專利名稱：一種egfr基因突變檢測液相芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及一種EGFR基因突變檢測液相芯片。
背景技術(shù)：
表皮生長因子受體(印idermal growth factor rec印tor，EGFR)是一種廣泛分布于人體各組織細(xì)胞膜上的多功能糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，是ErbB家族的四個成員之一，因此又名HERl或ErbBl。EGFR被配體激活后啟動胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，經(jīng)過細(xì)胞質(zhì)中銜接蛋白、酶的級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子激活基因的轉(zhuǎn)錄，指導(dǎo)細(xì)胞遷移、黏附、增殖、分化和凋亡。 研究表明，在許多實體腫瘤中存在EGFR的高表達(dá)或異常表達(dá)，這為以EGFR為靶向的腫瘤治療和針對EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)干預(yù)治療提供了理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。目前，針對EGFR所開發(fā)的分子靶向藥物主要有兩類1)小分子酪氨酸激酶抑制劑 (TKI)，如吉非替尼(Gefitinib)和厄羅替尼(Erlotinib)，抑制EGFR胞內(nèi)區(qū)酪氨酸激酶活性；2)單克隆抗體(MAb)，如西妥昔(Cetuximab)和帕尼單抗(Panitumumab)，與EGFR胞外區(qū)結(jié)合，阻斷依賴于配體的EGFR活化。上述藥物通過不同途徑阻斷EGFR介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號通路，從而抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和血管生成，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，提高放化療敏感性。研究表明，吉非替尼等針對EGFR的分子靶向藥物，其療效與EGFR基因突變的情況顯著相關(guān)。迄今為止發(fā)現(xiàn)的EGFR基因突變90%以上位于外顯子19 21。這些突變可以分為3種類型1)外顯子19堿基缺失外顯子19突變主要是第746 752位密碼子的堿基缺失突變，導(dǎo)致EGFR蛋白中氨基酸(ELREATS)序列丟失，這一缺失改變了受體ATP結(jié)合囊(ATP-binding pocket, ABP) 的角度，從而顯著增強癌細(xì)胞對吉非替尼的敏感性。研究表明，外顯子19基因突變的發(fā)生率最高，占EGFR基因突變總數(shù)的50%以上。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)的外顯子19 基因突變至少有22種不同的類型。外顯子19突變主要有以下缺失類型，其具體序列如表所述，其中，相對于野生型，
突變型缺失的序列用“_”號表示
權(quán)利要求
1.一種EGFR基因突變檢測液相芯片，其特征是，主要包括有(A)針對EGFR基因的突變位點分別設(shè)計的野生型和突變型的ASPE引物對每種ASPE 引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物組成，所述tag序列選自SEQ IDN0. 1 SEQ ID NO. M中的序列；所述特異性引物是針對Exon 19突變型的特異性引物，該特異性引物分別來源于SEQ NO. 26 SEQ ID NO. 44中一種以上的堿基序列， 或來源于SEQN0. 73 SEQ ID NO. 96中的一種以上的堿基序列，每種特異性引物的3，端來源于相應(yīng)缺失區(qū)域3’端相鄰的1 6個堿基，并能特異地識別相應(yīng)的突變類型，和針對 Exon 19野生型的特異性引物，該特異性引物來源于SEQ NO. 25或其反向互補序列中的堿基序列，且其3’端含有每種需檢測的突變型的缺失區(qū)域中特有的缺失堿基，并其與所有突變型的特異性引物互不相同；和/或針對Exon 20、來源于SEQ NO. 45 SEQ NO. 46或其反向互補序列中的堿基序列；和/或針對Exon 21、來源于SEQ NO. 47-SEQ NO. 48或其互補序列中的堿基序列；針對Exon 20和Εχοη21的特異性引物的3’端的最后3位堿基中的一個堿基為突變位點；上述所有特異性引物的Tm值在52 58°C之間；(B)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag序列選自SEQID NO. 121 SEQ ID NO. 144中的序列，且所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(A) 中所選的tag序列互補配對；(C)用于分別擴增出具有Exon19,Exon 20和/或Exon 21的相應(yīng)突變位點的目標(biāo)序列的擴增引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的EGFR基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述擴增引物為 針對Exon 19的SEQ NO. 145 146 ；針對Exon 20，當(dāng)特異性引物來源于SEQ NO. 45 SEQ NO. 46時，擴增引物為SEQ NO. 147 148、當(dāng)特異性引物來源于SEQ NO. 45 SEQ NO. 46的反向互補序列時，擴增引物為SEQ NO. 149 150 ；針對Exon 21，當(dāng)特異性引物來源于SEQ NO. 47 SEQ NO. 48時，擴增引物為SEQ NO. 151 152、當(dāng)特異性引物來源于SEQ NO. 47 SEQ NO. 48的反向互補序列時，擴增引物為SEQ NO. 153 54。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的EGFR基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述針對Exon 19突變型的特異性引物，每種特異性引物的3’端來源于相應(yīng)缺失區(qū)域3’端相鄰的1 3 個堿基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的EGFR基因突變檢測液相芯片，其特征是，針對Exon19 的特異性引物為:SEQ NO. 50 68中的一種以上和SEQ NO. 49、或SEQ NO. 98 116中的一種以上和SEQ NO. 97。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的EGFR基因突變檢測液相芯片，其特征是，針對Exon20 的特異性引物為:SEQ NO. 69 70、或SEQ NO. 117 118。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的EGFR基因突變檢測液相芯片，其特征是，針對Exon21 的特異性引物為:SEQ NO. 71 72、或SEQ NO. 119 120。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種EGFR基因突變檢測液相芯片，主要包括有針對EGFR基因的突變位點分別設(shè)計的野生型和突變型的ASPE引物對每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物組成；分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，且所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補配對；用于分別擴增出具有Exon 19、Exon 20和/或Exon 21的相應(yīng)突變位點的目標(biāo)序列的擴增引物。本發(fā)明所提供的檢測方法與測序法的吻合率高達(dá)100％。所制備的EGFR基因突變檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設(shè)計的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)。
文檔編號C12Q1/68GK102234683SQ20101016075
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者余剛, 李國強, 秦會娟, 許嘉森 申請人:廣州益善生物技術(shù)有限公司