一種慶大霉素抗體及其應用的制作方法

專利名稱：一種慶大霉素抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種慶大霉素抗體及其應用。
背景技術：
慶大霉素(gentamicin，GEN)是一種氨基糖苷類抗生素，其在治療家畜綠膿桿菌、 變形桿菌和耐青霉素金葡菌感染性疾病中發揮了重要作用，但其殘留物毒副作用比較大， 具有耳毒性和腎毒性。為了加強獸藥殘留管理工作，保證畜產品質量安全，我國農業部于 2002年修訂了《動物性食品中獸藥最高殘留限量》，其中規定牛奶中慶大霉素的最高殘留限 量為200yg/kg，對牛、羊、豬、雞等動物肌肉、脂肪、肝臟、腎臟中慶大霉素殘留也有規定了 相應限量。對慶大霉素殘留的檢測目前主要采用高效液相色譜法(HPLC)。然而，由于氨基糖 苷類抗生素缺少發色基團，應用到HPLC時常要對其衍生化，樣品前處理繁瑣，測定方法相 當復雜，需受過專門訓練的人員才能操作，檢測通量很小，而且儀器檢測費用高，很難普及 使用。微生物抑制法是一種較為常用的抗塵素篩選檢測方法，其主要原理是根據抗微生物 藥對特異微生物的抑制作用來檢測受檢樣品中殘留的抗微生物藥，主要包括杯碟法、紙片 法、瓊脂擴散法和氯化三苯基四氮唑法，但這些方法特異性差，耗時費力，測定結果誤差很 大。ELISA法是另一種目前研究較多的抗生素篩選檢測方法，具有靈敏度高、檢測量大、成本 低等優點。目前，用于免疫檢測的抗體都是單克隆抗體或多克隆抗體。單克隆抗體或多克隆 抗體的制備必須通過細胞培養獲得，整個生產過程復雜，消耗時間長，費用高，且不易進行 操作。單鏈抗體是將抗體重鏈可變區和輕鏈可變區基因通過一個短肽鏈連接后融合表達出 來的抗體片斷，具有分子量小、特異性高、結合力強、易于利用基因工程技術操作等優點。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測慶大霉素的單鏈抗體及其編碼基因。本發明所提供的單鏈抗體，由重鏈可變區、連接重鏈可變區和輕鏈可變區的短肽、 輕鏈可變區依次連接組成，所述重鏈可變區的氨基酸序列如序列1自N末端起第11-124位 氨基酸殘基所示，所述輕鏈可變區的的氨基酸序列如序列1自N末端起第140-263位氨基 酸殘基所示。上述單鏈抗體中，所述連接所述重鏈可變區和輕鏈可變區的短肽的氨基酸序列如 序列1自N末端起第125-139位氨基酸殘基所示。所述編碼基因為如下1)、2)、3)、4)或5)所示1)所述重鏈可變區的編碼基因為自序列表中序列2的5'末端起第31-372位核 苷酸所示的DNA分子；2)所述輕鏈可變區的編碼基因為自序列表中序列2的5'末端起第418-789位核 苷酸所示的DNA分子；
5
3)所述連接重鏈可變區和輕鏈可變區的短肽的編碼基因為自序列表中序列2的 5'末端起第373-417位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列2自5'末端起第31-789位核苷酸所示的DNA分子；5)在嚴格條件下與1)、2)或3)或4)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA 分子。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系和表達盒也屬于 本發明的保護范圍。上述任一所述單鏈抗體在檢測慶大霉素中的應用也屬于本發明的保護范圍。本發明的另一個目的是提供一種檢測慶大霉素的免疫試劑盒。本發明所提供的檢測慶大霉素的免疫試劑盒，為下述1)、2)、3)或4)中任一所述 試劑盒1)試劑盒中包括慶大霉素半抗原與載體蛋白的偶聯物、上述任一所述單鏈抗體和 酶標記抗抗體；其中，所述偶聯物作為包被原；2)試劑盒中包括慶大霉素半抗原的酶標記物、上述任一所述單鏈抗體和抗抗體； 其中，所述抗抗體作為包被原；3)試劑盒中包括慶大霉素半抗原的酶標記物、上述任一所述單鏈抗體；其中，所 述單鏈抗體作為包被原；4)試劑盒中包括慶大霉素半抗原與載體蛋白的偶聯物、上述任一所述單鏈抗體的 酶標記物；其中，所述偶聯物作為包被原。上述任一所述免疫試劑盒中，所述試劑盒中包括慶大霉素標準品溶液、洗滌液和 樣品濃縮液；所述慶大霉素標準品為慶大霉素；所述慶大霉素標準品溶液為如下各濃度的溶液0μ g/L、0. 5μ g/L、l. 5μ g/L、 4. 5 μ g/L、13. 5 μ g/L,40. 5 μ g/L ；每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的將IOml吐溫20，5g疊氮化鈉和 990ml磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 005M-0. 015M, 具體為0. 01M, pH值為7. 2-7. 6，具體為7. 4 ；所述樣品濃縮液為濃度為0. 03mol/L-0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液，具體為 0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述慶大霉素半抗原與載體蛋白的偶聯物是按照如下方法制備得到的將每 20mg慶大霉素半抗原溶于0. 75mL雙蒸水中，得到慶大霉素半抗原的水溶液；將每12mg載 體蛋白溶于0. 75mL雙蒸水中，得到載體蛋白的水溶液；將慶大霉素半抗原的水溶液與載體 蛋白的水溶液混合，磁力攪拌，將得到的溶液記作溶液I ；將62mg EDC溶于1.5mL雙蒸水 中，得到EDC的水溶液；將EDC的水溶液逐滴加入所述溶液I中，25°C攪拌反應24h，得到所 述慶大霉素半抗原和載體蛋白的偶聯物；所述慶大霉素半抗原為慶大霉素；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、 鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、兔血清白蛋白、血藍蛋白或卵清白蛋白；所述抗抗體為鼠抗HIS標簽單克隆抗體。本發明的另一個目的是提供一種檢測慶大霉素的膠體金試紙。本發明所提供的檢測慶大霉素的膠體金試紙，包括樣品吸收墊、膠體金墊、反應膜和吸水墊，其依次連接；所述膠金墊包被有膠體金標記的上述任一所述單鏈抗體；所述反 應墊上含有檢測帶和質控帶，檢測帶位置包被有上述任一所述慶大霉素半抗原與載體蛋白 的偶聯物，質控帶位置包被有鼠抗HIS標簽單克隆抗體；所述慶大霉素半抗原為慶大霉素。本發明的另一個目的是提供一種檢測樣品中慶大霉素的方法。本發明所提供的檢測樣品中慶大霉素的方法，為如下I )或II )所示I )檢測樣品中慶大霉素的方法包括如下步驟1)將待測樣品進行前處理，得到待測樣本溶液；2)用上述任一所述免疫試劑盒對所述待測樣本溶液進行檢測；所述前處理的方法為下述a)、b)、c)和d)中的任一a)所述待測樣品為牛奶；將所述待測樣品4000r/min離心lOmin，吸除上層脂肪， 得到去除脂肪的待測樣品；將每ImL所述去除脂肪的待測樣品與樣品稀釋液混合，得到的 混合溶液即為待測樣本溶液；所述去除脂肪的待測樣品與樣品稀釋液的體積比為1 39;b)所述待測樣品為蜂蜜；將每1 士0.05g所述待測樣品用IOmL樣品稀釋液溶解， 200C -25°C、4000r/min離心lOmin，取上清液，即得到待測樣本溶液；c)所述待測樣品為雞肝；去除所述待測樣品中的脂肪，得到去除脂肪的待測樣 品；將每5.0 士 0. 05g所述去除脂肪的待測樣品的均質物與IOmLPBST緩沖液振蕩混合 30min,4000r/min離心lOmin，取2mL上層清液；將所述2mL上層清液與3mL正己烷振蕩混 合5min，4000r/min離心lOmin，取下層清液；將所述下層清液與樣品稀釋液混合，得到的混 合溶液即為待測樣本溶液；所述下層清液與樣品稀釋液的體積比為1 9;d)所述待測樣品為雞肉；去除所述待測樣品中的脂肪，得到去除脂肪的待測樣 品；將每2士0. 05g所述去除脂肪的待測樣品的均質物與8mL PBST緩沖液混合振蕩混合 5min，加入5mL正己烷振蕩混合lOmin，靜置lh，4000r/min離心15min，取2mL中間層溶液； 將所述2mL中間層溶液與ImL正己烷振蕩混合5min，4000r/min離心15min，取下層清液； 將所述下層清液與樣品稀釋液混合，得到的混合溶液即為待測樣本溶液；所述下層清液與 樣品稀釋液的體積比為1 9;II )檢測樣品中慶大霉素的方法包括如下步驟1)將待測樣品進行前處理，得到待測樣本溶液；2)用上述任一所述膠體金試紙對所述待測樣本溶液進行檢測；所述前處理的方法為下述a)或b)a)所述待測樣品為牛奶；將所述待測樣品與樣品稀釋液混合，得到的混合溶液即 為待測樣本溶液；所述待測樣品與樣品稀釋液的體積比為1 (3-5)或1 4;b)所述待測樣品為蜂蜜；將所述待測樣品與樣品稀釋液混合，得到的混合溶液即 為待測樣本溶液；所述待測樣品與樣品稀釋液的體積比為1 (3-5)或1 4;所述樣品稀釋液為將所述樣品濃縮液稀釋20倍得到的。上述試劑盒既可以為酶聯免疫試劑盒，又可為發光免疫試劑盒，當為酶聯免疫試 劑盒時，所述試劑盒中包括底物顯色液；所述底物顯色液由A液和B液組成，所述A液為濃 度為1. 5% -2. 5%的過氧化脲的水溶液，B液為濃度為0. 5% -1. 5%的四甲基聯苯胺的水 溶液；所述A液優選為濃度為2 %的過氧化脲的水溶液，B液優選為濃度為1 %的四甲基聯苯胺的水溶液。本發明的單鏈抗體(scFv)是用基因工程方法將抗體重鏈可變區(VH)和輕鏈可變 區(VL)通過一段連接肽(Linker)連接而成的重組抗體，是保持了親本抗體的抗原親和活 性和特異性的最小功能性抗體片段，可通過基因工程技術體外表達得到，可在細菌中很經 濟地大規模生產，從而使得免疫檢測抗體的生產變得非常容易、簡便和經濟，進而大大減少 檢測試劑的費用，比雜交瘤細胞培養得到單抗的方法要簡單得多。本發明抗體的親和常數 為4. 86X IO9LAioI、半數抑制量(IC5tl) 1. 7ng/mL。本發明為食品中慶大霉素殘留檢測方法 的建立提供高效價、高特異性的抗體來源。本發明試劑盒和膠體金試紙卡具有靈敏度高、準確度高、精密度高、成本低、操作 簡單、檢測時間短、適合各種單位使用、儲存簡單、保質期長的優點；能同時快速檢測大批量 樣品，可實現現場高通量快速檢測。因此，本發明的抗體、試劑盒、膠體金試紙及檢測方法在 慶大霉素的檢測中將發揮重大作用。


圖1為試劑盒標準曲線。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、抗體的制備及功能檢測一、慶大霉素單鏈抗體的制備(一 )抗體的篩選取6個月雄性Balb/c小鼠，Trizol —步法提取脾細胞總RNA，純化得到mRNA，再逆 轉錄得到cDNA。使用全套引物，以cDNA為模板分別擴增得到重鏈可變區(VH)、輕鏈可變區 (VL)基因，經疊加延伸聚合酶鏈式反應(Overlap-PCR)將VH、VL基因隨機拼接為單鏈抗體 基因(ScFv)，然后將ScFv與載體pCANTAB5E連接得pCANTAB5E/ScFv，并轉化大腸桿菌TGl， 即得到鼠源非免疫單鏈抗體庫。用ELISA方法篩選得到帶有特異性的多種抗慶大霉素的單 鏈抗體的噬菌體顆粒，通過測序得到其相應的核苷酸序列。該單鏈抗體由重鏈可變區、連接所述重鏈可變區和輕鏈可變區的短肽、輕鏈可變 區順次連接組成。該抗體的氨基酸序列如序列表中序列1所示，自序列1的N端起第11-124 位氨基酸殘基為重鏈可變區的氨基酸序列，自序列1的N端起第140-263位氨基酸殘基為 輕鏈可變區的氨基酸序列，自序列1的N端起第125-139位氨基酸殘基為短肽序列。該單鏈抗體的編碼基因序列如序列表中序列2所示，自序列2的5'末端起第 31-372位核苷酸編碼重鏈可變區，自序列2的5'末端起第418-789位核苷酸編碼輕鏈可 變區，自序列2的5'末端起第373-417位核苷酸編碼短肽。(二)抗體的制備表達載體pET20b購自德國N0VAGEN公司；大腸桿菌BL21購自德國N0VAGEN公司； 蛋白純化用HisLink Protein Purification Resin購自美國Promega公司，產品目錄號 為 V8823。
合成序列表中序列2自5'末端起第31-789位核苷酸所示基因，并在兩端引入酶 切位點Xba I和Not I，用限制性內切酶Xba I和Not I酶切，回收目的基因片段；用限制 性內切酶Xba I和Not I酶切表達載體pET20b，回收載體大片段；連接，連接產物轉化大腸 桿菌，篩選培養，挑取單克隆；將單克隆接入液體培養基進一步培養，提取質粒，酶切和測序 驗證，結果測得的序列如序列表中序列2自5'末端起第31-789位核苷酸所示，表明重組載 體中基因插入方向和序列均正確，將陽性重組載體記作重組表達載體pET20b/ScFv。采用氯化鈣法將重組表達載體pET20b/ScFv轉化大腸桿菌BL21，抗性篩選，經菌 液PCR及質粒酶切驗證，得到含有重組表達載體pET20b/ScFv的重組大腸桿菌，記作重組大 腸桿菌 BL21/pET20b/ScFv。2XTY培養液的組成由胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl和水組成，每1升2XTY培養 液中胰蛋白胨的濃度為1.6%、酵母提取物的濃度為l%、NaCl的濃度為0.5%;各百分含量 均為質量百分含量。含氨芐青霉素、氯霉素和葡萄糖的2XTY培養液是按照如下方法得到的向2XTY 培養液中添加氨芐青霉素、氯霉素和葡萄糖，使氨芐青霉素在溶液中的終濃度為IOOyg/ ml，使氯霉素在溶液中的終濃度為34 μ g/ml，使葡萄糖在溶液中的終濃度為1 % (質量百分 含量)。發酵重組菌將重組大腸桿菌BL21/pET20b/ScFv的單個陽性菌落接種至含氨芐 青霉素、氯霉素和葡萄糖的2 X TY培養液中，37°C振搖，至培養體系的A6tltl為0. 6時，收集細 菌；將細菌重懸于2ml LB液體培養基中，按1 20的體積比將菌懸液接種至50ml含相同 濃度抗生素的LB液體培養基中(含相同濃度抗生素的LB液體培養基的組成氨芐青霉素、 氯霉素、酵母提取物、蛋白胨、NaCl和水組成；溶液中各成分的濃度為酵母提取物0. 5%, 蛋白胨1 %，NaCl 1 %，氨芐青霉素100 μ g/ml，氯霉素34 μ g/ml)，37°C振搖，至培養體系的 A600 為 0. 6 時，加 IPTG(0. 7mmol/L)誘導，30°C振搖 2. 5h，在 4°C下 5000r/min 離心 lOmin， 收獲細菌。用洗滌液(將20mmol Tris和0. 15mol NaCl用水溶解，用HCL調PH值至8. 0， 再用水定容至1L，得到1升洗滌液)洗滌1次，加溶菌液(將20mmol TrisUOml Triton Χ-100、250 μ mol PMSF、62. 5 X IO4U溶菌酶用水溶解，用HCL調PH值至8. 0，再用水定容至 1L，得到1升溶菌液)，30°C放置15min，然后在冰上超聲處理(輸出功率80% ) 10s，停10s， 反復3次，至細胞不再粘稠。在4°C 2000Xg離心20min，分別收集上清及沉淀。將沉淀用結 合緩沖液I (將20mmol Tris、0. 5mol Nacl和5mmol咪唑用水溶解，用HCL調PH值至8. 0， 再用水定容至1L，得到1升結合緩沖液I )洗滌一次，而后，懸于結合緩沖液II (將20mmol Tris,0. 5mol Nacl、5mmol咪唑和6mol尿素用水溶解，用HCL調PH值至8. 0，再用水定容至 1L，得到1升結合緩沖液II )中，4°C，12000 Xg離心20min，收集上清，經0.45mm濾膜過濾， 收集濾液，得到抗體的粗制液。純化利用表達載體上帶有的組氨酸標簽(His-tag)標記通過親和層析純化單鏈 抗體蛋白。將 HisLink Protein Purification Resin 裝柱，以 10 倍柱體積的 binding buffer (將 lOOmmolHEPES、IOmmol 咪唑和 500mmol NaCl 用水溶解，再調節 pH 值至 7. 5，然 后用水定容至1升，得到1升binding buffer)平衡純化柱，取抗體的粗制液上樣，然后用5 倍柱體積的wash buffer (將lOOmmolHEPES、IOOmmol咪唑和用水溶解，再調節pH值至7. 5， 然后用水定容至1升，得到1升wash buffer)洗脫雜蛋白，最后用10倍柱體積的elution
9buffer (將1 OOmmoIHEPES、250mmol咪唑用水溶解，再調節pH值至7. 5，然后用水定容至1 升，得到1升elution buffer)洗脫目標蛋白，收集洗脫液，透析，得到純化的抗體。蛋白驗證Western blot 收集上述各階段產物，進行12 % SDS-PAGE電泳；將電 泳條帶印跡到NC膜上，再與HRP標記的慶大霉素雜交，檢測發光條帶。慶大霉素購自美國 Sigma-Aldrich公司，產品目錄號為G1397。同時以轉入空載體pET20b的大腸桿菌BL21作為對照，并按照上述方法進行表達 和純化，和Western blot檢測。Western blot檢測結果表明1)實驗組得到的蛋白具有與慶大霉素結合的功能， 蛋白的分子量為30kD，與預期的蛋白分子量一致，表明目的蛋白為與慶大霉素結合的抗體。 2)對照組沒有檢測到任何與慶大霉素結合的蛋白條帶。(三)抗體的功能檢測1、用ELISA方法，檢測抗體的半抑制率(IC5tl)a、將實施例2中制備得到的偶聯物(GEN-BSA)用包被緩沖液溶解，得到GEN-BSA 的溶液(該溶液中GEN-BSA的濃度為1 μ g/ml)。包被緩沖液pH9. 6,0. lmol/L的碳酸鈉緩 沖液。向96孔板的孔中加入GEN-BSA的溶液，100 μ L每孔，37°C溫育2h ；傾去包被液，用 PBST溶液(PBS+0. 05% Tween20)洗滌3次，250 μ L每孔，每次30s，甩干孔中液體；b、然后向每孔中加入200μ L2% BSA封閉液，37°C溫育2h，傾去孔內液體；用PBST 溶液(PBS+0. 05% Tween20)洗滌3次，250 μ L每孔，每次30s，甩干孔中液體。c、向孔中加入單鏈抗體溶液和不同濃度的慶大霉素標準品溶液，各50 μ L每孔， 37°C孵育1小時。以只加入單鏈抗體溶液不加入慶大霉素標準品溶液的孔作陽性對照。單鏈抗體溶液的制備用樣品稀釋液稀釋實驗(二)中的純化抗體得到溶液，抗體 在溶液中的濃度為5ng/mL ；樣品稀釋液為0. 002mol/L的磷酸鹽緩沖液。不同濃度的慶大霉素溶液的制備用樣品稀釋液稀釋慶大霉素得到溶液。d、用PBST溶液(PBS,0. 05% Tween20)洗滌3次，250 μ L每孔，甩干孔中液體，加 入HRP標記的鼠抗His標簽單克隆抗體，37°C孵育1小時；e、用 PBST 溶液(PBS,0. 05%Tween20)洗滌 3 次，250 μ L 每孔；加入 TMB 顯色，37°C 反應10分鐘，加入2M硫酸終止顯色反應，每孔50 μ L，使用酶標儀進行讀數。實驗設3次重復。結果如下1)吸光度值與每孔所加入的標準品溶液中慶大霉素的濃度成反比；證明，所表達 純化得到的單鏈抗體具有針對慶大霉素的結合特異性，并呈現線性關系，說明該抗體可用 于對慶大霉素的免疫檢測。2)半抑制率(IC5tl)陽性對照孔(即不添加慶大霉素標準品溶液的孔)的吸光度 值為Btl，各實驗孔的吸光度值為B，當BziBci為50%時所對應的慶大霉素標準品溶液的濃度 即為半抑制率(IC5tl)。該單抗的半抑制率(IC5tl)為1. 7ng/mL。2、抗體的親和常數測定方法取定量的一定稀釋度的抗體，分別加入逐漸增加的抗原里，可使抗體的結合 達到飽和，以結合部分(B)為縱坐標，抗原濃度(mol/L)為橫坐標繪制飽和曲線，求出抗體飽和程度為50%時的游離抗原濃度，其倒數即為該抗體在此稀釋度下的親和常數。結果抗體的親和常數為4. 86 X IOVmol0實施例2、檢測慶大霉素的酶聯免疫試劑盒及其制備一、酶聯免疫試劑盒由下述物質組成1、包被慶大霉素與載體蛋白偶聯物(GEN-BSA)的酶標板；2、慶大霉素抗體實施例1中所述單鏈抗體。抗體工作液的濃度為5. Ong/mL，抗 體工作液是用樣品稀釋液稀釋實施例1中的純化抗體得到的到的；3、慶大霉素標準品慶大霉素標準品為慶大霉素，標準品溶液濃度分別為
0μ g/L、0. 5 μ g/L、1. 5 μ g/L、4. 5 μ g/L、13. 5 μ g/L、40. 5yg/L;慶大霉素購自美國 Sigma-Aldrich公司；產品目錄號為G1397 ；用樣品稀釋液稀釋成上述各濃度；4、酶標二抗辣根過氧化物酶(HRP)標記的鼠抗HIS標簽單克隆抗體；購自美國 Sigma-Aldrich公司，產品目錄號為A7058 ；5、底物顯色液由A液和B液組成，A液為2%過氧化脲的水溶液，B液為1 %四甲 基聯苯胺的水溶液；6、終止液0. 2M硫酸水溶液；7、洗滌液每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的將IOml吐溫20、5g疊 氮化鈉和990ml磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 01M, PH值為7.4;8、樣品濃縮液0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液；將其進行20倍稀釋，成為樣品稀釋液
后使用。二、試劑盒組分的制備(一)包被原的制備將20mg慶大霉素(GEN)溶于0. 75mL雙蒸水中，得到慶大霉素的水溶液；將 12mgBSA溶于0. 75mL雙蒸水中，得到BSA的水溶液；將慶大霉素的水溶液加入BSA的水 溶液中，并放在磁力攪拌器上攪拌，將得到的溶液記作溶液I ；將62mg水溶性碳化二亞胺 (EDC)溶于1. 5mL雙蒸水中，得到EDC的水溶液；將EDC的水溶液逐滴加入上述溶液I中， 室溫(25°C)攪拌反應24h，將得到的溶液記作溶液II，其中含有慶大霉素和BSA的偶聯物 (GEN-BSA)；將溶液II裝入透析袋透析3d，每8h換液1次，透析后分裝，于-20°C貯存。( 二)包被有包被原的酶標板及其制備包被有合成抗原GEN-BSA的聚苯乙烯酶標板用IOmM的碳酸鹽溶液將抗原作
1 50000倍稀釋(6. Oyg/mL)，包被96孔聚苯乙烯酶標板，每孔100yL，37°C溫育2h，傾 去包被液，用洗滌液稀釋20倍后洗滌3次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200 μ L封閉 液，37°C溫育2h，傾去孔內液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。包被緩沖液pH9. 6,0. 05mol/L的碳酸鈉緩沖液；封閉液每1升封閉液按照如下方法配制將5ml馬血清、Ig疊氮化鈉、30g酪蛋 白混合，用磷酸鹽緩沖液溶解并定容至1000ml，得到封閉液；其中，磷酸鹽緩沖液的濃度為 0. 02M, pH 值為 7. 2。三、試劑盒檢測方法(一)樣品前處理
1、檢測樣本為牛奶取牛奶樣品，4000r/min離心lOmin，吸除上層脂肪；取ImL去 除脂肪的牛奶樣品至15mL玻璃管中；用樣品稀釋液按1 39比例進行稀釋(即50μ L牛 奶樣品加入1950 μ L樣品稀釋液)。取50 μ L用于分析。2、檢測樣本為蜂蜜稱取1 士0.05g蜂蜜樣品至50mL聚苯乙烯離心管中，加入 IOmL樣品稀釋液，用振蕩器振蕩IOmin至蜂蜜全部溶解，4000r/min、室溫(20_25°C )離心 IOmin,直至清亮，取上清液50 μ L進行分析。3、檢測樣本為雞肉用均質器均質雞肉樣品；稱取2士0.05g均質物至50mL聚苯 乙烯離心管中，加入8mL PBST緩沖液混合振蕩5min，加入正己烷5mL充分上下振蕩混合 IOmin后靜置Ih ；4000r/min離心15min ；移取2mL中間層溶液至IOmL玻璃離心管中，加入 ImL正己烷，用振蕩器充分振蕩5min，4000r/min離心15min ；除去上層，取下層清液用樣品 稀釋液按1 9體積比進行稀釋(50yL下層清液加入450yL樣品稀釋液)；取50yL用 于分析。4、檢測樣本為雞肝除去肝臟中的脂肪部分，用均質器均質肝臟樣品；稱取 5.0 士 0.05g均質物至50mL聚苯乙烯離心管中，加入IOmLPBST緩沖液混合振蕩30min ； 4000r/min離心IOmin ；移取2mL上層清液至IOmL玻璃離心管中，加入3mL正己烷用振蕩器 充分振蕩5min ；4000r/min離心IOmin ；除去上層，取下層清液用樣品稀釋液按1 9體積 比進行稀釋(50 μ L下層清液加入450 μ L樣品稀釋液)；取50 μ L水相進行分析。(二)用試劑盒檢測1、標準曲線的制作向包被有包被原的酶標板微孔中加入慶大霉素標準品溶液50 μ L，再加入慶大霉 素抗體工作液50 μ L，用蓋板膜封板，37°C恒溫箱中反應30min，倒出孔中液體，每孔加入 250 μ L洗滌液，30s后倒出孔中液體，如此重復操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入酶標 二抗工作液ΙΟΟμ L，37°C恒溫箱中反應30min，倒出孔中液體，重復洗滌步驟，每孔加入底 物顯色液，輕輕振蕩混勻，37°C恒溫箱避光顯色15min，每孔加入終止液50 μ L，輕輕振蕩混 勻，用酶標儀，測定每孔吸光度值。用每個濃度的標準品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標準品溶液(0標準) 的吸光度值(Btl)再乘以100%，得到百分吸光度值。以慶大霉素標準品濃度(yg/L)的半 對數值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。得到的標準曲線如圖1所示。百分吸光度值(%) = (B/B0) X100%2、樣品中慶大霉素濃度的測定向包被有包被原的酶標板微孔中加入檢測樣本溶液50 μ L，再加入慶大霉素單 鏈抗體工作液50 μ L，用蓋板膜封板，37°C恒溫箱中反應30min，倒出孔中液體，每孔加入 250 μ L洗板液，30s后倒出孔中液體，如此重復操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入辣根 過氧化物酶標記的抗體工作液100 μ L，37°C恒溫箱中反應30min，倒出孔中液體，重復洗滌 步驟，每孔加入混合底物顯色液100 μ L，輕輕振蕩混勻，37 °C恒溫箱避光顯色15min，每孔 加入終止液50 μ L，輕輕振蕩混勻，用酶標儀，測定每孔吸光度值。結果判斷用每個檢測樣本溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標準品溶液(0標 準)的吸光度值(Btl)再乘以100%，得到百分吸光度值。相對應每一個檢測樣本溶液的百 分吸光度值，則可從標準曲線上讀出檢測樣本溶液的吸光度值，再根據標準品溶液的濃度值換算出樣本溶液中慶大霉素的殘留量。四、試劑盒檢測效果評價(一)準確度和精密度試驗向不含慶大霉素的樣品(牛奶、蜂蜜、雞肉和雞肝)中添加慶大霉素標準品，使慶 大霉素標準品在樣品中的終濃度分別為5μ g/kg、10y g/kg、20y g/kg ；將添加后的樣品分 別按照實驗三中所述方法進行前處理，得到檢測樣本溶液。從三個不同批次的試劑盒中各抽取3個試劑盒進行檢測，檢測方法如實驗三中所 述，每個實驗重復5次，分別計算變異系數。結果分別見表1。表1準確度和精密度試驗結果
權利要求
一種單鏈抗體，由重鏈可變區、連接重鏈可變區和輕鏈可變區的短肽、輕鏈可變區依次連接組成，所述重鏈可變區的氨基酸序列如序列1自N末端起第11 124位氨基酸殘基所示，所述輕鏈可變區的的氨基酸序列如序列1自N末端起第140 263位氨基酸殘基所示。
2.根據權利要求1所述的單鏈抗體，其特征在于所述連接所述重鏈可變區和輕鏈可 變區的短肽的氨基酸序列如序列1自N末端起第125-139位氨基酸殘基所示。
3.權利要求1或2所述單鏈抗體的編碼基因。
4.根據權利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下1)、2)、3)、4) 或5)所示1)所述重鏈可變區的編碼基因為自序列表中序列2的5'末端起第31-372位核苷酸 所示的DNA分子；2)所述輕鏈可變區的編碼基因為自序列表中序列2的5'末端起第418-789位核苷酸 所示的DNA分子；3)所述連接重鏈可變區和輕鏈可變區的短肽的編碼基因為自序列表中序列2的5'末 端起第373-417位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列2自5'末端起第31-789位核苷酸所示的DNA分子；5)在嚴格條件下與1)、2)或3)或4)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子。
5.含有權利要求3或4所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系和表達盒。
6.權利要求1或2所述單鏈抗體在檢測慶大霉素中的應用。
7.—種檢測慶大霉素的免疫試劑盒，為下述1)、2)、3)或4)中任一所述試劑盒1)試劑盒中包括慶大霉素半抗原與載體蛋白的偶聯物、權利要求1或2所述單鏈抗體 和酶標記抗抗體；其中，所述偶聯物作為包被原；2)試劑盒中包括慶大霉素半抗原的酶標記物、權利要求1或2所述單鏈抗體和抗抗體； 其中，所述抗抗體作為包被原；3)試劑盒中包括慶大霉素半抗原的酶標記物、權利要求1或2所述單鏈抗體；其中，權 利要求1或2所述單鏈抗體作為包被原；4)試劑盒中包括慶大霉素半抗原與載體蛋白的偶聯物、權利要求1或2所述單鏈抗體 的酶標記物；其中，所述偶聯物作為包被原。
8.根據權利要求7所述的免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒中包括慶大霉素標準品溶液、洗滌液和樣品濃縮液；所述慶大霉素標準品 為慶大霉素；所述慶大霉素標準品溶液為如下各濃度的溶液0 μ g/L、0. 5 μ g/L、1. 5 μ g/L、4. 5 μ g/ L、13. 5μ g/L、40. 5μ g/L ；每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的將IOml吐溫20，5g疊氮化鈉和990ml 磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 005M-0. 015M，具體為 0. 01M, pH 值為 7. 2-7. 6，具體為 7. 4 ；所述樣品濃縮液為濃度為0. 03mol/L-0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液，具體為0. 04mol/L 的磷酸鹽緩沖液；所述慶大霉素半抗原與載體蛋白的偶聯物是按照如下方法制備得到的將每20mg慶大霉素半抗原溶于0. 75mL雙蒸水中，得到慶大霉素半抗原的水溶液；將每12mg載體蛋白 溶于0. 75mL雙蒸水中，得到載體蛋白的水溶液；將慶大霉素半抗原的水溶液與載體蛋白的 水溶液混合，磁力攪拌，將得到的溶液記作溶液I ；將62mg EDC溶于1.5mL雙蒸水中，得到 EDC的水溶液；將EDC的水溶液逐滴加入所述溶液I中，25°C攪拌反應24h，得到所述慶大霉 素半抗原和載體蛋白的偶聯物；所述慶大霉素半抗原為慶大霉素；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血 清蛋白、甲狀腺蛋白、兔血清白蛋白、血藍蛋白或卵清白蛋白；所述抗抗體為鼠抗HIS標簽單克隆抗體。
9.一種檢測慶大霉素的膠體金試紙，包括樣品吸收墊、膠體金墊、反應膜和吸水墊，其 依次連接；所述膠體金墊包被有膠體金標記的權利要求1或2所述單鏈抗體；所述反應膜 上含有檢測帶和質控帶，檢測帶位置包被有權利要求8中所述慶大霉素半抗原與載體蛋白 的偶聯物，質控帶位置包被有鼠抗HIS標簽單克隆抗體。
10.一種檢測樣品中慶大霉素的方法，為如下I )或II )所示I)檢測樣品中慶大霉素的方法包括如下步驟1)將待測樣品進行前處理，得到待測樣本溶液；2)用權利要求7或8所述免疫試劑盒對所述待測樣本溶液進行檢測；所述前處理的方法為下述a)、b)、c)和d)中的任一a)所述待測樣品為牛奶；將所述待測樣品4000r/min離心lOmin，吸除上層脂肪，得到 去除脂肪的待測樣品；將每ImL所述去除脂肪的待測樣品與樣品稀釋液混合，得到的混合 溶液即為待測樣本溶液；所述去除脂肪的待測樣品與樣品稀釋液的體積比為1 39;b)所述待測樣品為蜂蜜；將每1士0.05g所述待測樣品用IOmL樣品稀釋液溶解， 200C -25°C、4000r/min離心lOmin，取上清液，即得到待測樣本溶液；c)所述待測樣品為雞肝；去除所述待測樣品中的脂肪，得到去除脂肪的待測樣品；將 每5. O士0. 05g所述去除脂肪的待測樣品的均質物與IOmLPBST緩沖液振蕩混合30min， 4000r/min離心lOmin，取2mL上層清液；將所述2mL上層清液與3mL正己烷振蕩混合5min， 4000r/min離心lOmin，取下層清液；將所述下層清液與樣品稀釋液混合，得到的混合溶液 即為待測樣本溶液；所述下層清液與樣品稀釋液的體積比為1 9;d)所述待測樣品為雞肉；去除所述待測樣品中的脂肪，得到去除脂肪的待測樣品；將 每2士0. 05g所述去除脂肪的待測樣品的均質物與8mL PBST緩沖液混合振蕩混合5min，加 入5mL正己烷振蕩混合lOmin，靜置lh，4000r/min離心15min，取2mL中間層溶液；將所述 2mL中間層溶液與ImL正己烷振蕩混合5min，4000r/min離心15min，取下層清液；將所述下 層清液與樣品稀釋液混合，得到的混合溶液即為待測樣本溶液；所述下層清液與樣品稀釋 液的體積比為1 9;II )檢測樣品中慶大霉素的方法包括如下步驟1)將待測樣品進行前處理，得到待測樣本溶液；2)用權利要求9所述膠體金試紙對所述待測樣本溶液進行檢測；所述前處理的方法為下述a)或b)a)所述待測樣品為牛奶；將所述待測樣品與樣品稀釋液混合，得到的混合溶液即為待 測樣本溶液；所述待測樣品與樣品稀釋液的體積比為1 (3-5)或1 4;b)所述待測樣品為蜂蜜；將所述待測樣品與樣品稀釋液混合，得到的混合溶液即為待 測樣本溶液；所述待測樣品與樣品稀釋液的體積比為1 (3-5)或1 4; 所述樣品稀釋液為將所述樣品濃縮液稀釋20倍得到的。
全文摘要
本發明公開了一種慶大霉素抗體及其應用。該抗體由重鏈可變區、連接重鏈可變區和輕鏈可變區的短肽、輕鏈可變區依次連接組成；所述重鏈可變區的氨基酸序列如序列1自N端起第11-124位氨基酸殘基所示，所述輕鏈可變區的氨基酸序列如序列1自N端起第140-263位氨基酸殘基所示。本發明試劑盒和膠體金試紙卡具有靈敏度高、準確度高、精密度高、成本低、操作簡單、檢測時間短、適合各種單位使用、儲存簡單、保質期長的優點；能同時快速檢測大批量樣品，可實現現場高通量快速檢測。因此，本發明的抗體、試劑盒、膠體金試紙及檢測方法在慶大霉素的檢測中將發揮重大作用。
文檔編號C12N1/19GK101955535SQ20101016517
公開日2011年1月26日 申請日期2010年5月6日 優先權日2010年5月6日
發明者劉丹, 吳小平, 徐飛, 李娜, 李杰超, 楊麗麗, 楊光, 江海洋, 沈建忠, 王世恩, 王富偉, 王戰輝 申請人:北京維德維康生物技術有限公司