植物耐逆性相關蛋白TaTPRPK1及其編碼基因和應用的制作方法

專利名稱：植物耐逆性相關蛋白TaTPRPK1及其編碼基因和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物耐逆性相關蛋白TaTPRPKl及其編碼基因和應用。
背景技術：
干旱、高鹽及低溫等逆境脅迫是影響小麥生長、發育的障礙因子。因此，了解小麥對逆境條件的應答與信號傳導機制，提高小麥品種的抗逆性，成為小麥遺傳研究及小麥品種改良的重要任務之一。在逆境脅迫下植物體內會產生一系列應答反應，伴隨著許多生理生化及發育上的變化。明確植物對逆境的反應機制，將為抗逆基因工程研究和應用提供科學論據。目前，植物抗逆性研究已逐漸深入到細胞、分子水平，并與遺傳學和遺傳工程研究相結合，探索用生物技術來改進植物生長特性，其目的是提高植物對逆境的適應能力。在干旱、高鹽和低溫等環境脅迫的逆境條件下，植物能夠在分子、細胞和整體水平上做出相應的調整，以最大程度上減少環境所造成的傷害并得以生存。許多基因受脅迫誘導表達，這些基因的產物不僅能夠直接參與植物的脅迫應答，而且能夠調節其它相關基因的表達或參與信號傳導途徑，從而使植物避免或減少傷害，增強對脅迫環境的抗性。與脅迫相關的基因產物可以分為兩大類第一類基因編碼的產物包括離子通道蛋白、水通道蛋白、 滲透調節因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜堿等)合成酶等直接參與植物脅迫應答的基因產物；第二類基因編碼的產物包括參與脅迫相關的信號傳遞和基因表達調節的蛋白因子，如蛋白激酶、轉錄因子等。其中，蛋白激酶在植物脅迫信號的感知、傳遞的調控中起著重要作用。到目前為止，已發現的蛋白激酶約有300種左右，分子內都存在一個同源的由約 270氨基酸殘基構成的催化結構區。在細胞信號傳導、細胞周期調控等系統中，蛋白激酶形成了縱橫交錯的網絡。這類酶催化從ATP轉移出磷酸并共價結合到特定蛋白質分子中某些絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基的羥基上，從而改變蛋白質、酶的構象和活性。目前，在植物中已知的與脅迫相關的蛋白激酶主要有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶如 MAPK(mitogen-activated protein kinase), CDPK(calcium-dependent proteinkinase)；酪氨酸蛋白激酶如Src家族、Tec家族、ZAP70、家族、JAK家族；還有一種絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸雙特異性蛋白激酶，如DYRK相關的蛋白激酶，CDC25等。這三類蛋白激酶均有文獻報道參與植物相應外界環境脅迫的信號傳導過程，提高植物對外界逆境的適應能力。根據蛋白激酶的磷酸化氨基酸殘基的種類，蛋白激酶可以分為Ser/Thr蛋白激酶，Tyr蛋白激酶以及雙特異性Ser/Thr/Tyr蛋白激酶。Ser/Thr蛋白激酶主要包括MAPK， CDPK，JNK等。這種類型的蛋白激酶目前研究的較多，并且在信號傳導途徑中起重要作用。 而酪氨酸蛋白激酶分為兩類，一類是非受體型酪氨酸蛋白激酶，以src基因產物為代表，此外還有kS、Fyn、LCk、Fgr、Lyn、FpS/FeS及Abl等；另一類是受體型酪氨酸蛋白激酶，根據它們的結構不同，受體型酪氨酸激酶可以分為9種類型。在動物細胞中，酪氨酸蛋白激酶往往參與程序性細胞死亡、癌變等重要細胞行為。植物中酪氨酸蛋白激酶研究較晚。MayaMayrose等人的工作表明，西紅柿中的雙特異性激酶LeMPK3能夠提高植物對病原體的抵抗。文獻提出，在受到病原體的侵害后，LeMPK3激酶的活性首先提高，然后LeMPK3的mRNA 的表達量也短暫的提高。2002年，ParvathiRudrabhatla等人從花生cDNA文庫中得到一個雙特異性蛋白激酶，具有絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸蛋白激酶活性。并且發現，該激酶的mRNA 表達水平以及激酶活性受到低溫和高鹽脅迫的誘導。但是其蛋白表達水平卻沒有明顯的變化。在250mM濃度的NaCl處理24h下，STY的mRNA表達水平提高了 20倍，在4°C條件下處理Mh，其mRNA表達水平提高了 50倍左右。在IOOmMABA處理下，STY表達量沒有變化。目前，在許多植物中都發現蛋白激酶參與抗病，抗逆境等信號傳遞過程 (ParvathiRudrabhatla, 2002 ；Lizhong Xiong, 2003)。Parvathi Rudrabhatla 等認為，花生中的一種STY激酶參與了花生對非生物脅迫的起始相應，證明了一種非MAH(途徑的蛋白激酶級聯信號傳遞過程在非生物脅迫中起重要作用。Lizhong Xiong等人認為，水稻蛋白激酶0sMAPK5能夠提高水稻對低溫，干旱，高鹽以及病害等的抗性。而Jen Sheen認為，鈣離子依賴的蛋白激酶CDH((CDHa and CDH(Ia)能夠激活與植物抗逆境相關基因的啟動子， 參與植物逆境信號傳導過程。Riichiro Yoshida等報道，在擬南芥中ABA誘導的蛋白激酶 SnRK2在植物響應脫水脅迫的信號傳導過程中起到重要的作用。由于植物的逆境耐性是由多基因調控的復雜性狀，依靠導入單個功能性蛋白基因很難實現植物抗逆性的綜合提高。 因此，利用一個關鍵性轉錄因子促進多個功能基因的表達，從而增強植物的抗逆性，已經成為植物抗逆基因工程的研究熱點。綜合目前的研究結果，蛋白激酶在植物響應逆境脅迫的信號傳導途徑中占有重要的地位。蛋白激酶通過自身的磷酸化提高或者降低自身的激酶活性，通過磷酸化底物提高或者降低底物蛋白的酶活性，然后底物蛋白又調控下游基因的酶活，形成一個級聯調控途徑。如RAS信號調控途徑，在細胞受體酪氨酸蛋白激酶感受到配體的信號后，形成二聚體并發生自身磷酸化，激活RAS，然后由活化的RAS激活引起蛋白激酶的級聯反應。這種級聯調控是一種很精密很復雜的調控網絡，蛋白激酶可能在上游作為一種開關在行使其功能。

發明內容
本發明的目的是提供一種植物耐逆性相關蛋白TaTPRPKl及其編碼基因和應用。本發明提供的蛋白質TaTPRPKl，為一種雙特異性蛋白激酶，來源于小麥屬小麥 (Triticum aestivum L·)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。序列1所示蛋白質由494個氨基酸殘基組成的蛋白質，自氨基端第1至7位氨基酸殘基為N端豆蔻酰化位點，第63至312位氨基酸殘基為保守的絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸蛋白激酶激活區，自氨基端第392至481位氨基酸殘基為C端IPR保守區。TaTPRPKl激酶含有11個蛋白激酶共有的保守域，激酶保守區從第68位氨基酸到第312位氨基酸，跨度為 245個氨基酸。N端的肉豆蔻位點具有膜錨定功能，將蛋白定位在細胞膜內膜上。C端的TPR 保守區的主要功能是協助蛋白相互作用，也有引導蛋白定位在細胞核上的功能。為了使(a)中的TaTPRPKl便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1標簽的序列
標簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(b)中的TaTPRPKl可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的TaTPRPKl的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5' 端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。編碼所述蛋白的基因也屬于本發明的保護范圍。所述基因可為如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子1)序列表中序列2自5’端第195至1679位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2自5，端第195至1690位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列2所示的DNA分子；4)在嚴格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼耐逆性相關蛋白的 DNA分子；5)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐逆性相關蛋白的DNA分子。所述嚴格條件為在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。序列2中的cDNA序列由2112個核苷酸組成，開放閱讀框架為自5'端第195至 1679位核苷酸。含有所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的保護范圍。可用現有的植物表達載體構建含有所述基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA 片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農桿菌冠癭瘤誘導 (Ti)質粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉錄的非翻譯區均具有類似功能。使用所述基因構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、玉米的泛素啟動子⑴biquitin)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外， 使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子， 這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的， 可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。所述重組表達載體具體可為pBT 121-TaTPRPKl ；所述pBI 121-TaTPRPKl為將權利要求2所述基因插入pBI121的多克隆位點得到的重組質粒，優選為將序列表的序列2自5’ 端第195至1690位核苷酸所示的DNA片段插入pBI121的BamHI和BioI酶切識別位點之間得到的重組質粒。本發明還保護一種培育轉基因植物的方法，是將所述基因導入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的轉基因植物。所述基因具體可通過所述重組表達載體導入所述目的植物中。攜帶有所述基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接 DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。所述耐逆性具體可為耐鹽。所述目的植物既可以是單子葉植物也可以是雙子葉植物，如擬南芥(如哥倫比亞生態型擬南芥)、煙草(如W38)等。所述耐鹽性可體現為如下(I)或(II)或(III)中的至少一種(I)在鹽脅迫下，所述轉基因植物的葉綠素含量高于所述目的植物；(II)在鹽脅迫下，所述轉基因植物的根系長于所述目的植物；(III)在鹽脅迫下，所述轉基因植物的根表面積大于所述目的植物。所述耐鹽還可體現為如下(IV)和/或(V)(IV)在鹽脅迫下，所述轉基因植物的成活率高于所述目的植物；(V)在鹽脅迫下，所述轉基因植物的根長高于所述目的植物。擴增所述基因的全長或其任意片段的引物對也屬于本發明的保護范圍。本發明的TaTPRPKl在低溫、高鹽、茉莉酸甲酯、白粉病、乙烯的誘導下表達，在干旱、高溫、ABA、水楊酸脅迫下表達受抑制。TaTPRPKl能夠提高煙草和擬南芥對NaCl的抗性， 促進根系的發育。TaTPRPKl蛋白能夠自磷酸化。本發明提供的蛋白和基因為人為控制抗逆和耐逆相關基因的表達提供了基礎，將在培育抗逆性和耐逆性增強的植物中發揮重要的作用。


圖1為TaTPRPKl與水稻、擬南芥同源蛋白氨基酸序列的同源性比對結果。圖2為TaTPRPKl基因脅迫誘導表達的實時熒光定量PCR圖譜；A 茉莉酸甲酯處理；B 鹽漬處理；C 冷害處理；D 乙烯處理；E 水楊酸處理；F 脫落酸處理；G 干旱處理； H 高溫處理；I 白粉病病原菌處理。圖3為野生型擬南芥和轉基因擬南芥鹽脅迫處理5天后的照片。圖4為野生型擬南芥和轉基因擬南芥鹽脅迫處理2天后的照片和根長比較。圖5為野生型煙草和轉基因煙草的照片、根長比較和根表面積比較。圖6為野生型煙草和轉基因煙草的葉片照片和葉綠素含量比較。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。實施例1、TaTPRPKl的克隆一、mRNA 的分離將水培生長10天左右的小白麥(國家種質資源庫，編號ZMM2)三葉期幼苗NaCl 處理2小時，用液氮速凍，_80°C保存備用。采用Trizol法(TianGen)提取小麥葉片總RNA，第一鏈cDNA合成用反轉錄酶 XL(AMV)。采用SMART法合成ds cDNA, PCR產物進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。二、TaTPRPKl基因全長序列的獲得通過5’ RACE和3’ RACE的方法獲得小麥雙特異性蛋白激酶基因全長序列。將序列表的序列1所示的蛋白命名為TaTPRPKl蛋白，由494個氨基酸殘基組成， 具有保守的雙特異性蛋白激酶激活區和IPR結構域。TaTPRPKl的序列在Genabnk上進行比對，與水稻和擬南芥中的雙特異性蛋白激酶具有較高同源性(圖1)，而在小麥中未發現同源蛋白基因，證明TaTPRPKl是一個新的蛋白。將TaTPRPKl蛋白的編碼基因命名為TaTPRPKl 基因，其開放閱讀框架為自序列表的序列2的5'端第195位-1679位核苷酸。實施例2、實時熒光定量PCR分析TaTPRPKl的表達特性一、脅迫處理苗齡為10天的小白麥幼苗，進行以下處理(1)干旱處理將水培的小麥幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的濾紙上，干旱培養30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、M小時后取出材料，用液氮速凍，-80 °C
保存備用。(2)鹽漬處理將小麥幼苗置于2%的由NaCl和Na2SO4組成的鈉鹽溶液中(NaCl 與Na2SO4W質量百分比為3 2)中，光照培養30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、M小時后分別取出材料，用液氮速凍，-80°C保存備用。(3)脫落酸處理將小麥幼苗置于200 μ M的脫落酸(ABA)溶液中，光照培養30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時、48小時后分別取出并用液氮速凍，-80°C
保存備用。(4)冷害處理將小麥幼苗置于4°C培養箱，光照培養30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時后取出并用液氮速凍，_80°C保存備用。(5)茉莉酸甲酯處理將小麥幼苗置于50 μ M的茉莉酸甲酯(JA)溶液中，光照培養30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時后分別取出并用液氮速凍，-80 V
保存備用。(6)乙烯處理小麥幼苗置于含有乙烯的塑料袋中，光照培養30分鐘、1小時、2小時、6小時、12小時、24小時、48小時后分別取出并用液氮速凍，_80°C保存備用。(7)水楊酸處理將小麥幼苗置于50 μ M的水楊酸(SA)溶液中，光照培養30分鐘、 1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時后分別取出并用液氮速凍，_80°C保存備用。(8)高溫處理將小麥幼苗置于42°C下，光照培養30分鐘、1小時、2小時、4小時、 8小時、12小時、24小時、48小時后分別取出并用液氮速凍，-80°C保存備用。(9)白粉病病原菌處理將小麥幼苗接種白粉病菌株，光照培養3小時、6小時、12 小時、2天、3天、4天、5天后，取出并用液氮速凍，_80°C保存備用。(10)對照的處理直接取未經任何處理的小麥幼苗_80°C凍存作為對照(0小時)。二、mRNA 的分離Quikprep Micro mRNA Purification Kit(Pharmacia) πΛΝΑ 白勺^>畠。三.反轉錄為cDNA采用R103_Quant_Reverse_Transcriptase (TIANGEN)將純化的 mRNA 反轉錄為 cDNA。四、實時熒光定量PCR根據TaTPRPKl序列，在其可變區設計特異引物TaTPRPKlRTF和TaTPRPKlRTR(產物大小為135bp)。以actin為內參基因，引物為actin-2F和actin-2R。TaTPRPKlRTF :5，-ACATGGCAGAACAGGCTCTC-3，；TaTPRPKlRTR :5，-CCTTGAGAGCATCTTGAGCTTC-3，。actin-2F:5，-CTCCCTCACAACAACCGC-3，；actin-2R :5’ -TACCAGGAACTTCCATACCAAC-3，。TaTPRPKl對各個脅迫及激素表現出響應，見圖2。實施例3、TaTPRPKl提高了擬南芥的耐鹽性一、重組表達載體的構建1、TaTPRPK 1 基因的克隆根據TaTPRPKl基因的序列設計引物對(TaTPRPKl-121F和iTaTPRPKl-UlR)，引物末端分別引入BamHI和BioI酶切識別位點，以小白麥的cDNA為模板，PCR擴增TaTPRPKl。TaTPRPKl-121F :5，-TCCCCCGGGATGGGCGCCAGGATGTC-3’ ；TaTPRPKl-121R :5，-GGACTAGTTCAGTTCATATTCAGCGTCCG-3。PCR擴增產物進行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，采用Agarose Gel DNA Purification KitVer. 2. 0 (TaKaRa 公司，Code No. :DV807A)回收純化 1. 5Kb 左右的條帶。2、重組表達載體的構建①用限制性內切酶BamHI和BioI酶切步驟1回收純化的PCR產物，回收酶切產物；②用限制性內切酶BamHI和BioI酶切pBI121 (Clontech公司購買)，回收載體骨架；
③將步驟①的酶切產物和步驟②的載體骨架連接；④將步驟③的連接產物電擊轉化T0P10菌株(購自tiangen公司)，37°C過夜培養，挑取陽性克隆進行測序；測序結果表明，得到了重組質粒pBI121-TaTPRPKl (在pBI121 的BamHI和B10I酶切位點之間插入了序列表的序列2自5’端第195-1690位核苷酸所示的DNA片段)。二、轉基因植物的獲得1、用重組質粒pBI121_TaTPRPKl轉化農桿菌C58 (北京拜爾迪生物技術公司購買)，得到重組農桿菌。2、將重組農桿菌接種于YEP液體培養基中，28°C、3000rpm培養約30小時；3、將步驟2的菌液轉至YEP液體培養基(含50 μ g/ml利福平)中J8°C、300rpm 培養約14小時(菌液0D600達到1. 5-3. 0)；4、收集菌體，4°C、4000g離心 lOmin，用 10%蔗糖(含0. 02%silwet)稀釋至0D600 約為 0. 8-1. O ；5、將擬南芥(哥倫比亞生態型Col-O，SALK公司購買)整株與花盆一起倒扣在盛有步驟4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完畢后，取出花盆，側放于托盤中，蓋上黑色塑料布，24hr后揭開塑料布，直立放置花盆，進行正常的光照培養，收獲T1代種子，卡那霉素篩選(濃度為50yg/L卡那霉素)陽性植株。將陽性植株進行PCR鑒定，鑒定結果表明，得到的轉基因植株(轉TaTPRPKl基因植株)。T2代表示T1代自交產生的種子及由它所長成的植株，T3代表示T2代自交產生的種子及由它所長成的植株。三、轉空載體對照植物的獲得用質粒PBI121轉化農桿菌，得到重組農桿菌，用重組農桿菌轉化擬南芥，得到轉空載體對照植株，方法同步驟二。四、轉基因植物的耐鹽性鑒定分別將T3代轉基因植株(WK)、T3代轉空載體對照植株和擬南芥Col-O (WT，野生型)(各60株)進行耐鹽性鑒定。設置三次重復實驗，結果取平均值。將處于相同生長期的幼苗種在普通MS培養基上，生長兩天后，轉移到含有NaCl的 MS培養基(NaCl濃度為200mM)上繼續培養5天。第2天拍照并測量根長，第5天拍照并統計成活率。第5天的照片見圖3，擬南芥Col-O的成活率為10%，轉基因植株的成活率為 60%。第2天的照片見圖4A，根長比較見圖4B，轉基因株系的根長為擬南芥Col-O的2倍左右。轉空載體對照植株的表型與擬南芥Col-O —致，成活率與擬南芥Col-O沒有顯著差已升。實施例4、TaTPRPKl提高了煙草的耐鹽性一、重組表達載體的構建同實施例3的步驟一。二、轉基因植物的獲得1、用重組質粒pBI121_TaTPRPKl轉化農桿菌C58 (北京拜爾迪生物技術公司購買)，得到重組農桿菌。2、接種重組農桿菌于含有卡納霉素的LB培養基(卡納霉素的濃度為50μ g/ml)中，28°C培養1-2天；轉接到20mL LB培養基中，28°C繼續培養至0D600約0. 5 ；將菌液與MS 培養基等體積混合，得到浸泡液。3、取無菌煙草W38(購自中國農業科學院煙草所)葉片去除葉脈，剪成 0. 5cmX0. 5cm葉片，放入浸泡液中，浸泡10_15min，期間不斷輕搖幾次。4、取出材料，用無菌紙吸去多余菌液，MS固體培養基中暗培養2天；5、用無菌水清洗材料，用無菌紙吸去生長過度的菌體，把材料轉接到分化培養基 (普通MS培養基含lmg/L 6-AB和0. lmg/L IAA)中，25 °C光下培養，每兩周換一次培養基， 至分化出愈傷組織，直至出芽。6、將長至Icm的芽轉入生根培養基(即1/2MS培養基)上誘導生根得到轉基因植株(T0代)T1代表示Ttl代自交產生的種子及由它所長成的植株。三、轉空載體對照植物的獲得用質粒pBI121轉化農桿菌C58，得到重組農桿菌，用重組農桿菌轉化無菌煙草 W38，得到轉空載體對照植株，方法同步驟二。四、轉基因植物的耐鹽性鑒定分別將T1代轉基因植株的三個株系(WK1、WK20、WK68)、 \代轉空載體對照植株和野生型植株(W38)(各60株)進行耐鹽性鑒定。設置三次重復實驗，結果取平均值。將處于相同生長期的幼苗轉移到含有NaCl的MS培養基(NaCl濃度為200mM)上生長，作為實驗組；將處于相同生長期的幼苗轉移到MS培養基上生長，作為對照組。5天后拍照并測量根長，計算根表面積。不同株系的根長、根表面積平均值見表2。 照片見圖5A，根表面積比較見圖5B，根長比較見圖5C。轉基因的植株根系明顯比野生型植株龐大。轉空載體對照植株的表型與野生型植株一致。表2不同株系的根長和根表面積
權利要求
1.一種蛋白質，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于它為如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA 分子1)序列表中序列2自5，端第195至1679位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2自5，端第195至1690位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列2所示的DNA分子；4)在嚴格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼耐逆性相關蛋白的DNA 分子；5)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐逆性相關蛋白的 DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.如權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為 pBI 121-TaTPRPKl ；所述pBI 121-TaTPRPKl為將權利要求2所述基因插入pBI121的多克隆位點得到的重組質粒，優選為將序列表的序列2自5，端第195至1690位核苷酸所示的DNA 片段插入PBI121的BamHI和BioI酶切識別位點之間得到的重組質粒。
6.一種培育轉基因植物的方法，是將權利要求2或3所述基因導入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的轉基因植物。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于權利要求2或3所述基因通過權利要求4或 5所述重組表達載體導入所述目的植物中；所述耐逆性為耐鹽。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于所述目的植物為煙草，優選為煙草品種W38； 所述耐鹽性體現為如下(I)或(II)或(III)中的至少一種(I)在鹽脅迫下，所述轉基因植物的葉綠素含量高于所述目的植物；(II)在鹽脅迫下，所述轉基因植物的根系長度大于所述目的植物；(III)在鹽脅迫下，所述轉基因植物的根表面積大于所述目的植物。
9.如權利要求7所述的方法，其特征在于所述目的植物為擬南芥，優選為哥倫比亞生態型擬南芥；所述耐鹽體現為如下(IV)和/或(V)(IV)在鹽脅迫下，所述轉基因植物的成活率高于所述目的植物；(V)在鹽脅迫下，所述轉基因植物的根系長度大于所述目的植物。
10.擴增權利要求2或3所述基因的全長或其任意片段的引物對。
全文摘要
本發明公開了植物耐逆性相關蛋白TaTPRPK1及其編碼基因和應用。本發明提供的蛋白質，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。本發明還保護所述蛋白的編碼基因(TaTPRPK1)及其在培育耐逆植物中的應用。TaTPRPK1能夠提高植物對NaCl的抗性，促進根系的發育。本發明提供的蛋白和基因為人為控制抗逆和耐逆相關基因的表達提供了基礎，將在培育抗逆性和耐逆性增強的植物中發揮重要的作用。
文檔編號C12N5/10GK102234318SQ201010161609
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月27日 優先權日2010年4月27日
發明者徐兆師, 李連城, 陳明, 馬有志 申請人:中國農業科學院作物科學研究所