專利名稱：植物中菌根誘導表達的磷酸鹽轉運蛋白基因啟動子的順式調控元件的制作方法
技術領域：
本發明是植物中菌根誘導表達的磷酸鹽轉運蛋白基因啟動子的順式調控元件，具 體要求涉及茄科作物中菌根誘導表達的磷酸鹽轉運蛋白基因的啟動子保守區域中的兩個 重要順式調控元件及其啟動子序列序列，屬于基因工程領域。
背景技術：
磷(P)是植物生長發育必需的大量營養元素之一，廣泛參與植物體內的生化合 成、能量轉移、信號轉導等代謝過程。磷在土壤中主要以無機磷酸鹽(Pi)的形態被植物吸 收利用。由于磷在土壤中容易被固定，使其成為世界范圍內有效性最差的營養元素之一 (Raghothama，1999)。植物在長期的進化中已形成對磷缺乏的適應機制，其中很廣譜且重 要的機制之一便是與土壤中的菌根(Mycorrhiza)真菌形成共生體系(Harrison，2006)。 植物通過在根系細胞膜上表達多種不同親和力的磷轉運蛋白來吸收和轉運土壤中的有效 磷。迄今為止，大多數被分離和鑒定的磷轉運蛋白都屬于高親和的Phtl家族。茄科作物 (Solanaceous species)是僅次于禾本科和豆科作物的世界第三大經濟作物。在部分茄科 作物中已經相繼克隆到了 5個Phtl家族的磷轉運蛋白基因，其中3個(Phtl ； 3-Phtl ；5)都 與菌根信號有關(Chen et al.，2007 ；Xu et al.，2007)。研究它們的功能特別是表達調控 模式對于提高作物對土壤中有限的有效磷資源的吸收能力及利用效率有著不可估量的意 義。雖然茄科作物中Phtl ；3-Phtl ；5基因的表達模式十分確定，而對于它們的受菌根 信號的調控方式及其上游轉錄因子還知之甚少。本發明從茄子和煙草中分離到了 Phtl ； 3-Phtl ；5基因的啟動子，并確定了其保守區域中能介導其菌根誘導表達模式的兩個順式 調控元件P1BS和MYCS，提出了利用P1BS和MYCS克隆菌根信號途徑中的轉錄因子繼而通過 其提高作物吸收、利用磷素營養能力的遺傳改良方法。
發明內容
技術問題本發明的目的在于公開茄科作物中Phtl ；3-Phtl ；5基因的啟動子保守區域中的 兩個順式調控元件及其啟動子序列，這兩個順式調控元件可作為酵母單雜交系統(Yeast one-hybrid system)中的誘餌(bait)，克隆到菌根信號途徑中的關鍵轉錄因子并繼而導入 植物，提高植物的磷素吸收利用能力，以進行植物品種改良。技術方案本發明是植物中菌根誘導表達的磷酸鹽轉運蛋白基因啟動子的順式調控元件包 括MYCS和P1BS，其特征序列如下MYCS :TKTCTTGTT
P1BS :GNATATNC其中K= G 或 T ;N = A 或 G 或 C 或 T。含有上述順式調控元件的茄子中菌根誘導表達的磷酸鹽轉運蛋白基因SmPT3的 啟動子，其序列為SEQ ID NO. 1。含有上述順式調控元件的茄子中菌根誘導表達的磷酸鹽轉運蛋白基因NtPT3的 啟動子，其序列為SEQ ID NO. 2。含有上述順式調控元件的茄子中菌根誘導表達的磷酸鹽轉運蛋白基因SmPT4的 啟動子，其序列為SEQ ID NO. 3。含有上述順式調控元件的茄子中菌根誘導表達的磷酸鹽轉運蛋白基因NtPT4的 啟動子，其序列為SEQ ID NO. 4。含有上述順式調控元件的茄子中菌根誘導表達的磷酸鹽轉運蛋白基因SmPT5的 啟動子，其序列為SEQ ID NO. 5。含有上述順式調控元件的茄子中菌根誘導表達的磷酸鹽轉運蛋白基因NtPT5的 啟動子，其序列為SEQ ID NO. 6。兩個對Phtl基因的菌根誘導表達模式起不可或缺作用的順式調控元件MYCS和 P1BS存在于上述啟動子序列中靠近ATG 200bp內為保守區域。有益效果1、本發明公開了茄科作物中Phtl ；3-Phtl ；5基因的啟動子及其保守區域中的 兩個順式調控元件，這兩個順式調控元件可作為酵母單雜交系統(Yeast one-hybrid system)中的誘餌(bait)克隆到菌根信號途徑中的關鍵轉錄因子并繼而倒入植物，提高植 物的磷素吸收利用能力，以進行植物品種改良。2、本發明人提供的MYCS和P1BS兩個順式調控元件參與植物對菌根信號的應答反 應，啟動子融合GUS報告基因表達分析表明MYCS和P1BS在缺磷且菌根真菌根內球囊霉菌 (Glomus intraradices)侵染的條件下對Phtl ；3-Phtl ；5的菌根誘導表達模式不可或缺。3、本發明的MYCS和P1BS順式調控元件來自茄科作物茄子和煙草，其在其它茄科 作物(番茄、土豆、辣椒等)，甚至是遠緣物種(如豆科植物苜蓿)的Phtl基因的啟動子中 也有分布，證明其可應用的廣譜性。
具體實施例方式(一 )茄子和煙草Phtl ；3-Phtl ；5基因啟動子序列的克隆將茄子(Solanum melongena) suqi 禾口煙草(Nicotiana tabacum) 86 (南京農旺豐 農貿有限責任公司)基因組DNA分別用限制性內切酶EcoRV、Dral和PvuII充分酶切，酶 切產物在T4DNA連接酶的介導下經自身環化后作為PCR擴增模板，在Phtl ；3，Phtl ；4及 Phtl ；5 基因(SmPhtl ；3 :EF091668 ；NtPhtl ；3 :EF091669 ；SmPhtl ；4 :EF091671 ；NtPhtl ； 4 :EF091672 ；SmPhtl ；5 :EF091674 ；NtPhtl ；5 :EF091675)的各自的編碼區設計反向 PCR (inverse PCR, iPCR)引物進行擴增。引物序列為SmPT3-iPCR-Fl :SEQ ID NO. 7，SmPT3_iPCR-Rl :SEQ ID NO. 8，SmPT3-iPCR-F2 :SEQ ID NO. 9，SmPT3_iPCR-R2 :SEQ ID NO. 10 ；NtPT3-iPCR-Fl :SEQ ID NO. 11，NtPT3_iPCR_Rl :SEQ ID NO. 12，
NtPT3--iPCR--F2:SEQIDNO.13，NtPT3--iPCR--R2:SEQIDNO.14
SmPT4--iPCR--F1:SEQIDNO.15，SmPT4--iPCR--R1:SEQIDNO.16，
SmPT4--iPCR--F2:SEQIDNO.17，SmPT4--iPCR--R2:SEQIDNO.18
NtPT4--iPCR--F1:SEQIDNO.19，NtPT4--iPCR--R1:SEQIDNO.20，
NtPT4--iPCR--F2:SEQIDNO.21，NtPT4--iPCR--R2:SEQIDNO.22
SmPT5--iPCR--F1:SEQIDNO.23，SmPT5--iPCR--R1:SEQIDNO.24，
SmPT5--iPCR--F2:SEQIDNO.25，SmPT5--iPCR--R2:SEQIDNO.26
NtPT5--iPCR--F1:SEQIDNO.27，NtPT5--iPCR--R1:SEQIDNO.28，
NtPT5--iPCR--F2:SEQIDNO.29，NtPT5--iPCR--R2:SEQIDNO.30 以SmPhtl ;4基因的啟動子分離為例，經過兩次巢式PCR (nested PCR)反應后 (上表引物F1和R1進行第一次PCR，以EcoRV酶切-連接產物為模版；然后用F2和R2為 引物，以第一次PCR產物為模板再進行第二次PCR)，第二次PCR產物中出現了約1200bp的 特異產物。PCR采用20微升體系10x Buffer :2ul ；2. 5mM dNTP 1. 6ul ；正向引物0. 8ul ；反向引物0. 8ul ；模板 2ul ；dH20 補足到 20ulPCR反應條件如下步驟一95 °C，4 分鐘；步驟二94°C，30 秒；55°C，30 秒；72°C，2 分鐘，步驟二循環 30 次；步驟三72°C，7分鐘步驟四4°C保溫將擴增條帶純化后連接到pMD19_T(日本TaKaRa公司)克隆載體，轉化大腸桿菌 DH5a (南京基天生物技術有限責任公司)，利用酶切和PCR鑒定陽性轉化子，測序。對測序 結果分析，發現該序列的3’端127個堿基與SmPhtl ；4基因cDNA的5'端序列完全一致， 說明擴增得到的產物包含了 SmPhtl ；4基因的啟動子。將序列兩端與基因編碼區重疊的部 分去除后我們得到了從翻譯起始位點ATG到上游-865bp的啟動子片段> pSmPT4。通過相同的方法，我們成功的從煙草和茄子基因組中分離到Phtl ；3-Phtl ；5共 6個基因的啟動子片段序列，SmPT3啟動子(SEQ ID NO. 1)，NtPT3啟動子(SEQ IDN0. 2)， SmPT4 啟動子(SEQ ID NO. 3)，NtPT4 啟動子(SEQ ID NO. 4)，SmPT5 啟動子(SEQ ID NO. 5) 及NtPT5啟動子序列(SEQ ID NO. 6)本發明的茄子和煙草Phtl ；3-Phtl ；5基因的啟動子序列為首次報道，有望應用于 植物尤其是雙子葉植物的磷素營養高效利用遺傳改良。( 二)茄子和煙草Phtl ；3-Phtl ；5基因啟動子序列的生物信息學分析茄子和煙草Phtl ;3_1 ;5啟動子的全長序列已于上述內容中給出。DNAMAN軟件 的分析結果表明，Phtl ；3、Phtl ；4和Phtl ；5啟動子在各自的直系同源基因(orthologous genes)之間分別存在著較為保守的區域，且該保守區域集中分布在靠近ATG的200bp以內。利用PLACE 程序(Higo et al.，1999 ；Xiao et al.，2006)對 Phtl ；3，Phtl ；4 及 Phtl ；5啟動子的順式元件進行分析。研究發現Phtl ；3，Phtl ；4及Phtl ；5啟動子都存在 P1BS(PHR1 Binding Sequence, GNATATNC)這一已知的與缺磷誘導表達有關的順式作用元 件，而其中PIBS除了在SmPht 1 ；5啟動子中存在兩個拷貝，在其它5個Pht 1基因的啟動子中均只含有1個拷貝，且都位于轉錄起始位點上游_160bp以內。此外通過序列比對分析，在六 個啟動子中轉錄起始位點上游200bp以內還發現了一個保守的基序元件(TTTCTTGT)，由于 在現有的數據庫中沒有找到相對應的基序，我們將之命名為MYCS(Ml￡orrhiza Sequence) 基序，該基序在茄子和煙草Phtl ；4啟動子中都存在著兩個拷貝。(三)含有P1BS和MYCS突變或敲除的Phtl；3-1 ；5啟動子融合⑶S報告基因的 轉基因煙草植株的獲得從茄子和煙草基因組中用重疊延伸PCR擴增分別獲得了 Phtl ；3-Phtl ；5的啟動 子序列及其內部突變或缺失P1BS和MYCS基序的擴增片段。將擴增產物先克隆到PMD19-T 載體，Hindlll和BamHI雙酶切后回收產物片段并定向替換pBI121表達載體的35S啟動子。 重組后的表達載體通過農桿菌介導轉化煙草。(四)Phtl；3-Phtl ；5的啟動子序列及其內部突變或缺失P1BS和MYCS的啟動子 片段在菌根侵染條件下驅動GUS基因表達活性的檢測如實施方式(三)中所述構建各轉基因植株，用提取煙草總DNA繼而PCR驗證方 法鑒定出陽性植株。用1ml根內球囊霉菌(Glomus intraradices)(加拿大PremierTech Biotechnologies公司)孢子懸液接種陽性植株，孢子懸液每毫升含400個孢子，采用低磷 處理(50PM Pi)接種后的陽性植株，6-7周后，即植物根系與菌根真菌形成穩定的共生體 系時，采取植株根系進行GUS染色鑒定。結果發現，完整的啟動子能夠導致GUS報告基因的 表達，即根系染色后，其部分皮層細胞(含有菌根菌共生的叢枝結構)呈現藍色；而突變或 缺失P1BS和MYCS的啟動子不能驅動⑶S報告基因的表達。結果表明，P1BS和MYCS對于 Phtl ；3-1 ；5的菌根誘導表達模式是極為重要且不可或缺的兩個正調控元件。
權利要求
植物中菌根誘導表達的磷酸鹽轉運蛋白基因啟動子的順式調控元件，包括MYCS和P1BS，其特征序列如下MYCSTKTCTTGTTP1BSGNATATNC其中K＝G或T；N＝A或G或C或T。
2.含有權利要求1所述順式調控元件的茄子中菌根誘導表達的磷酸鹽轉運蛋白基因 SmPT3的啟動子，其序列為SEQ ID NO. 1。
3.含有權利要求1所述順式調控元件的茄子中菌根誘導表達的磷酸鹽轉運蛋白基因 NtPT3的啟動子，其序列為SEQ ID NO. 2。
4.含有權利要求1所述順式調控元件的茄子中菌根誘導表達的磷酸鹽轉運蛋白基因 SmPT4的啟動子，其序列為SEQ ID NO. 3。
5.含有權利要求1所述順式調控元件的茄子中菌根誘導表達的磷酸鹽轉運蛋白基因 NtPT4的啟動子，其序列為SEQ ID NO. 4。
6.含有權利要求1所述順式調控元件的茄子中菌根誘導表達的磷酸鹽轉運蛋白基因 SmPT5的啟動子，其序列為SEQ ID NO. 5。
7.含有權利要求1所述順式調控元件的茄子中菌根誘導表達的磷酸鹽轉運蛋白基因 NtPT5的啟動子，其序列為SEQ ID NO. 6。
全文摘要
本發明首次公開了植物中菌根誘導表達的磷酸鹽轉運蛋白基因啟動子的順式調控元件，屬于基因工程領域。這兩個順式調控元件MYCS和P1BS介導了Pht1；3-5的菌根特異表達。對于后續工作中克隆菌根信號途徑中的關鍵轉錄因子基因，以及通過轉基因方法提高作物對土壤中有限的磷素營養的吸收能力及利用效率等奠定了基礎。
文檔編號C12N15/113GK101851623SQ201010156720
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月27日 優先權日2010年4月27日
發明者徐國華, 陳愛群, 顧冕 申請人:南京農業大學