專利名稱：一種高效抗氧化劑-馬鈴薯蛋白抗氧化肽的制備方法
技術領域：
本發明提供了一種新型高效抗氧化劑一馬鈴薯蛋白抗氧化肽的制備方法，屬于農產品精深加工領域，馬鈴薯蛋白抗氧化肽可作為功能性添加劑用于食品和化妝品。
背景技術：
馬鈴薯是繼大米、小麥和玉米之后的世界第四大糧食作物。中國是世界上馬鈴薯 種植面積最大的國家。馬鈴薯由于淀粉含量高，是淀粉工業的原料之一。在生產淀粉的過 程中，產生了大量的廢水。這些廢水中富含蛋白質和一些多糖，COD(化學耗氧)值較高，直 接排放則會造成環境污染。為了減少淀粉生產廢水排放對環境的損害，實現廢棄資源的有 效利用，淀粉工業則從這些廢水中回收有價值的一些物質，如馬鈴薯蛋白。工業上對馬鈴薯 蛋白的回收一般采用酸沉淀結合高溫熱處理的方法，這種方法極大損害了馬鈴薯蛋白的品 質，特別是其溶解性。因此，工業生產獲得的馬鈴薯蛋白品質較低，通常被用于做為動物飼 料，產品附加值不高。而馬鈴薯蛋白是一種氨基酸比例很平衡的蛋白來源，有較高的營養價 值和潛在的功能品質。為了提高馬鈴薯蛋白的工業附加值和進一步拓寬馬鈴薯蛋白的應用 領域以及提升工業馬鈴薯蛋白的應用價值，通過酶解的手段將馬鈴薯蛋白水解成溶解度高 且具備一定功能的多肽產品則是一種十分有效的途徑。對馬鈴薯加工業來講，可以使其產 業鏈得到進一步延伸，由淀粉加工延伸至馬鈴薯蛋白的加工，進而延伸到馬鈴薯蛋白產品 的應用開發；可以改善馬鈴薯副產物的品質，拓寬馬鈴薯蛋白的應用范圍，提高馬鈴薯副產 物的附加值，使這部分廢棄物得到綜合利用；可以減少馬鈴薯淀粉工業高營養廢水的排放， 減少廢水排放帶來的環境污染問題，使馬鈴薯淀粉企業實現清潔生產，這些對企業提高自 身的科技含量和社會責任感，拓寬企業的產品線都有極其重要的經濟意義和社會意義，也 符合目前植物來源蛋白深加工的發展方向。目前，關于馬鈴薯蛋白抗氧化肽的報道較少，國外關于馬鈴薯蛋白抗氧化的報道 主要是利用水解后的粗混合物測定清除自由基能力、還原力以及螯合自由基能力，并將其 應用于肉糜體系和模擬法蘭克福香腸體系，合成馬鈴薯蛋白的抗氧化肽用于動物實驗。國 內還未見馬鈴薯蛋白抗氧化肽作為抗氧化劑的報道。本發明產品分子量分布范圍在100 1034Da，能夠清除自由基，延緩食品乳狀液中脂肪的氧化，提高產品的貨架期，是一種安全 的可作為抗氧化劑的馬鈴薯抗氧化肽。
發明內容
本發明的目的是提供一種新型高效抗氧化劑——馬鈴薯蛋白抗氧化肽的制備方 法，所得產品可以高效抑制水包油乳狀液中脂肪氧化，提高乳狀液的氧化穩定性。本發明的技術方案一種高效抗氧化劑——馬鈴薯蛋白抗氧化肽的制備方法，以 工業馬鈴薯蛋白為原料，用水配制懸濁液，調pH后加入堿性蛋白酶Alcalase進行酶解，滅 酶冷卻，離心微濾，濾液經真空濃縮后用凝膠色譜柱分離，洗脫的組分經冷凍干燥得到三種 馬鈴薯蛋白抗氧化肽，肽結構分別為YFE(Tyr-Phe-Glu)、NYKQM(Asn-Tyr-Lys-Gln-Me)及TY(Thr-Tyr)，分子量分布范圍100 1034Da ；(1)工業馬鈴薯蛋白原料其蛋白含量大于或等于80% ；(2)配制懸濁液馬鈴薯蛋白粉加水攪拌，制成40g/L蛋白懸濁液；(3)酶解酶解條件為pH值為7. 9 8. 1，溫度48 52°C，調pH后加入堿性蛋 白酶Alcalase進行酶解，酶活為400000u/mL，酶/底物(蛋白粉干基計)以mL/g計為 0. 95/100 1. 05/100,600-800r/min 攪拌酶解 lh，酶解結束后調 pH 到 7. 0 7. 1 ；(4)滅酶冷卻將所得酶解液升溫加熱至80°C，保溫15min滅酶，快速冷卻；(5)離心微濾酶解液經5000r/min離心25min，上清液過0. 45 μ m微濾膜；(6)真空濃縮透過液在真空度0. IMPa，溫度45 50°C下真空濃縮至固形物含量 50%以上；(7)凝膠色譜柱分離以S^hadex G15為填料填充層析柱，以蒸餾水為洗脫劑平 衡填充好的層析柱12 16h后備用；將檢測器波長設定在280nm，取8 IOmL步驟(6) 所得的濃縮液加入填充Sephadex G15填料的凝膠層析柱進行分離，以蒸餾水為洗脫劑， 流速控制在0. 8 1. 2mL/min，打開記錄儀在記錄儀上記錄凝膠層析柱組分洗脫的信號， 隨著洗脫的進行記錄儀記錄下不同的洗脫峰，等到記錄儀上記錄的信號值和初始時的信 號值接近時，平衡一個柱體積后結束分離過程，按照記錄儀上記錄下的不同洗脫峰分別收 集相應的樣品，得到不同分子量分布的組分，多次重復上樣，將收集到的同一種組分合并； 共收集得到三個組分，結構分別為YFE(Tyr-Phe-Glu)、NYKQM(Asn-Tyr-Lys-Gln-Me)禾口 TY(Thr-Tyr)，分子量分布范圍為100 1034Da ；(8)冷凍干燥將得到的收集組分冷凍干燥，冷凍干燥真空度為10 30Pa，溫 度-30 _55°C，干燥時間48h，水分含量低于5%，干燥后得到的產品即為馬鈴薯蛋白抗氧 化肽。馬鈴薯抗氧化肽產品的ABTS+‘自由基清除能力測定是按如下方法進行(I)ABTS+-自由基工作液的制備將7mM ABTS儲備液和2. 45mM高硫酸鉀(最終濃 度)混合。在室溫、避光條件下靜置16h，形成ABTS+·自由基儲備液。使用前用0.2M磷酸 鹽緩沖液(PH7. 4)稀釋成工作液，使其在734nm處的吸光度值為0. 70 士0. 02。(2) ABTS+-自由基清除能力測定20 μ L樣品液與1980 μ LABTS+'自由基工作液混 合，反應IOmin后在734nm測定吸光度值，以超純水為空白。ABTS+-自由基清除能力=[(空白樣品吸光值-樣品吸光值)/空白樣品吸光 值]X100%馬鈴薯抗氧化肽產品延緩乳狀液中脂肪氧化能力的測定是按如下方法進行(1)乳狀液的制備將10襯％大豆油和90wt%水相溶液用高速分散機在21，500r/ min下乳化2min，再將乳化液用ATS高壓均質機(ATS Engineering Inc.)在32MPa均質兩 次，得到的乳狀液加入0. 02% NaN3作為抑菌劑。水相溶液的組成1. 125wt% Tween 20溶 于水解馬鈴薯蛋白不同G15柱分離得到的產品溶液(0. IM磷酸鹽緩沖液，pH7. 0)。(2)乳狀液的氧化乳狀液的氧化使用烘箱法進行氧化。將乳狀液分裝在20mL帶 蓋的玻璃瓶中，用鋁箔紙包裹，放入隔水式培養箱中37°C氧化。定期測定體系丙二醛值。丙 二醛的測定方法如下配制硫代巴比妥酸(TBA)溶液(0. 375g硫代巴比妥酸，15g三氯乙 酸，1. 76mL 12M HCl和82. 9mL水混合，加入3mL2% BHA (丁基羥基茴香醚)溶液(溶于乙醇)混勻)，取2mLTBA溶液，0. 5mL樣品以及0. 5mL水混勻，在沸水浴中加熱15min，取出在 自來水中冷卻到室溫，5000r/min離心25min，取上清液在532nm處比色。以1，1，3，3_四乙
氧基丙烷做標準曲線，確定樣品中的丙二醛值。本發明的有益效果本發明所得產品是通過酶解等方法制備得到的一種新型高效 抗氧化劑，產品的安全性較合成抗氧化劑高，可以有效延緩乳狀液中脂肪的氧化，制備方法 簡單，適合工業化生產，本發明對于提高馬鈴薯蛋白的工業附加值，推進馬鈴薯蛋白的深加 工，延伸馬鈴薯加工的產業鏈，綜合利用馬鈴薯資源有著重要的經濟價值和社會意義。
圖1產品的ABTS自由基清除能力。由圖1顯示G15精制得到的幾個組分都有一定的清除自由基的能力，而組分3 (峰 3)濃度為lmg/mL時清除自由基的能力比5mg/mL的原液還要高，因此具備較高的抗氧化能 力，可用于延長產品的貨架期或提高產品的抗氧化能力。圖2產品的提高乳狀液氧化穩定性能力。由圖2顯示，G15精制分離得到的組分3(峰3)濃度為lmg/mL時比5mg/mL的原 液延緩脂肪氧化能力還略強，和對照相比更是可以有效抑制脂肪氧化，使產品在貨架期內 有更好的品質，可作為一種高效的抗氧化劑。
具體實施例方式實施例1取馬鈴薯蛋白粉64g溶解在1600mL去離子水中，將馬鈴薯蛋白溶液(4%，w/v) 調PH到8. 0左右，加入堿性蛋白酶Alcalase 0. 64mL，酶活為400000u/mL，用Alcalase酶 在50°C、600-800r/min攪拌酶解Ih。水解結束后，用IM的NaOH調解pH至7. 0，80°C滅酶 15min。5000g離心25min分離酶解液，取上清液在微濾裝置中用0. 45 μ m的微濾膜過濾，得 到透過液。將透過液在真空度0. IMPa，溫度48 °C下進行真空濃縮，濃縮至固形物含量50% 以上。將濃縮液加入填充Si^phadex G15填料的凝膠層析柱進行分離，得到不同分子量分布 的組分，多次重復上樣，將收集到的同一種組分合并，在_40°C預凍后進行冷凍干燥，冷凍干 燥真空度為30Pa，冷凍干燥溫度-50°C，干燥時間48h，得到馬鈴薯蛋白抗氧化肽。實施例2取馬鈴薯蛋白粉64g溶解在1600mL去離子水中，將馬鈴薯蛋白溶液(4%，w/v) 調PH到8. 0左右，加入堿性蛋白酶Alcalase 0. 608mL，酶活為400000u/mL，用Alcalase酶 在48°C、600-800r/min攪拌酶解Ih。水解結束后，用IM的NaOH調解pH至7. 0，80°C滅酶 15min。5000g離心25min分離酶解液，取上清液在微濾裝置中用0. 45 μ m的微濾膜過濾，得 到透過液。將透過液在真空度0. IMPa，溫度48 °C下進行真空濃縮，濃縮至固形物含量50% 以上。將濃縮液加入填充Si^phadex G15填料的凝膠層析柱進行分離，得到不同分子量分布 的組分，多次重復上樣，將收集到的同一種組分合并，在_40°C預凍后進行冷凍干燥，冷凍干 燥真空度為30Pa，冷凍干燥溫度-50°C，干燥時間48h，得到馬鈴薯蛋白抗氧化肽。實施例3取馬鈴薯蛋白粉64g溶解在1600mL去離子水中，將馬鈴薯蛋白溶液(4%，w/v)調pH到8. O左右，加入堿性蛋白酶Alcalase 0. 672mL，酶活為400000u/mL，用Alcalase酶 在52°C、600-800r/min攪拌酶解Ih。水解結束后，用IM的NaOH調解pH至7. 0，80°C滅酶 15min。5000g離心25min分離酶解液，取上清液在微濾裝置中用0. 45 μ m的微濾膜過濾，得 到透過液。將透過液在真空度0. IMPa，溫度48 °C下進行真空濃縮，濃縮至固形物含量50% 以上。將濃縮液加入填充Si^phadex G15填料的凝膠層析柱進行分離，得到不同分子量分布 的組分，多次重復上樣，將收集到的同一種組分合并，在_40°C預凍后進行冷凍干燥，冷凍干 燥真空度為30Pa，冷凍干燥溫度-50°C，干燥時間48h，得到馬鈴薯蛋白抗氧化肽/
權利要求
一種高效抗氧化劑——馬鈴薯蛋白抗氧化肽的制備方法，其特征在于以工業馬鈴薯蛋白為原料，用水配制懸濁液，調pH后加入堿性蛋白酶Alcalase進行酶解，滅酶冷卻，離心微濾，濾液經真空濃縮后用凝膠色譜柱分離，洗脫的組分經冷凍干燥得到三種馬鈴薯蛋白抗氧化肽，肽結構分別為Tyr-Phe-Glu、Asn-Tyr-Lys-Gln-Me及Thr-Tyr，分子量分布范圍100～1034Da；制備步驟為(1)工業馬鈴薯蛋白原料其蛋白含量大于或等于80％；(2)配制懸濁液馬鈴薯蛋白粉加水攪拌，制成40g/L蛋白懸濁液；(3)酶解酶解條件為pH值為7.9～8.1，溫度48～52℃，調pH后加入堿性蛋白酶Alcalase進行酶解，酶活為400000u/mL，酶/底物蛋白粉干基計以mL/g計為0.95/100～1.05/100，600-800r/min攪拌酶解1h，酶解結束后調pH到7.0～7.1；(4)滅酶冷卻將所得酶解液升溫加熱至80℃，保溫15min滅酶，快速冷卻；(5)離心微濾酶解液經5000r/min離心25min，上清液過0.45μm微濾膜；(6)真空濃縮透過液在真空度0.1MPa，溫度45～50℃下真空濃縮至固形物含量50％以上；(7)凝膠色譜柱分離以Sephadex G15為填料填充層析柱，以蒸餾水為洗脫劑平衡填充好的層析柱12～16h后備用；將檢測器波長設定在280nm，取8～10mL步驟(6)所得的濃縮液加入填充Sephadex G15填料的凝膠層析柱進行分離，以蒸餾水為洗脫劑，流速控制在0.8～1.2mL/min，打開記錄儀在記錄儀上記錄凝膠層析柱組分洗脫的信號，隨著洗脫的進行記錄儀記錄下不同的洗脫峰，等到記錄儀上記錄的信號值和初始時的信號值接近時，平衡一個柱體積后結束分離過程，按照記錄儀上記錄下的不同洗脫峰分別收集相應的樣品，得到不同分子量分布的組分，多次重復上樣，將收集到的同一種組分合并；共收集得到三個組分，結構分別為Tyr-Phe-Glu、Asn-Tyr-Lys-Gln-Me及Thr-Tyr，分子量分布范圍為100～1034Da；(8)冷凍干燥將得到的收集組分冷凍干燥，冷凍干燥真空度為10～30Pa，溫度-30～-55℃，干燥時間48h，水分含量低于5％，干燥后得到的產品即為馬鈴薯蛋白抗氧化肽。
全文摘要
一種高效抗氧化劑——馬鈴薯蛋白抗氧化肽的制備方法，屬于農產品精深加工技術領域。本發明以工業馬鈴薯蛋白為原料，通過堿性蛋白酶Alcalase水解、酶解液微濾濃縮、Sephadex G15凝膠色譜柱分離、冷凍干燥等步驟，獲得新型、高效的馬鈴薯蛋白抗氧化肽產品，肽結構分別為YFE(Tyr-Phe-Glu)、NYKQM(Asn-Tyr-Lys-Gln-Me)和TY(Thr-Tyr)，抗氧化肽的相對分子量范圍為100-1043Da。本發明所制備的產品具有較強的清除自由基能力，可以有效增加乳狀液中脂肪的氧化穩定性，產品安全性高，且制備方法簡單，可有效改善馬鈴薯蛋白的功能性質，對馬鈴薯蛋白的深加工和附加值的提高以及馬鈴薯的綜合利用和產業鏈的延長都有重要的意義。
文檔編號C12P21/06GK101824458SQ20101015697
公開日2010年9月8日 申請日期2010年4月15日 優先權日2010年4月15日
發明者何志勇, 熊幼翎, 秦昉, 程宇, 范柳萍, 陳潔 申請人:江南大學