專利名稱：家蠶培養細胞表達抗菌肽Cecropin B的方法
技術領域：
本發明涉及DNA重組技術、蛋白質的純化與活性分析，尤其涉及一種家蠶培養細 胞表達重組天蠶抗菌肽Cecropin B的方法。
背景技術：
天蠶抗菌肽Cecropin B是由天蠶細胞產生的一類具有廣譜和較強抗菌活性的蛋 白質，該抗菌肽編碼基因為105個核苷酸，編碼35個氨基酸，蛋白分子量約為4kDa。Boman, H.G.和Faye，I等于1985年首先開始了天蠶抗菌肽Cecropin B基因的研究，而國內這方 面研究較少。
發明內容
本發明的目的在于提供一種家蠶培養細胞表達抗菌肽Cecropin B的方法，利用基 因工程表達技術，構建含有抗菌肽Cecropin B基因的重組病毒，并利用家蠶培養細胞作為 宿主，表達生產具有生物活性的重組抗菌肽Cecropin B。為了達到上述目的，本發明采用的技術方案其步驟如下該家蠶培養細胞表達抗 菌肽Cecropin B的方法主要包括(1)天蠶Cecropin B基因的克隆以天蠶蛹脂肪體細胞抽提的總RNA為模板，利用RT-PCR擴增得到天蠶抗菌 肽Cecropin B基因；所述PCR擴增所用的引物設計如下正向引物為含有BamHI酶切 位點的5’ atcggatcc aaatggaaagtcttcaag 3’ ；反向引物為含有Hindlll酶切位點的 5'aagcttttatagcgct ttggcttcgcc 3’ ；所述PCR擴增反應為一個循環，94°C模板變性3分 鐘；接著30個循環，94°C變性50秒，55°C退火30秒，72°C延伸1分鐘；最后1個循環，72°C 延伸10分鐘；利用瓊脂糖凝膠電泳對所述抗菌肽Cecropin B基因進行PCR產物分析，并 用Qiagene的PCR純化試劑盒純化，隨后將純化后的PCR產物克隆進TA載體pCR2. 1，得到 PCR2. 1-Cecropin B，利用雙脫氧鏈終止法在核苷酸測序儀上測序確認克隆基因順序正確 性；(2)含有天蠶抗菌肽Cecropin B基因的重組桿狀病毒的構建用限制性內切酶BamHI 和 Hindlll 消化 pCR2. 1-Cecropin B 得到 Cecropin B 基 因片段，然后將Cecropin B基因片段克隆入桿狀病毒轉移載體pBlueBacHisa得到重組的 轉移載體；將該重組的轉移載體與家蠶野生型核型多角體病毒BmNPV DNA共轉染入家蠶培 養細胞，按以下方式通過同源重組產生重組病毒在聚苯乙烯錐形管中加入li! g轉移載體DNA和15i! g家蠶BmNPV DNA，并加入 14ul脂質體lipofectin后混勻，最后加入滅菌蒸餾水直至聚苯乙烯錐形管內混合物的總 體積達到40 yl ；將該混合物在室溫培育15分鐘后共轉染對數生長期的家蠶培養細胞；然 后將該共轉染后的家蠶培養細胞先用無血清的TC-100培養基培養24小時，再用含有10%胎牛血清的新鮮培養基在27°C條件下培養5天，收集培養基上清作為病毒儲存原液以用來 篩選重組病毒；重組病毒通過三輪空斑篩選，獲得濃度為108pfu/ml的病毒溶液，該病毒溶 液命名為含有抗菌肽Cecropin B基因的重組病毒；(3)家蠶培養細胞表達使用家蠶培養細胞，接種所述含有天蠶抗菌肽Cecropin B基因的重組病毒在 27°C下感染三天以進行感染表達，后通過離心收集家蠶培養細胞。本發明與現有技術相比，具有的有益效果是本發明從天蠶中克隆了抗菌肽Cecropin B基因，并進行了測序，建立了利用我國 的特色資源家蠶培養細胞表達重組抗菌肽Cecropin B的技術，為重組抗菌肽Cecropin B 的應用奠定基礎。本發明解決了抗菌肽Cecropin B在大腸桿菌中表達需要復雜的復性操 作、酵母表達中質粒轉化體不穩定和在哺乳動物培養細胞生產的成本太高的缺點，獲得的 家蠶培養細胞表達重組天蠶抗菌肽CecropinB具有較高的生物活性，且大部分被分泌進培 養基中，非常有利于蛋白質的快速提取。本發明重組Cecropin B可以大量生產，為抗菌肽 Cecropin B在醫學和食品上的應用開辟了廣闊的前景。
圖1是桿狀病毒轉移載體pBlueBacHisa的圖譜；圖2是本發明Cecropin B在家蠶培養細胞中表達SDS-PAGE的圖譜。
具體實施例方式1.材料DNA抽提試劑盒購于Qiagene。DNA處理和PCR擴增試劑盒購于 Takara Biomedicals (Kyoto, Japan)。TA 克隆試劑盒、桿狀病毒轉移載體 pBlueBacHisa、 lipofectin和Ni-NTA樹脂均為美國Invitrogen公司產品。DNA測序試劑盒購于PE Applied Biosystems。胎牛血清FCS、家蠶培養細胞培養基TC-100均為GibcoBRL的產品。2 工作流程2. 1本發明家蠶培養細胞表達重組抗菌肽Cecropin B包括如下部分(1)天蠶Cecropin B基因的克隆以天蠶蛹脂肪體細胞抽提的基因組DNA為模板，利用PCR技術擴增得到抗菌肽 Cecropin B基因。該PCR擴增的具體方法如下其中，PCR擴增所用的弓丨物設計為正向弓丨物5’ atcggatcc aaatggaaagtcttcaag3', # W BamHI _ 貞 H ; J^ (^l 弓I 5' aagcttttatagcgct ttggcttcgcc 3，，含有 Hindlll 酶切位點。PCR反應的循環數、溫度和時間的設計如下一個循環，94°C模板變性3分鐘；接著 30個循環，94°C變性50秒，55°C退火30秒，72°C延伸1分鐘；最后1個循環，72°C延伸10分鐘。然后，利用1 %瓊脂糖凝膠電泳對得到的抗菌肽Cecropin B基因進行PCR產物分 析，并用Qiagene的PCR純化試劑盒純化，隨后將純化后的PCR產物克隆進Invitrogen公 司的TA克隆3. 9kb的載體pCR2. 1，得到pCR2. 1-Cecropin B,利用雙脫氧鏈終止法在核苷 酸測序儀上測序確認克隆基因順序正確性。Cecropin B基因具有如SEQ No. 1所示的序列，該Cecropin B基因編碼35個氨基酸。(2)含有天蠶抗菌肽Cecropin B基因的重組桿狀病毒的構建用限制性內切酶BamHI 和 Hindlll 消化 pCR2. 1-Cecropin B 得到 Cecropin B 基 因片段，然后將Cecropin B基因片段克隆入美國Irwitrogene公司的桿狀病毒轉移載體 pBlueBacHisa得到如圖1所示的重組的桿狀病毒轉移載體pBlueBacHisa。將此重組的轉 移載體與家蠶野生型核型多角體病毒BmNPV DNA共轉染入家蠶培養細胞，通過同源重組產 生重組病毒，具體方法為在聚苯乙烯錐形管中加入lii g轉移載體DNA和15ii g家蠶BmNPV DNA，并加入 14ul脂質體lipofectin后混勻，最后加入滅菌蒸餾水直至聚苯乙烯錐形管內混合物的總 體積達到40 yl ；將該混合物在室溫培育15分鐘后共轉染對數生長期的家蠶培養細胞；然 后將該共轉染后的家蠶培養細胞先用無血清的TC-100培養基培養24小時，再用含有10% 胎牛血清的新鮮培養基在27°C條件下培養5天，收集培養基上清作為病毒儲存原液以用來 篩選重組病毒；重組病毒通過三輪空斑篩選，獲得濃度為108pfu/ml的病毒溶液。本發明將 該病毒溶液命名為含有抗菌肽Cecropin B基因的重組病毒。(3)家蠶培養細胞表達使用家蠶培養細胞，接種上述含有抗菌肽Cecropin B基因的重組病毒進行感染表 達在27°C下感染三天，通過離心收集家蠶培養細胞。該含有抗菌肽Cecropin B基因在家 蠶培養細胞中表達SDS-PAGE的圖譜參見圖2。圖2中標記為1的是蛋白質標準分子量，2 為對照培養細胞，3為表達重組Cecropin B的樣品，箭頭所示的條帶即為Cecropin B，其分 子量大小為4. 0，與預測的大小一致。2. 2含有抗菌肽Cecropin B的純化將收集的細胞作為重組抗菌肽Cecropin B純化的起始材料。由于重組蛋白N-末端帶有6 XHis尾巴，因此利用Ni_NTA親和柱在非變性條件下 進行蛋白純化；用非變性結合緩沖液，Na3P04 50mmol/L, NaCl 0. 5mol/L, pH 8. 0，加入細胞 中并勻漿，離心后取上清液；樣品隨后結合于Ni-NTA柱，最后重組蛋白用含有250mmol/L咪 唑的非變性洗脫緩沖液洗脫，通過SDS-PAGE考馬斯亮藍染色后鑒定重組蛋白。2. 3含有抗菌肽Cecropin B的活性分析鑒定取對數生長期的大腸桿菌2 y L，加入到含有2mL LB液體培養基的試管中，再加入 上述純化的重組Cecropin B蛋白溶液200 uL(0. 5ug/uL)，并以加入PBS為對照。37°C振 蕩培養4h測定菌液的0D,值，觀察其抗菌活性。抗菌活性檢測表明，添加了重組Cecropin B蛋白的大桿菌菌液的0D_分別為0. 194，而對照為0. 456，比對照大大下降。由此說明重 組Cecropin B蛋白在體外具有明顯的抑菌活性。
權利要求
一種家蠶培養細胞表達抗菌肽Cecropin B的方法，其特征在于包括(1)天蠶Cecropin B基因的克隆以天蠶蛹脂肪體細胞抽提的總RNA為模板，利用RT-PCR擴增得到天蠶抗菌肽Cecropin B基因；所述PCR擴增所用的引物設計如下正向引物為含有BamHI酶切位點的5’atcggatcc aaatggaaagtcttcaag 3’；反向引物為含有HindIII酶切位點的5’aagcttttatagcgct ttggcttcgcc 3’；所述PCR擴增反應為一個循環，94℃模板變性3分鐘；接著30個循環，94℃變性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘；最后1個循環，72℃延伸10分鐘；利用1％瓊脂糖凝膠電泳對所述抗菌肽Cecropin B基因進行PCR產物分析，并用Qiagene的PCR純化試劑盒純化，隨后將純化后的PCR產物克隆進TA載體pCR2.1，得到pCR2.1-Cecropin B，利用雙脫氧鏈終止法在核苷酸測序儀上測序確認克隆基因順序正確性；(2)含有天蠶抗菌肽Cecropin B基因的重組桿狀病毒的構建用限制性內切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1-Cecropin B得到Cecropin B基因片段，然后將Cecropin B基因片段克隆入桿狀病毒轉移載體pBlueBacHisa得到重組的轉移載體；將該重組的轉移載體與家蠶野生型核型多角體病毒BmNPV DNA共轉染入家蠶培養細胞，按以下方式通過同源重組產生重組病毒在聚苯乙烯錐形管中加入1μg轉移載體DNA和15μg家蠶BmNPV DNA，并加入14μl脂質體lipofectin后混勻，最后加入滅菌蒸餾水直至聚苯乙烯錐形管內混合物的總體積達到40μl；將該混合物在室溫培育15分鐘后共轉染對數生長期的家蠶培養細胞；然后將該共轉染后的家蠶培養細胞先用無血清的TC-100培養基培養24小時，再用含有10％胎牛血清的新鮮培養基在27℃條件下培養5天，收集培養基上清作為病毒儲存原液以用來篩選重組病毒；重組病毒通過三輪空斑篩選，獲得濃度為108pfu/ml的病毒溶液，該病毒溶液命名為含有抗菌肽Cecropin B基因的重組病毒；(3)家蠶培養細胞表達使用家蠶培養細胞，接種所述含有天蠶抗菌肽Cecropin B基因的重組病毒在27℃下感染三天以進行感染表達，后通過離心收集家蠶培養細胞。
全文摘要
本發明公開一種家蠶培養細胞表達抗菌肽Cecropin B的方法，包括(1)以天蠶蛹脂肪體細胞抽提的總RNA為模板，利用RT-PCR擴增得到天蠶抗菌肽Cecropin B基因；利用1％瓊脂糖凝膠電泳對抗菌肽Cecropin B基因進行PCR產物分析，并用Qiagene的PCR純化試劑盒純化，隨后將純化后的PCR產物克隆進TA載體pCR2.1，得到pCR2.1-Cecropin B，利用雙脫氧鏈終止法確認克隆基因順序正確性；(2)用限制性內切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1-Cecropin B得到Cecropin B基因片段后再克隆入桿狀病毒轉移載體pBlueBacHisa得到重組的轉移載體；將該重組的轉移載體與家蠶野生型核型多角體病毒BmNPV DNA共轉染入家蠶培養細胞，通過同源重組產生重組病毒(3)使用家蠶培養細胞，接種含有天蠶抗菌肽Cecropin B基因的重組病毒在27℃下感染三天以進行感染表達，后通過離心收集家蠶培養細胞。
文檔編號C12N15/12GK101845439SQ20101015822
公開日2010年9月29日 申請日期2010年4月27日 優先權日2010年4月27日
發明者吳小鋒, 胡小龍, 郭愛芹, 陳琳 申請人:浙江大學