專利名稱：一種核酸測序方法
技術領域：
本發明屬分子生物學領域，尤其涉及一種核酸測序方法。
背景技術：
在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎，被廣 泛應用于人類基因組測序、人類遺傳病、傳染病和癌證的臨床診斷、生物工程藥物的篩選、 動植物雜交育種、動物親子鑒定和性別鑒定、植物疾病診斷、法醫鑒定等方面。美國ABI公 司生產的系列核酸序列分析儀(DNA測序儀)由于實現了全部操作自動化，包括自動灌膠、 自動進樣、自動數據收集分析等，以及結果的高準確性，目前是市場上最受客戶歡迎并被廣 泛應用的用于核酸序列分析的儀器。該儀器采用的是Sanger雙脫氧鏈終止法原理、采用 毛細管電泳技術取代傳統的聚丙烯酰胺平板電泳，應用該公司專利的四色熒光染料標記的 ddntp (標記終止物法)，通過單引物PCR (聚合酶鏈式反應)測序反應，生成的PCR產物則是 相差1個堿基的3 ’末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序 PCR產物可在一根毛細管內電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的 精確度。該測序方法目前已經被標準化，主要由以下幾步組成①目的片段PCR擴增②PCR 擴增產物的純化③利用純化的PCR產物進行測序PCR擴增④測序PCR產物純化⑤上機讀取 序列分析結果。由于操作全部自動化、DNA產物需被熒光物質標示等特點，目前，測序成本 相對來說較昂貴，雖然隨著高通量DNA測序儀的被開發和使用，測序成本有所降低，但市場 上客戶的實際要求主要還是中、低通量樣本的序列分析(比如對受檢者的DNA樣本進行基 因檢測，在較短的時間內就得出具序列分析報告，因此，很難在短時間內收集到大量樣本進 行測序)，因此，降低中、低通量檢測樣本的測序成本是生物技術產業面臨的主要問題之一。
發明內容
為了解決背景技術中存在的上述技術問題，本發明提供了一種可大幅降低成本、 測序結果穩定、質量高、所需基因組DNA量少的核酸測序方法。本發明的技術解決方案是本發明提供了一種核酸測序方法，其特殊之處在于 所述核酸測序方法包括以下步驟1)目的核酸片段進行PCR擴增；2)對步驟1)所得到的PCR擴增產物進行純化；3)對步驟2)所得到的純化后的PCR擴增產物進行測序PCR擴增；4)對步驟3)所得到的測序PCR擴增產物進行純化，其具體實現方式是4. 1)將測序PCR擴增產物全量、磁珠8 12ul、85%酒精40 50ul充分混勻后 置于空磁力架上2 10分鐘；4. 2)棄掉上清液；4. 3)加入80 200ul85%酒精進行清洗，并棄掉上清液；4. 4)空氣中干燥1 10分鐘；
5)上機讀取序列分析結果，其具體實現方式是加入15 25ul 0. ImM EDTA后導 入測序讀板中，上機讀取結果。上述步驟4. 1)中測序PCR擴增產物全量、磁珠9 llul、85%酒精40 45ul充 分混勻后置于空磁力架上2 5分鐘。上述步驟4. 1)中測序PCR擴增產物全量、磁珠10ul、85%酒精42ul充分混勻后置 于空磁力架上3分鐘。
上述磁珠是CleanSEQ磁珠；所述磁力架是SPRI96磁力架。上述步驟2)的具體實現方式是對步驟1)所得到的PCR擴增產物以蝦堿酶加堿 性磷酸酶進行純化，其具體實現方式是取PCR擴增產物全量、蝦堿酶加堿性磷酸酶0. 125-0. 5ul、ddH20 1. 5ul充分混勻 后離心，蝦堿酶加堿性磷酸酶作用反應條件37°C 30分鐘；80°C 15分鐘；15°C儲存。上述步驟2)中蝦堿酶與堿性磷酸酶的比例為1 3。上述步驟1)的具體實現方式是1. 1)取 DNAl_20ng、正向擴增引物 2. 5pmol、反向擴增引物 2. 5pmol、HotStartTaq MasterMix 5ul、ddH20 3. 9ul 充分混勻后離心；1. 2)將步驟1. 1)所得到的混合液進行PCR反應，PCR反應條件95°C 15分鐘； 950C 30 秒、50-60°C 30 秒、72°C 1 分鐘，35 循環；72°C 3 分鐘；15°C儲存。本發明的優點是本發明所提供的核酸測序方法經過對現有技術的不斷優化，采 用磁珠法純化測序PCR產物，操作簡便，操作時間短，純化后產物可直接上機，讀取測序結 果，測序信號比采用醋酸鈉/乙醇法純化法強，測序結果質量好；同時以蝦堿酶加堿性磷酸 酶替代Centri-SepTM Columns純化PCR擴增產物，操作簡單，不需換管操作，對于中低通量 測序，可大大降低實驗成本，所需基因組DNA量少，測序結果穩定、質量高，特別適合中、低 通量樣本的序列分析，操作簡便。
圖1為利用本發明所提供的測序方法進行核酸測序的測序圖譜。
具體實施例方式本發明提供了一種核酸測序方法，該方法包括以下步驟1)目的核酸片段進行PCR擴增，其具體實現方式是1. 1)取基因組DNAl-20ng(lul)、正向擴增引物2. 5pmol (0. 05ul)、反向擴增引物 2. 5pmol(0.05ul)、HotStart Taq MasterMix 5ul、ddH20 3. 9ul 充分混勻后離心；1. 2)將步驟1. 1)所得到的混合液進行PCR反應，PCR反應條件95°C 15分鐘； 950C 30 秒、50-60°C 30 秒、72°C 1 分鐘，35 循環；72°C 3 分鐘；15°C儲存。與現有技術不同的是，本發明在步驟一中做了改進，傳統的測序方法目的片段PCR 擴增步驟一般使用基因組DNA100-500ng進行反應，使用HotStart試劑盒進行PCR擴增，通 過優化實驗條件，所用基因組DNA的量可在l-20ng之間，大大降低了遺傳資源DNA的用量。2)對步驟1)所得到的PCR擴增產物進行純化，對步驟1)所得到的PCR擴增產物 以蝦堿酶加堿性磷酸酶進行純化，其具體實現方式是
取PCR擴增產物全量、蝦堿酶加堿性磷酸酶0. 125-0. 5ul、ddH20 1. 5ul充分混勻 后離心，蝦堿酶加堿性磷酸酶作用反應條件37°C 30分鐘；80°C 15分鐘；15°C儲存。這里，本發明也進行了改進，傳統的測序方法在PCR擴增產物的純化時，采用的是Centri-SepTM Columns進行純化，需要換管操作并離心，容易損失PCR產物；以蝦堿酶加堿 性磷酸酶替代Centri-SepTM Columns純化PCR擴增產物，操作簡單，不需換管操作方便操 作。3)對步驟2)所得到的純化后的PCR擴增產物進行測序PCR擴增；4)對步驟3)所得到的測序PCR擴增產物進行純化，其具體實現方式是4. 1)將測序PCR擴增產物全量、CleanSEQ磁珠8 12ul、85%酒精40 50ul充分 混勻后置于SPRI96空磁力架上2 10分鐘；(CleanSEQ磁珠及SPRI96空磁力架為Beckman 公司產品)還可以是測序PCR擴增產物全量、CleanSEQ磁珠9 llul、85%酒精40 45ul 充分混勻后置于SPRI96空磁力架上2 5分鐘；最好是測序PCR擴增產物全量、CleanSEQ 磁珠IOul、85%酒精42ul充分混勻后置于SPRI96空磁力架上3分鐘。原則上說，各種磁珠 及相配套的磁力架應該各公司的產品都行，只不過用Beckman公司產品摸的實驗條件。4. 2)棄掉上清液；4. 3)加入80 200ul85%酒精進行清洗，并棄掉上清液；4. 4)空氣中干燥1 10分鐘；傳統的測序方法中，PCR產物純化采用的是BigDye Xterminator purificationkit,成本貴，采用醋酸鈉/乙醇法純化PCR產物，操作復雜，測序結果信號較 弱，雜峰交易出現，本發明采用磁珠法純化測序PCR產物，操作簡便，操作時間短，純化后產 物可直接上機，讀取測序結果，測序信號比采用醋酸鈉/乙醇法純化法強，測序結果質量 好；測序成本比采用BigDye Xterminator purificationkit便宜，對于中低通量測序，一個 反應成本降低3元人民幣。5)上機讀取序列分析結果，其具體實現方式是加入15 25ul 0. ImM EDTA后導 入測序讀板中，上機讀取結果。參見圖1，目前，采用的方法已經對近一萬個樣本進行測序，測序結果穩定、質量 高，特別適合中、低通量樣本的序列分析。
權利要求
一種核酸測序方法，其特征在于所述核酸測序方法包括以下步驟1)目的核酸片段進行PCR擴增；2)對步驟1)所得到的PCR擴增產物進行純化；3)對步驟2)所得到的純化后的PCR擴增產物進行測序PCR擴增；4)對步驟3)所得到的測序PCR擴增產物進行純化，其具體實現方式是4.1)將測序PCR擴增產物全量、磁珠8～12ul、85％酒精40～50ul充分混勻后置于空磁力架上2～10分鐘；4.2)棄掉上清液；4.3)加入80～200ul85％酒精進行清洗，并棄掉上清液；4.4)空氣中干燥1～10分鐘；5)上機讀取序列分析結果，其具體實現方式是加入15～25ul 0.1mM EDTA后導入測序讀板中，上機讀取結果。
2.根據權利要求1所述的核酸測序方法，其特征在于所述步驟4.1)中測序PCR擴增 產物全量、磁珠9 llul、85%酒精40 45ul充分混勻后置于空磁力架上2 5分鐘。
3.根據權利要求2所述的核酸測序方法，其特征在于所述步驟4.1)中測序PCR擴增 產物全量、磁珠10ul、85%酒精42ul充分混勻后置于空磁力架上3分鐘。
4.根據權利要求1或2或3所述的核酸測序方法，其特征在于所述磁珠是CleanSEQ 磁珠；所述磁力架是SPRI96磁力架。
5.根據權利要求4所述的核酸測序方法，其特征在于所述步驟2)的具體實現方式 是對步驟1)所得到的PCR擴增產物以蝦堿酶加堿性磷酸酶進行純化，其具體實現方式 是取PCR擴增產物全量、蝦堿酶加堿性磷酸酶0. 125-0. 5ul、ddH20 1. 5ul充分混勻后離 心，蝦堿酶加堿性磷酸酶作用反應條件37°C 30分鐘；80°C 15分鐘；15°C儲存。
6.根據權利要求5所述的核酸測序方法，其特征在于所述步驟2)中蝦堿酶與堿性磷 酸酶的比例為1:3。
7.根據權利要求6所述的核酸測序方法，其特征在于所述步驟1)的具體實現方式是(1. 1)取 DNAl-20ng、正向擴增引物 2. 5pmol、反向擴增引物 2. 5pmol、HotStartTaq MasterMix 5ul、ddH20 3. 9ul 充分混勻后離心；(1. 2)將步驟1. 1)所得到的混合液進行PCR反應，PCR反應條件95°C 15分鐘；95°C 30 秒、50-60°C 30 秒、72°C 1 分鐘，35 循環；72°C 3 分鐘；15°C儲存。
全文摘要
一種核酸測序方法，包括1)目的核酸片段進行PCR擴增；2)對步驟1)所得到的PCR擴增產物進行純化；3)對步驟2)所得到的純化后的PCR擴增產物進行測序PCR擴增；4)對步驟3)所得到的測序PCR擴增產物進行純化，其具體實現方式是4.1)將測序PCR擴增產物全量、磁珠8～12ul、85％酒精40～50ul充分混勻后置于空磁力架上2～10分鐘；4.2)棄掉上清液；4.3)加入80～200u185％酒精進行清洗，并棄掉上清液；4.4)空氣中干燥1～10分鐘；5)上機讀取序列分析結果，其具體實現方式是加入15～25ul 0.1mM EDTA后導入測序讀板中，上機讀取結果。本發明提供了一種可大幅降低成本、測序結果穩定、質量高、所需基因組DNA量少的核酸測序方法。
文檔編號C12Q1/68GK101812530SQ201010161889
公開日2010年8月25日 申請日期2010年5月4日 優先權日2010年5月4日
發明者孟濤, 楊進 申請人:楊進;孟濤