入的標準品溶液中CIP的濃度成反比；證明，所表達純化 得到的單鏈抗體具有針對CIP的結合特異性，并呈現線性關系，說明該抗體可用于對CIP的 免疫檢測。2)半抑制率(IC5tl)陽性對照孔(即不添加CIP標準品溶液的孔)的吸光度值為 B0,各實驗孔的吸光度值為B，當BziBci為50%時所對應的CIP標準品溶液的濃度即為半抑制 率(IC5tl)。該單抗的半抑制率(IC5tl)為1. 5ng/mL。2、抗體的親和常數測定方法取定量的一定稀釋度的抗體，分別加入逐漸增加 的抗原里，可使抗體的結合 達到飽和，以結合部分(B)為縱坐標，抗原濃度(mol/L)為橫坐標繪制飽和曲線，求出抗體 飽和程度為50%時的游離抗原濃度，其倒數即為該抗體在此稀釋度下的親和常數。結果抗體的親和常數為3· 74X 109L/mol。實施例2、檢測喹諾酮藥物的酶聯免疫試劑盒及其制備本實驗中的樣品稀釋液即為實驗一種所述試劑盒中的樣品稀釋液。本實驗中的洗板液即為實驗一種所述試劑盒中的洗滌液。一、酶聯免疫試劑盒由下述物質組成1、包被環丙沙星與載體蛋白偶聯物的酶標板；2、喹諾酮抗體實施例1總所述單鏈抗體。抗體工作液的濃度為5. Ong/mL，抗體 工作液是用樣品稀釋液稀釋實施例1中的純化抗體得到的到的；3、喹諾酮標準品喹諾酮標準品為環丙沙星(CIP)，標準品溶液濃度分別為Oyg/ L、ly g/L、3y g/L、9y g/L、27y g/L、81y g/L ；環丙沙星(CIP)購自美國 Sigma-Aldrich 公 司；產品目錄號為33434 ；用樣品稀釋液稀釋成上述各濃度；4、酶標二抗辣根過氧化物酶(HRP)標記的鼠抗HIS標簽單克隆抗體；購自美國 Sigma-Aldrich公司，產品目錄號為A7058。5、底物顯色液由A液和B液組成，A液為2%過氧化脲的水溶液，B液為1 %四甲 基聯苯胺的水溶液；6、終止液0· 2M硫酸水溶液；7、洗滌液每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的將IOml吐溫20、5g疊 氮化鈉和990ml磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 01M, PH值為7.4;8、樣品濃縮液0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液；將其進行20倍稀釋，成為樣品稀釋液
后使用。二、試劑盒組分的制備(一)包被原的制備以環丙沙星(CIP)作為喹諾酮半抗原。載體蛋白為BSA。NHS的全稱為N-羥基琥珀酰亞胺；DMF的全稱為N，N- 二甲基甲酰胺；DCC的全 稱為二環己基碳二亞胺；將0. Immol喹諾酮藥物半抗原和0. 12mmolNHS溶解在2mL DMF和HCl的混合溶液 中，DMF和HCl的混合溶液中DMF與HCl的體積比為1 1，磁力攪拌，得到溶液I ；向所述溶 液I中滴加ImL DCC和DMF的混合溶液，DCC和DMF的混合溶液中DCC的濃度為0. 15mmol/ml (DCC為固體，溶解于DMF中)，25°C攪拌lh，4°C冰箱攪拌12h，離心，取上清液；將所述 上清液逐滴加到5mLBSA的溶液中，BSA的溶液按照如下方法配制用pH值為8. O、濃度為 0. 2mol/L的碳酸緩沖液將45mg BSA溶解，并定容至5ml，25°C攪拌0. 5h，透析，得到所述環 丙沙星與BSA的偶聯物(記作CIP-BSA)。( 二 )包被有包 被原的酶標板及其制備包被有合成抗原CIP-BSA的聚苯乙烯酶標板用IOmM的碳酸鹽溶液將抗原作 1 50000倍稀釋(6. Oyg/mL)，包被96孔聚苯乙烯酶標板，每孔100yL，37°C溫育2h，傾 去包被液，用洗板液稀釋20倍后洗滌3次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200 μ L封閉 液，37°C溫育2h，傾去孔內液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。包被緩沖液pH9. 6,0. 05mol/L的碳酸鈉緩沖液；封閉液每1升封閉液按照如下方法配制將5ml馬血清、Ig疊氮化鈉、30g酪蛋 白混合，用磷酸鹽緩沖液溶解并定容至1000ml，得到封閉液；其中，磷酸鹽緩沖液的濃度為 0. 02M, pH 值為 7. 2。三、試劑盒檢測方法(一)樣品前處理1、檢測樣本為畜禽的肉、畜禽的肝臟或水產取3g的均質樣品分別加入乙 腈-0. lmol/L 氫氧化鈉水溶液(84 :16，V/V)9mL，振蕩混合 IOmin, 4000r/min 離心 IOmin, 取4mL上清液，加入0. 02mol/L PBS緩沖液4mL，再加入二氯甲烷8mL，振蕩lOmin，4000r/ min離心lOmin，取下層有機相6mL，氮氣吹干；加入樣品稀釋液0. 5mL,加入正己烷lmL，渦 動2min，4000r/min離心lOmin，取下層清夜50 μ L進行檢測。2、檢測樣本為雞蛋取2g的均質樣品，加入8mL乙腈，振蕩混合5min，4000r/min 離心5min，取上清2mL，氮氣吹干；加入正己烷lmL，渦動lmin，加入樣品稀釋液lmL，渦動 2min,4000r/min離心5min，取下層清夜50 μ L進行檢測。3、檢測樣本為蜂蜜取Ig的樣品，加入PBS緩沖溶液2mL，振蕩混合5min后，加入 二氯甲烷8mL，振蕩5min，4000r/min離心5min，取下層有機相4mL，氮氣吹干；用ImL樣品 稀釋液復溶，取50 μ L進行檢測。(二)用試劑盒檢測1、標準曲線的制作向包被有包被原的酶標板微孔中加入環丙沙星標準品溶液50μ L，再加入環丙沙 星單鏈抗體工作液50 μ L，用蓋板膜封板，37°C恒溫箱中反應30min，倒出孔中液體，每孔加 入250 μ L洗滌液，30s后倒出孔中液體，如此重復操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入酶 標二抗工作液ΙΟΟμ L，37°C恒溫箱中反應30min，倒出孔中液體，重復洗滌步驟，每孔加入 底物顯色液，輕輕振蕩混勻，37°C恒溫箱避光顯色15min，每孔加入終止液50 μ L，輕輕振蕩 混勻，用酶標儀，測定每孔吸光度值。用每個濃度的標準品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標準品溶液(0標準) 的吸光度值(Btl)再乘以100%，得到百分吸光度值。以環丙沙星標準品濃度(yg/L)的半 對數值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。得到的標準曲線如圖1所示。百分吸光度值(%) = (B/B0) X100%2、樣品中喹諾酮濃度的測定
向包被有包被原的酶標板微孔中加入檢測樣本溶液50 μ L，再加入喹諾酮抗體工 作液50 μ L，用蓋板膜封板，37°C恒溫箱中反應30min，倒出孔中液體，每孔加入250 μ L洗滌 液，30s后倒出孔中液體，如此重復操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入辣根過氧化物酶 標記的二抗工作液100μ L，37°C恒溫箱中反應30min，倒出孔中液體，重復洗滌步驟，每孔 加入混合底物顯色液100 μ L，輕輕振蕩混勻，37°C恒溫箱避光顯色15min，每孔加入終止液 50 μ L，輕輕振蕩混勻，用酶標儀，測定每孔吸光度值。結果判斷用每個檢測樣本溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標準品溶液(0標 準)的吸光度值(Btl)再乘以100%，得到百分吸光度值。相對應每一個檢測樣本溶液的百 分吸光度值，則可從標準曲線上讀出檢測樣本溶液的吸光度值，再根據標準品溶液的濃度 值換算出樣本溶液中喹諾酮藥物的殘留量。四、試劑盒檢測效果評價(一)準確度和精密度試驗向不含喹諾酮藥物的樣品(雞肉、豬肉、雞肝、魚肉、蝦肉及雞蛋、蜂蜜)中添加 如下藥物環丙沙星(CIP);使各添加藥物在樣品中的濃度為分別為20、40、6(^8/1^(或 yg/L)。蜂蜜樣品的添加濃度與雞肉一致。將添加后的樣品分別按照實驗三中所述方法進行前處理，得到檢測樣本溶液。從三個不同批次的試劑盒中各抽取3個試劑盒進行檢測，每個實驗重復5次，分別 計算變異系數。結果分別見表1。表1精密度試驗結果
權利要求
一種單鏈抗體，由重鏈可變區、連接重鏈可變區和輕鏈可變區的短肽、輕鏈可變區依次連接組成，所述重鏈可變區的氨基酸序列如序列1自N末端起第1 121位氨基酸殘基所示，所述輕鏈可變區的的氨基酸序列如序列1自N末端起第137 249位氨基酸殘基所示。
2.根據權利要求1所述的單鏈抗體，其特征在于所述連接重鏈可變區和輕鏈可變區 的短肽的氨基酸序列如序列1自N末端起第122-136位氨基酸殘基所示。
3.權利要求1或2所述單鏈抗體的編碼基因。
4.根據權利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下1)、2)、3)、4) 或5)所示1)所述重鏈可變區的編碼基因為自序列表中序列2的5'末端起第1-363位核苷酸所 示的DNA分子；2)所述輕鏈可變區的編碼基因為自序列表中序列2的5'末端起第409-747位核苷酸 所示的DNA分子；3)所述連接重鏈可變區和輕鏈可變區的短肽的編碼基因為自序列表中序列2的5'末 端起第364-408位核苷酸所示的DNA分子；4)自序列表中序列2所示的DNA分子；5)在嚴格條件下與1)、2)或3)或4)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子。
5.含有權利要求3或4所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系和表達盒。
6.權利要求1或2所述單鏈抗體在檢測喹諾酮藥物中的應用，所述喹諾酮藥物為如下 中的至少一種環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、達氟沙星、氟甲喹、惡喹酸、麻保 沙星、氨氟沙星、培氟沙星和依諾沙星。
7.—種檢測喹諾酮藥物的免疫試劑盒，為下述1)、2)、3)或4)中任一所述試劑盒1)試劑盒中包括喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物、權利要求1或2所述單鏈抗 體和酶標記抗抗體；其中，所述偶聯物作為包被原；2)試劑盒中包括喹諾酮藥物半抗原的酶標記物、權利要求1或2所述單鏈抗體和抗抗 體；其中，所述抗抗體作為包被原；3)試劑盒中包括喹諾酮藥物半抗原的酶標記物、權利要求1或2所述單鏈抗體；其中， 權利要求1或2所述單鏈抗體作為包被原；4)試劑盒中包括喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物、權利要求1或2所述單鏈抗 體的酶標記物；其中，所述偶聯物作為包被原。
8.根據權利要求7所述的免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒中包括喹諾酮藥物標準品溶液、洗滌液和樣品濃縮液；所述喹諾酮藥物標 準品為環丙沙星；所述喹諾酮藥物標準品溶液為如下各濃度的溶液ο μ g/L、l μ g/L、3 μ g/L、9 μ g/L、 27μ g/L、81y g/L ；每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的將IOml吐溫20，5g疊氮化鈉和990ml 磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 005M-0. 015M，具體為 0. 01M, pH 值為 7. 2-7. 6，具體為 7. 4 ；所述樣品濃縮液為濃度為0. 03mol/L-0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液，具體為0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物是按照如下方法制備的將每0. Immol喹 諾酮藥物半抗原和0. 12mmol NHS溶解在2mL DMF和HCl的混合溶液中，DMF和HCl的混合 溶液中DMF與HCl的體積比為1 1，磁力攪拌，得到溶液I ；向所述溶液I中滴加ImL DCC 和DMF的混合溶液，DCC和DMF的混合溶液中DCC的濃度為0. 15mmol/ml，25°C攪拌lh，4°C 冰箱攪拌12h，離心，取上清液；將所述上清液逐滴加到5mL載體蛋白的溶液中，25°C攪拌 0. 5h，透析，得到所述喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物；所述載體蛋白的溶液按照如 下方法制備用PH值為8. 0、濃度為0. 2mol/L的碳酸緩沖液將45mg載體蛋白溶解，并定容 至5ml，得到所述載體蛋白的溶液；所述喹諾酮藥物半抗原為環丙沙星；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠 血清蛋白、甲狀腺蛋白、兔血清白蛋白、血藍蛋白或卵清白蛋白；所述抗抗體為鼠抗HIS標簽單克隆抗體。
9.一種檢測喹諾酮藥物的膠體金試紙，包括樣品吸收墊、膠體金墊、反應膜和吸水墊， 其依次連接；所述膠體金墊包被有膠體金標記的權利要求1或2所述單鏈抗體；所述反應 膜上含有檢測帶和質控帶，檢測帶位置包被有權利要求8中所述喹諾酮藥物半抗原與載體 蛋白的偶聯物，質控帶位置包被有鼠抗HIS標簽單克隆抗體。
10.一種檢測樣品中喹諾酮藥物的方法，為如下I )或II )所示I)檢測樣品中喹諾酮藥物的方法包括如下步驟1)將待測樣品進行前處理，得到待測樣本溶液；2)用權利要求7或8所述免疫試劑盒對所述待測樣本溶液進行檢測；所述前處理的方法為下述a)、b)和c)中的任一a)所述待測樣品為畜禽的肉、畜禽的肝臟或水產；將每3g所述待測樣品的均質樣品 與9mL乙腈和氫氧化鈉水溶液的混合溶液混勻，4000r/min離心lOmin，取4mL上清液，加入 0. 02mol/L PBS緩沖液4mL，再加入二氯甲烷8mL，振蕩lOmin，4000r/min離心lOmin，取下 層有機相6mL，加入樣品稀釋液0. 5mL和正己烷lmL，渦動2min，4000r/min離心lOmin，取下 層清夜，即得到待測樣本溶液；所述乙腈和氫氧化鈉水溶液的混合溶液中乙腈與氫氧化鈉 水溶液的體積比為84 :16，所述氫氧化鈉水溶液中氫氧化鈉的濃度為0. lmol/L ；b)所述待測樣品為蛋；用乙腈對所述待測樣品進行提取，離心，取上清液；將所述上清 液脫脂，得到待測樣本溶液；具體為將每2g所述待測樣品的均質樣品與SmL乙腈振蕩混 合5min，4000r/min離心5min，取上清液2mL，氮氣吹干，用ImL正己烷溶解，渦動lmin，加入 樣品稀釋液lmL，渦動2min，4000r/min離心5min，取下層清夜，即得到待測樣本溶液；c)所述待測樣品為蜂蜜；將每Ig所述待測樣品與2mLPBS緩沖溶液振蕩混合5min，再 加入8mL 二氯甲烷，振蕩5min，4000r/min離心5min，取下層有機相4mL，氮氣吹干，用ImL 樣品稀釋液溶解，得到的溶液即為待測樣本溶液；II )檢測樣品中喹諾酮藥物的方法包括如下步驟1)將待測樣品進行前處理，得到待測樣本溶液；2)用權利要求9所述膠體金試紙對所述待測樣本溶液進行檢測；所述前處理的方法為下述a)、b)和c)中的任一a)所述待測樣品為牛奶；將樣品稀釋液和牛奶混合，得到的混合溶液即為待測樣本溶液；所述樣品稀釋液和牛奶的體積比為(3-5) 1或4 1 ；b)所述待測樣品為畜禽的肉、畜禽的肝臟或水產；將每Ig所述待測樣品的勻漿組織與 4mL 0. 02M、pH 7. 4的PBS緩沖液混合均勻，3000轉離心5min,取上清液，即為待測樣本溶 液；c)所述待測樣品為蜂蜜；將蜂蜜與提取劑混合，得到的混合溶液為待測樣本溶液；具 體為將每Ig蜂蜜與4mL提取劑混合均勻，得到的混合溶液即為待測樣本溶液；每1升所述 提取劑由5ml Tween-20和995ml 0. 02M的PBS緩沖液組成，提取劑的pH值為7. 4 ；所述喹諾酮藥物為如下中的至少一種環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、達氟 沙星、氟甲喹、惡喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星和依諾沙星； 所述樣品稀釋液為將所述樣品濃縮液稀釋20倍得到的。
全文摘要
本發明公開了一種喹諾酮藥物抗體及其應用。該單鏈抗體由重鏈可變區、連接重鏈可變區和輕鏈可變區的短肽、輕鏈可變區依次連接組成，所述重鏈可變區的氨基酸序列如序列1自N端起第1-118位氨基酸殘基所示，所述輕鏈可變區的氨基酸序列如序列1自N端起第134-248位氨基酸殘基所示。本發明試劑盒和膠體金試紙卡具有靈敏度高、準確度高、精密度高、成本低、操作簡單、檢測時間短、適合各種單位使用、儲存簡單、保質期長的優點；能同時快速檢測大批量樣品，可實現現場高通量快速檢測。因此，本發明的抗體、試劑盒、膠體金試紙及檢測方法在喹諾酮藥物的檢測中將發揮重大作用。
文檔編號C12N15/63GK101955540SQ20101016518
公開日2011年1月26日 申請日期2010年5月6日 優先權日2010年5月6日
發明者劉丹, 吳小平, 師偉, 徐飛, 李娜, 李杰超, 楊麗麗, 江海洋, 沈建忠, 溫凱, 王奇昌, 王戰輝, 程晶 申請人:北京維德維康生物技術有限公司