專利名稱：糖基化血紅蛋白的選擇性測定方法
技術領域：
本發明涉及測定存在于全血中的血紅蛋白的糖基化量的方法。
背景技術：
血液中的糖基化血紅蛋白由于反映生物體內血糖值的過去的情況，因此被作為糖 尿病的診斷、治療等的重要指標。這類糖基化血紅蛋白通過例如高效液體色譜(HPLC)法、微型柱法、免疫法等，測 定血紅蛋白的糖基化量或糖基化率。最近，開發了可以通過采用糖基化氨基酸氧化還原酶 (FA0D)的酶法測定糖基化蛋白質的方法，嘗試應用該酶法進行血紅蛋白糖基化量(糖基化 血紅蛋白)的測定。發明的公開但是，該方法有如下問題糖基化血紅蛋白是血細胞內成分，因此測定時血細胞的 溶血處理是不可缺的。但是，在以全血為樣品的情況下，若以全血的狀態使血細胞溶血，則 血細胞成分與血漿成分呈混合狀態。因此，進行了溶血處理的全血樣品中，不只存在作為血 細胞中成分的糖基化血紅蛋白，特別是還存在作為血漿中成分的、含有率高的白蛋白，以及 其糖基化物糖基化白蛋白，這樣上述糖基化白蛋白也同樣受到FA0D的作用，與糖基化血紅 蛋白共同被測定。因而，為了消除上述糖基化白蛋白等其他糖蛋白的影響，無疑要從全血樣 品中分離血漿與血細胞，操作也很繁雜。因此，本發明的目的是提供可以不進行全血樣品的分離、不受其他糖蛋白的影響、 正確且容易地測定上述全血樣品中的血紅蛋白糖基化量的血紅蛋白糖基化量測定方法。為了達到上述目的，本發明的血紅蛋白糖基化量測定方法使用蛋白酶選擇性地將 全血中的糖基化血紅蛋白分解，使該糖基化血紅蛋白分解物的糖基化部分與FA0D反應，通 過測定該氧化還原反應來決定血紅蛋白的糖基化量。本發明中，“血紅蛋白糖基化量”也包 括血紅蛋白糖基化率。這樣，如果與其他蛋白質、肽區別開，只將糖基化血紅蛋白通過蛋白酶選擇性(特 異性)地分解，由于FA0D難以與蛋白質以及長的多肽鏈作用，因此無需對全血進行血細胞 分離操作，即可不受其他糖基化蛋白質、特別是糖基化白蛋白的影響，測定血紅蛋白糖基化 量。從而，測定樣品也可使用例如溶血處理過的全血樣品。在本發明的測定方法中，選擇性地分解糖基化血紅蛋白時，例如只要使用選擇性 地分解糖基化血紅蛋白的蛋白酶作為上述蛋白酶即可。本發明對于使用選擇性地分解糖基 化血紅蛋白的蛋白酶的方法并無特別限定，也可以通過其他手段選擇性地分解糖基化血紅 蛋白。另外，也可以將一般的蛋白酶與選擇性地分解糖基化血紅蛋白的蛋白酶并用。上述蛋白酶優選菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、來源于豬胰臟的胰蛋白酶、金屬蛋白酶、來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)的蛋白酶。上述來源于枯草芽孢桿菌的 蛋白酶有例如商品名口歹7 —七N( *夕‘“ 7 F 'J ,手社制造)、商品名口歹7 一^￡N“7 ■77”(天野->廿 ^ A (株)制造)等。上述金屬蛋白酶有來源于芽孢桿菌 (Bacillus)屬的金屬蛋白酶(EC3. 4. 24.4)(例如，東洋紡織(株)制造商品名卜3千一 K )等。其中更優選金屬蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶，特別優選金屬蛋白酶。本發明的測定方法中，優選上述FA0D是催化下述生成過氧化氫的反應的酶；所述 反應以選自糖基化蛋白質、糖基化肽以及糖基化氨基酸中的至少一種糖基化胺為底物，與 上述糖基化胺中的a"氨基糖基化部分和側鏈氨基糖基化部分的至少一方作用，生成過氧 化氫。本發明的測定方法中，與上述FA0D反應的糖基化血紅蛋白分解物的糖基化部分 因使用的FA0D的催化反應的不同而不同，但優選例如氨基酸殘基側鏈的糖基化氨基、糖基 化a -氨基。其中，因后面敘述的具有催化功能的FA0D容易作用，因此優選上述氨基酸殘基 側鏈的糖基化氨基，例如賴氨酸殘基側鏈的糖基化氨基、精氨酸殘基側鏈的糖基化氨基等。本發明的測定方法中，上述蛋白酶優選相對于1ml全血以1，000-10, 000, 000U的 范圍添加。另外，上述FA0D優選相對于1ml全血以500-40，000U的范圍添加。本發明的測定方法中，上述氧化還原反應的測定優選是對由上述反應生成的過氧 化氫量的測定，或者上述反應所消耗的氧氣量的測定。本發明的測定方法中，上述過氧化氫量的測定優選使用過氧化酶(以下稱為 “POD”)以及因氧化而發色的底物。本發明的測定方法中，作為上述因氧化而發色的底物，并無特別限定，有例如 N-(羧甲基氨基羰基)-4，4'-雙(二甲氨基)聯苯胺鈉、鄰苯二胺(0PD)、卜'J '一試劑 和4-氨基安替比林組合而成的底物。上述卜'J '一試劑有例如苯酚、苯酚衍生物、苯胺 衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。另外，除上述4-氨基安替比林之外，也可 以使用氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并 噻唑啉酮腙(SMBTH)等。在這樣的發色底物中，特別優選N-(羧甲基氨基羰基)-4，4'-雙 (二甲氨基)聯苯胺鈉。本發明的HbAlc的測定方法為以下測定方法根據上述本發明的血紅蛋白糖基化 量測定方法，準備由血紅蛋白糖基化量與HbAlc量的相互關系作成的校準曲線，將按照上 述本發明的血紅蛋白糖基化量測定方法得出的全血樣品中的血紅蛋白糖基化量代入上述 校準曲線，從而求出上述全血樣品中的HbAlc的量。本發明的發明者們進行了更深入的研究，結果發現根據上述本發明的血紅蛋白 糖基化量測定方法求得的全血樣品中的血紅蛋白糖基化量與上述全血樣品中的HbAlc的 量相互關系較大。HbAlc是指血紅蛋白的鏈N末端的a-氨基被糖基化的糖基化血紅 蛋白，在糖基化血紅蛋白中也被作為特別重要的糖尿病診斷等的指標。根據以往的方法， HbAlc的測定需要使FA0D與糖基化部分中HbAlc的特征性結構部位0 _鏈N末端的a -氨 基糖基化部分進行特異性作用，測定其氧化還原反應。這種情況下，要求使用的FA0D對于 例如a -氨基糖基化部位的底物特異性高，以及對上述a -氨基糖基化部位要充分作用等， 因此只好采取特別的方法。而根據本發明的HbAlc測定方法，則可以準確且簡單地測定作 為糖尿病診斷的重要指標的HbAlc，使HbAlc測定應用于臨床檢驗等成為可能。
本發明的HbAlc測定方法中，上述校準曲線優選是由標準樣品的已知HbAlc量與 根據上述本發明的血紅蛋白糖基化量測定方法測得的上述標準樣品的血紅蛋白糖基化量 之間的相互關系作出的校準曲線。本發明的測定試劑盒是血紅蛋白糖基化量的測定所使用的測定試劑盒，內含區別 于其他蛋白質以及肽、選擇性分解糖基化血紅蛋白的蛋白酶。使用該試劑盒，可以容易地實 施上述本發明的測定方法。優選本發明的測定試劑盒中的蛋白酶是選自菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、來源于豬 胰臟的胰蛋白酶、金屬蛋白酶、來源于枯草芽孢桿菌的蛋白酶中的至少一種蛋白酶。另外， 優選本發明的測定試劑盒還含有糖基化氨基酸氧化還原酶。優選上述糖基化氨基酸氧化還 原酶是催化下述生成過氧化氫的反應的酶，所述反應以選自糖基化蛋白質、糖基化肽以及 糖基化氨基酸中的至少一種糖基化胺為底物，與上述糖基化胺中的a-氨基糖基化部分以 及側鏈氨基糖基化部分的至少一方作用，生成過氧化氫。優選本發明的測定試劑盒還包含 過氧化酶以及因氧化而發色的底物。優選上述因氧化而發色的底物是n_(羧甲基氨基羰 基)_4，4_雙(二甲氨基)聯苯胺鈉。本發明的測定試劑是血紅蛋白糖基化量的測定所使用的測定試劑，內含區別于其 他蛋白質以及肽、選擇性地分解糖基化血紅蛋白的蛋白酶。使用該試劑，可以容易地實施上 述本發明的測定方法。優選本發明的測定試劑中的蛋白酶是選自菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、來源于豬胰 臟的胰蛋白酶、金屬蛋白酶、來源于枯草芽孢桿菌的蛋白酶中的至少一種蛋白酶。另外，優 選本發明的測定試劑中還含有糖基化氨基酸氧化還原酶。優選上述糖基化氨基酸氧化還原 酶是催化下述生成過氧化氫的反應的酶；所述反應以選自糖基化蛋白質、糖基化肽以及糖 基化氨基酸中的至少一種糖基化胺為底物，與上述糖基化胺中的a -氨基糖基化部分以及 側鏈氨基糖基化部分的至少一方作用，生成過氧化氫。優選本發明的測定試劑還包含過氧 化酶以及因氧化而發色的底物。優選上述因氧化而發色的底物是N-(羧甲基氨基羰基)_4， 4_雙(二甲氨基)聯苯胺鈉。附圖簡述
圖1是表示本發明測定方法的一個實施例中HbAlc濃度與吸光度的相互關系的 圖。圖2是表示本發明測定方法的其他實施例中從校準曲線求出的HbAlc(%)與用自 動測定儀器測定的HbAlc (%)的相互關系的圖。實施發明的最佳方式優選本發明的測定方法中可以使用的fa0d是催化下式⑴所示反應的fa0d。r1-co-ch2-nh-r2+o2— r1-co-cho+nh2-r2+h2o2... (1)上述式(1)中，r^co-ch^nh-r2為例如糖基化蛋白質、糖基化肽以及糖基化氨基 酸。上述式(1)中，r1表示羥基或來源于糖基化反應前的糖的殘基(糖殘基)。當糖基化 反應前的糖為醛糖時，上述糖殘基(r1)是醛糖殘基；當糖基化反應前的糖為酮糖時，則是酮 糖殘基。例如，糖基化反應前的糖為葡萄糖時，通過阿馬多利重排，糖基化反應后的結構為果糖結構，這種情況下，糖殘基(R1)成為葡萄糖殘基(醛糖殘基)。該糖殘基(R1)可以用 例如-[CH(0H)]n-CH20H表示，n為0-6的整數。上式(1)中，對R2并無特別限定，但a-氨基被糖基化的情況與a-氨基之外的 氨基被糖基化的情況不同。上式⑴中，a -氨基被糖基化時，R2為下式⑵所表示的氨基酸殘基或者肽殘基。-CHR3-C0-R4... (2)上式⑵中，R3表示氨基酸側鏈基，R4表示羥基、氨基酸殘基或肽殘基，例如，可以 用下式(3)表示。下式(3)中，n是至少為0的整數，R3與上述同樣，表示氨基酸側鏈基。-(NH-CR3H-C0)n-0H...(3)另外，上式(1)中，a-氨基以外的氨基被糖基化(氨基酸側鏈基被糖基化)時，
R2可以用下式⑷表示。 上式(4)中，R5表示氨基酸側鏈基中被糖基化的氨基以外的部分。例如，當被糖基 化的氨基酸為賴氨酸時，R5為-CH2-CH2-CH2-CH2-例如，當被糖基化的氨基酸為精氨酸時，R5為-CH2-CH2-CH2-NH-CH (NH2)-上式(4)中，R6為氫、氨基酸殘基或肽殘基，例如可用下式(5)表示。下式(5)中， n是至少為0的整數，R3與上述同樣，表示氨基酸側鏈基。-(C0-CR3H-NH)n-H...(5)上式(4)中，R7為羥基、氨基酸殘基或肽殘基，例如可用下式(6)表示。下式(6) 中，n是至少為0的整數，R3與上述同樣，表示氨基酸側鏈基。-(NH-CHR3-C0)n-0H...(6)只要使用的FA0D的催化反應是如上述的反應，則并無特別限定，但優選是作用于 糖和上式(1)中a-氨基以外的氨基結合的糖基化部位(上述R2為上式(4)中所表示的 結構)的催化反應。另外，上述FA0D不只限于這種催化功能，還可以同時具有作用于糖和 a-氨基結合的糖基化部位(上述R2為上式(2)中所表示的結構)的催化功能。這樣的FA0D有例如來源于鐮孢屬、赤霉屬、曲霉屬的，也可以使用市售的商品名 ””卜*卟 7 S 7酸才*夕 一七(旭化成社制造)、商品名夕卜7 S >才*夕 一七(夕工 4么社制造)等。下面，就本發明的血紅蛋白糖基化量測定方法的一個例子進行說明。首先，進行全血溶血。該溶血方法并無特別限定，可以使用例如使用表面活性劑的 方法、超聲波法、利用滲透壓差的方法等。其中，從操作簡便等理由來看，優選使用表面活性 劑的方法。上述表面活性劑可以使用例如聚氧乙烯-對-叔辛基苯基醚(Triton系表面活 性劑等)、聚氧乙烯脫水山梨醇烷基酯(Tween系表面活性劑等)、聚氧乙烯烷基醚(Brij 系表面活性劑等)等非離子表面活性劑。具體來說，有例如商品名TritonX-100、商品名 Tween-20、商品名Brij35等。上述表面活性劑的處理條件，通常在處理溶液中的血細胞濃 度為1-10%體積的情況下，添加上述表面活性劑，使上述處理溶液中的濃度為0. 1-1%重 量，在室溫下攪拌5秒-1分鐘左右即可。另外，在上述利用滲透壓差的情況下，例如相對于全血的體積，添加2-100倍體積 的精制水，使其溶血。接著，用上述蛋白酶對上述溶血樣品進行蛋白酶處理，選擇性地分解上述樣品中 的糖基化血紅蛋白。上述蛋白酶處理通常在緩沖液中進行，其處理條件根據例如使用的蛋 白酶的種類、糖基化血紅蛋白的量等適當決定。在使用木瓜蛋白酶作為上述蛋白酶，處理上述溶血樣品時，通常，反應液中的蛋白 酶濃度為100-30，000U/L、反應液中的血紅蛋白濃度為0. l_40g/L、反應溫度為15_60°C、反 應時間為10分鐘-40小時、pH值范圍為5-9。另外，上述緩沖液的種類也無特別限定，例 如可以使用Tris鹽酸緩沖液、EPPS緩沖液、PIPES緩沖液、磷酸緩沖液、ADA緩沖液、枸櫞 酸緩沖液、乙酸緩沖液等。另外，在使用金屬蛋白酶作為上述蛋白酶，處理上述溶血樣品時，例如可以使反應 液中的蛋白酶濃度為10-10，000KU/L、反應液中的血紅蛋白濃度為0. 02-40g/L、反應溫度 為15-60°C、反應時間為2分鐘-40小時、pH值范圍為6-11，優選反應液中的蛋白酶濃度為 100-8，000KU/L、反應液中的血紅蛋白濃度為0. l-10g/L、反應溫度為15_60°C、反應時間為 2分鐘-1小時、pH值范圍為7-10。上述緩沖液可以使用與上述同樣的緩沖液。另外，也可 同樣使用其他的蛋白酶。接著，將經過上述蛋白酶處理得到的糖基化血紅蛋白分解物用FA0D處理。通過該 FA0D處理催化以上式(1)所表示的反應。具體來說，FA0D作用于例如上述糖基化血紅蛋 白分解物的賴氨酸殘基側鏈以及精氨酸殘基側鏈的糖基化氨基。另外，根據FA0D種類的不 同，通過其催化功能，還可以作用于糖基化a-氨基。優選該FA0D處理與上述蛋白酶處理同樣在緩沖液中進行。上述緩沖液并無特別 限定，可以使用與上述蛋白酶處理相同的緩沖液。處理條件例如可以是反應液中的FA0D濃度為200-30，000U/L、反應液中的血紅蛋 白濃度為0. 02-30g/L、反應溫度為15-37°C、反應時間為1_20分鐘、pH值范圍為7-9 ；或者 是反應液中的FA0D濃度為1，000-20, 000U/L、反應液中的血紅蛋白濃度為0. l_5g/L、反應 溫度為15_37°C、反應時間為1-5分鐘、pH值范圍為7-9。接著，用由上述POD以及因氧化而發色的底物，利用氧化還原反應測定上述FA0D 處理產生的過氧化氫的量。
通過該POD的氧化還原反應通常在緩沖液中進行，其條件由例如過氧化氫濃度等 因素適當決定。通常，反應液中的POD濃度為1-100，000IU/L、底物濃度為0. 0001-lmmol/ L、反應溫度為20-37°C、反應時間為1-5分鐘、pH值為6-9，優選反應液中的POD濃度為 1，000-50，000IU/L、底物濃度為0. 0002-0. lmmol/L、反應溫度為20-37°C、反應時間為1-5 分鐘、PH值為6-9。另外，上述緩沖液并無特別限定，可以使用與上述FA0D處理等同樣的緩 沖液等。另外，除上述使用POD等的酶法外，也可以通過例如電氣方法測定上述過氧化氫量。在使用上述因氧化而發色的底物時，可以通過用分光光度計測定其發色(反應液 的吸光度)來測定過氧化氫的濃度，由此測定上述樣品中的血紅蛋白糖基化量。該測定的各處理步驟可以如上所述分別進行，也可以例如按如下所示的組合同時 進行。1 溶血處理+蛋白酶處理2 蛋白酶處理+FA0D處理3 :FA0D 處理 +P0D 處理另外，上述FA0D、P0D以及上述底物的添加順序也無特別限定。下面，就本發明的HbAlc的測定方法舉例進行說明。首先，與上述同樣測定全血樣品的血紅蛋白糖基化量。另一方面，準備糖基化血紅 蛋白中HbAlc量已知的糖基化血紅蛋白標準液，與上述同樣測定其血紅蛋白糖基化量，并 作出表示該標準液的測定值與已知HbAlc量之間關系的校準曲線。如上所述，上述血紅蛋 白糖基化量的測定值與HbAlc量存在相互關系，因此將根據本發明測定方法測定的上述全 血樣品中的血紅蛋白糖基化量值代入該校準曲線，可以求出上述全血樣品中的HbAlc量。 制作校準曲線時，作為上述血紅蛋白糖基化量的測定值，不僅可以是最終求出的血紅蛋白 糖基化量，也可以是上述血紅蛋白糖基化量測定中由P0D處理得到的反應液的吸光度值， 也可以使用由上述吸光度求出的過氧化氫量。這樣，根據本發明的HbAlc測定方法，發明者 們利用新發現的相互關系，可以由血紅蛋白糖基化量的測定值高精度且簡便地測定出全血 中的HbAlc量。實施例(實施例1)將含有糖基化血紅蛋白以及糖基化白蛋白的樣品用木瓜蛋白酶處理，再通過FA0D 進行氧化還原反應，對產生的過氧化氫進行測定。測定所使用的樣品、試劑以及方法如下所
示 o(樣品)糖基化率22. 5 %的人血清白蛋白(*夕‘7社制造)糖基化率14%的人血紅蛋白該人血紅蛋白樣品按照以下的方法進行配制，其糖基化率通過使用了離子交換柱 的HPLC法求得。(人血紅蛋白的配制)將健康者的全血進行離心分離(1500G、10分鐘)，回收血細胞，將其用生理鹽水清洗數次后，添加幾乎等量的精制水，使血細胞溶血。將該溶血溶液進行離心分離，除去血細 胞膜，之后加入到商品名GLYC0*GELII( ^r 7社制造)中，按照通常方法制備分離含有糖 基化蛋白的流分，將其作為人血紅蛋白樣品。(氧化還原反應液A的組成)FA0D (旭化成工業社制造，下同)2. 09KU/LP0D(TypeIII 東洋紡織社制造，下同)730U/LN-(羧甲基氨基羰基)-4，4-雙(二甲氨基)聯苯胺鈉(商品名DA64和光純藥工業社制造，下同)1. 46mmol/LTris-HCl 緩沖液(pH 8. 0)73mmol/L(方法)向1ml的上述各樣品(人血清白蛋白、人血紅蛋白)中添加1ml的1KU/L木瓜蛋 白酶、々“^ F 'J ,子社制造)，在40°C下反應24小時。向0. 018ml的這些溶液中 分別添加0.15ml上述氧化還原反應液A，開始氧化還原反應。用生化自動分析裝置(商品 名JCA-BM8 日本電子社制造，下同)測定反應開始5分鐘后各反應液在主波長694nm、副波 長884nm下的吸光度。結果示于下表1中。(實施例2)除用1ml的lg/L菠蘿蛋白酶(天野工巧^ △株式會社，下同)代替木瓜蛋白酶 之外，與實施例1同樣對上述各樣品(人血清白蛋白、人血紅蛋白)進行處理，測定吸光度。 結果示于下表1中。(比較例1)除用1ml的lg/La-胰凝乳蛋白酶代替木瓜蛋白酶之外，與上述實施例1同樣對 上述各樣品(人血清白蛋白、人血紅蛋白)進行處理，測定吸光度。結果示于下表1中。(表 1)蛋白酶人血清白蛋白人血紅蛋白(吸光度)(吸光度)_實施例1 木瓜蛋白酶0.014 0.090實施例2 菠蘿蛋白酶0.0008 0.037比較例1 a-胰凝乳蛋白酶 0.0630.042如上表1所示，由實施例1及2的木瓜蛋白酶及菠蘿蛋白酶在人血紅蛋白樣品中 可見較高的吸光度，并且，在人血清白蛋白樣品中只可見微弱的吸光度，因此得知這些蛋白 酶幾乎不分解糖基化白蛋白，而可以選擇性地分解糖基化血紅蛋白。而比較例1的a-胰 凝乳蛋白酶對于上述兩種樣品均可見同樣高的吸光度，可知其不只對糖基化血紅蛋白，對 糖基化白蛋白也發生作用，不具選擇性。(實施例3以及比較例2)分別以全血、血漿、血細胞作為樣品，用各種蛋白酶處理，進行糖基化血紅蛋白的 測定。(全血樣品的配制)用加入了肝素鈉的采血管從健康人體采集全血，向其中加入精制水稀釋8倍，將使上述全血中的血細胞溶血后的樣品作為全血樣品。(血漿樣品的配制)將上述健康者的全血進行離心分離(1500G、10分鐘)，分離除去血細胞，向得到的 上清液中添加精制水，稀釋8倍后作為血漿樣品。(血細胞樣品的配制)向由上述離心分離得到的血細胞中添加精制水，稀釋到16倍。將使上述血細胞中 溶血后的樣品作為血細胞樣品。(蛋白酶)將菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶(口 ？〉-社制造)、彈性蛋白酶(和光純藥工業社制 造)、a -胰凝乳蛋白酶(和光純藥工業社制造)、蛋白酶K(和光純藥工業社制造)溶解于 精制水中，分別配制為濃度4g/L的各種蛋白酶溶液。(氧化還原反應液B的組成)POD商品名DA64磷酸鉀緩沖液(pH 7. 0)(氧化還原反應液C的組成)FA0D磷酸鉀緩沖液(pH 7. 0)(測定方法)將0.2mL的上述各樣品、0. lmL上述蛋白酶溶液以及0.7mL磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)混合，使其在37°C反應24小時。反應后，將各反應液加入商品名々 > 卜，7 U —4 二 二 ？卜5K( S 'J f 7社制造)中進行離心分離，回收濾液。向25 yL的上述各濾液中添加 45uL上述氧化還原反應液B，5分鐘后再添加20 y L上述氧化還原反應液C，開始反應。用 上述生化自動分析裝置測定反應開始5分鐘后各反應液在主波長694nm、副波長884nm下 的吸光度。結果示于下表2中。其中，菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶為實施例3，彈性蛋白酶、 a -胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K為比較例2。(表 2)樣品
20KU/L 0. 04mmol/L 0. lmol/L
14. 3KU/L 0. lmol/L 如上表2所示，在實施例3中幾乎不能確認血漿樣品的吸收。由此可知，實施例3 使用的蛋白酶可以選擇性地分解糖基化血紅蛋白，幾乎不分解例如來源于血漿的糖基化白 蛋白等。而在比較例2中，確認在應該不存在糖基化血紅蛋白的血漿樣品也有吸收。認為 這是由于比較例使用的蛋白酶無選擇性地分解糖基化血紅蛋白和其他糖基化蛋白，例如血 漿樣品中的糖基化白蛋白等被分解，結果看到了吸收。(實施例4)(糖基化血紅蛋白標準液的配制)將HbAlc標準試劑(SRL社制造)溶解于精制水，配制HbAlc濃度分別為4. 3 %、 7.8%、11.2%、14. 7%且血紅蛋白濃度為10g/L的糖基化血紅蛋白標準液。另外，將HbAlc 標準試劑(國際試藥社制造)溶解于精制水，配制HbAlc濃度分別為5. 5%U0. 8%且血紅 蛋白濃度為10g/L的糖基化血紅蛋白標準液。(各種蛋白酶溶液的配制)將各種蛋白酶溶解于精制水，配制濃度2g/L的菠蘿蛋白酶F(天野工巧4 △株 式會社制造)溶液以及濃度lg/L的木瓜蛋白酶(口 ？〉-社制造)溶液。(測定方法)將0.5mL各濃度的糖基化血紅蛋白標準液、0.4mL蛋白酶溶液以及0. lmL的 l.Omol/L磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)混合，使其在37°C反應24小時。反應后，將上述反應液 加入商品名々斤卜，7 U — MC分子量5000 ( ^ 'J求7社制造，下同)中進行離心分離，回 收濾液。將25 y L上述濾液用精制水稀釋2倍后，向該稀釋液中添加45 y L上述氧化還原 反應液B，5分鐘后，再添加20 y L上述氧化還原反應液C，開始反應。之后用上述生化自動 分析裝置測定反應開始5分鐘后各反應液在主波長694nm、副波長884nm下的吸光度。結果 示于下表3及圖1中。(表 3)HbAlc (% )蛋白酶4.3 5.5 7.8 10.8 11.2 14.7_木瓜蛋白酶0.010 0.016 0.026 0.043 0.041 0.059
菠蘿蛋白酶0.002 0.004 0.005 0.014 0.008 0.010圖1表示糖基化血紅蛋白標準溶液中的HbAlc濃度與吸光度的相互關系。對于木 瓜蛋白酶的相關式是y = 210x+2. 2，其相關系數是r = 0. 998 ；對于菠蘿蛋白酶的相關式是 y = 1321x+1.0，其相關系數是 r = 0. 968。如上表3以及圖1所示，伴隨著糖基化血紅蛋白標準液中HbAlc濃度的增加，吸光 度也增加，由此得知HbAlc濃度與吸光度(相當于根據本發明的測定方法測得的糖基化血 紅蛋白的值)的相互關系較大。因而，如果事先準備好該HbAlc濃度與上述吸光度之間的 校準曲線，如上所述測定全血樣品中的糖基化血紅蛋白，則可以由該測定值與上述校準曲 線間接地求出全血樣品中的HbAlc量。(實施例5)將溶血樣品用金屬蛋白酶、木瓜蛋白酶、來源于枯草芽孢桿菌的蛋白酶進行處理， 根據本發明的測定方法測定血紅蛋白的糖基化量，再從中求出HbAlc量。測定中所用的樣 品、試劑以及方法如下所示。(樣品的配制)將采集的健康者以及糖尿病患者的全血(合計12份檢樣)分別靜置約6小時，使 紅細胞沉淀，向0. lmL這些血細胞部分中添加1. 4mL的0. 05%重量TritonX_100水溶液使 其溶血，以此作為溶血樣品。(標準液的配制)將HbAlc標準試劑(國際試藥社制造)溶解于0. 05%重量的TritonX-100水溶液 中，配制HbAlc濃度(％ )分別為5. 5%U0. 5%且血紅蛋白濃度為200g/L的糖基化血紅蛋 白標準液。(蛋白酶溶液的配制)將金屬蛋白酶(東洋紡織社制造)、商品名口歹7 —七N “7 7 7 ”(天野工> 〒^ △株式會社制造)以及木瓜蛋白酶(口 ) 二社制造)溶解于精制水中，配制成濃度lg/ L的各種蛋白酶溶液。(氧化還原反應液D)POD 20KU/L 商品名DA-640. 04mmol/L磷酸緩沖液(pH 8.0) 0. 8mol/L(氧化還原反應液E) FA0D 14. 3KU/L 磷酸鉀緩沖液(pH 8. 0) 0.lmmol/L(血紅蛋白糖基化量的測定方法)將0. 2mL樣品、0. 16mL蛋白酶溶液以及0. 04mL的0. lmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)混合，使其在37°C反應36小時。反應后，將上述反應液加入上述商品名々 > 卜，7 U 一 MC分子量5000中進行離心分離，回收濾液。將25 y L上述濾液用精制水稀釋2倍后，向 該稀釋液中添加45 y L氧化還原反應液D，5分鐘后添加20 y L氧化還原反應液E，開始反 應。測定反應開始2分鐘后反應液在主波長751nm、副波長884nm下的吸光度。該測定值即 為相當于血紅蛋白的糖基化量的吸光度。
(血紅蛋白濃度的測定方法)用商品名 *夕‘口 f >歹7卜7 - —(和光純藥工業社制造)，根據氰化正鐵血 紅蛋白法測定樣品的血紅蛋白濃度。(制作校準曲線)對于上述各標準液，用自動測定儀器(商品名HA_8150:7—夕> 4株式會社制 造)測定HbAlc濃度(％)。一方面，根據本發明的上述血紅蛋白糖基化量測定方法，測定 上述各標準液的相當于血紅蛋白糖基化量的吸光度，另一方面，根據上述血紅蛋白濃度測 定方法測定血紅蛋白濃度。然后，用相當于上述血紅蛋白糖基化量的吸光度除以血紅蛋白 濃度，由所得百分率(％ )和上述自動測定儀器得出的測定值(％ )作出一元回歸方程，以 此作為校準曲線。上述百分率與血紅蛋白的糖基化率(％)成比例。下面表示的是使用上 述各蛋白酶時校準曲線的方程。(校準曲線)
蛋白酶一元回歸方程 (HbAlc的測定方法)根據上述血紅蛋白糖基化率的測定方法測定上述各溶血樣品的相當于血紅蛋白 的糖基化量的吸光度，根據上述血紅蛋白濃度的測定方法測定血紅蛋白濃度。然后，將用相 當于上述糖基化量的吸光度除以上述血紅蛋白濃度所得的百分率作為血紅蛋白糖基化率， 通過將該百分率代入上述各校準曲線，求出上述樣品中的HbAlc量。另外，由上述自動測定 儀器測定上述各樣品的HbAlc量作為對照。將這些結果表示在圖2中。圖2表示根據本發 明的測定方法從校準曲線求出的HbAlc量與上述自動測定儀器測定的HbAlc量之間的相互 關系。由圖示可以看出根據本發明的測定方法從校準曲線求出的HbAlc(%)與上述自 動測定儀器測定的HbAlc )測定值之間的相關系數非常高，金屬蛋白酶為0. 9937、口 f 7 —SN為0. 993、木瓜蛋白酶為0. 9941，可以與上述自動測定儀器同樣的測定精度求出 HbAlc 量。(實施例6)將添加了血漿樣品的溶血樣品用金屬蛋白酶處理，測定血紅蛋白的糖基化量，來 研究添加上述血漿樣品而引起的上述糖基化量的變化。(樣品的配制)將采集的健康者(1份檢樣)以及糖尿病患者的全血(總檢樣患者檢樣、患者檢 樣2)離心分離(1000g、約15分鐘)，回收各檢樣的血細胞部分及血漿部分。然后，對每個 檢樣，向0. OlmL的血細胞部分中添加規定量(0mL、0. 005mL、0. 010mL、0. 015mL、0. 020mL)的 血漿部分，向該混合液中分別加入0. 3mL下述溶血試劑使其溶血，以此作為溶血樣品。然后，向0. OlmL上述各溶血樣品中加入0. 065mL下述金屬蛋白酶試劑，在37°C溫育5分鐘。再添加0. 045mL下述氧化還原反應液F，于37°C溫育2分鐘，之后測定上述反應 液在主波長751nm、副波長805nm下的吸光度。該測定值是相當于血紅蛋白的糖基化量的吸 光度。由于反應液量根據血漿部分添加量的不同而不同，將各反應液的經補正的吸光度表
示在下表4中。
(溶血試劑)
聚氧乙烯月桂基醚9g/L
CHES 緩沖液(pH9. 4)100mmol/L
(金屬蛋白酶試劑=PH5. 5)
金屬蛋白酶(東洋紡織社制造)4000KU/L
WST-3(同仁化學社制造)2mmol/L
MES5mmol/L
CaCl25mmol/L
NaCl50mmol/L
※WST-3 2- (4-碘苯基)-3- (2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)一鈉鹽
(氧化還原反應液F)
FA0D30KU/L
POD90KU/L
DA-640. 06mmol/L
磷酸緩沖液(PH7. 0)200mmol/L
(表4)
血漿部分添加量健康者檢樣糖尿病糖尿病
(mL)患者檢樣1患者檢樣2
0 0.02150.02830.0348
0.005 0.02160.02780. 343
0.010 0.01960.02830. 350
0.015 0.02040.02890. 354
0. 020 0. 02120. 02880. 359
0196]由上表4所示可以看出即使按各種濃度向血細胞部分添加血漿部分，所得到的吸 光度也幾乎不發生變化。由此可知，根據本發明的測定方法，則血漿中的糖基化蛋白對于糖 基化血紅蛋白的糖基化量的測定不產生影響。
0197]產業上的可利用性
0198]如上所述，按照本發明的測定方法，無需進行血細胞分離，即可簡便且高精度測定 全血樣品中的糖基化血紅蛋白的糖基化率。另外，由本發明的測定方法得到的血紅蛋白糖 基化量的測定值與HbAlc量之間存在大的相互關系，因此如果由該相互關系作出校準曲 線，則只需測定全血樣品中糖基化血紅蛋白的糖基化量，即可高精度且簡便地確定HbAlc 量。因而，如果將本發明的測定方法應用于例如臨床檢驗等領域，則可以容易地測定大量的 檢樣，進一步提高糖基化血紅蛋白，特別是HbAlc作為糖尿病診斷等的指標物質的可靠性以及重要性。
權利要求
選擇性地分解糖基化血紅蛋白的蛋白酶在制備通過用所述蛋白酶選擇性地分解全血中的糖基化血紅蛋白、使該糖基化血紅蛋白分解物的糖基化部分與糖基化氨基酸氧化還原酶反應、通過測定該氧化還原反應來測定血紅蛋白糖基化量的試劑盒中的用途，其中所述蛋白酶是選自菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和來源于豬胰臟的胰蛋白酶的至少一種蛋白酶。
2.選擇性地分解糖基化血紅蛋白的蛋白酶在制備通過用所述蛋白酶選擇性地分解經 溶血處理的全血中的糖基化血紅蛋白、使該糖基化血紅蛋白分解物的糖基化部分與糖基化 氨基酸氧化還原酶反應、通過測定該氧化還原反應來測定血紅蛋白糖基化量的試劑盒中的 用途，其中所述蛋白酶是選自菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和來源于豬胰臟的胰蛋白酶的至少 一種蛋白酶。
3.權利要求1或2的用途，其中所述與糖基化氨基酸氧化還原酶反應的糖基化血紅蛋 白分解物的糖基化部分是氨基酸殘基側鏈的糖基化氨基。
4.權利要求3的用途，其中所述氨基酸殘基側鏈的糖基化氨基是賴氨酸殘基以及精氨 酸殘基的至少一方的側鏈的糖基化氨基。
5.權利要求1或2的用途，其中所述氧化還原反應的測定是測定所述反應產生的過氧 化氫量，或測定所消耗的酶量。
6.權利要求5的用途，其中所述試劑盒還包含過氧化物酶和因氧化而發色的底物。
7.權利要求6的用途，其中所述因氧化而發色的底物是N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-雙 (二甲氨基)聯苯胺鈉。
8.權利要求1或2的用途，其中所述蛋白酶的用量為相對于lmL全血 1，000-10，000，000U。
9.權利要求1的用途，其中所述糖基化氨基酸氧化還原酶是以選自糖基化蛋白、糖基 化肽以及糖基化氨基酸的至少一種糖基化胺為底物，作用于所述糖基化胺的a-氨基糖基 化部分和側鏈氨基糖基化部分的至少一方，生成過氧化氫的反應的酶。
10.權利要求1或2的用途，其中所述糖基化氨基酸氧化還原酶的用量為相對于lmL全 血 500-40，OOOUo
11.選擇性地分解糖基化血紅蛋白的蛋白酶在制備通過用選擇性地分解糖基化血紅蛋 白的蛋白酶選擇性地分解糖基化血紅蛋白、使該糖基化血紅蛋白分解物的糖基化部分與糖 基化氨基酸氧化還原酶反應、通過測定該氧化還原反應所得的血紅蛋白糖基化量與HbAlc 量之間的相互關系作出的校準曲線來測定全血樣品中的HbAlc量的試劑盒中的用途，其中 所述蛋白酶是選自菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和來源于豬胰臟的胰蛋白酶的至少一種蛋白 酶。
12.權利要求11的用途，其中所述校準曲線是由標準樣品的已知HbAlc量與通過用選 擇性地分解糖基化血紅蛋白的蛋白酶選擇性地分解糖基化血紅蛋白所測定的所述標準樣 品的血紅蛋白糖基化量之間的相互關系作出的。
13.用于測定血紅蛋白糖基化量的測定試劑盒，它包含區別于其他蛋白和肽而選擇性 分解糖基化血紅蛋白的蛋白酶，其中所述蛋白酶是選自菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和來源于 豬胰臟的胰蛋白酶的至少一種蛋白酶。
14.用于測定經溶血處理的全血中的血紅蛋白糖基化量的測定試劑盒，它包含區別于 其他蛋白和肽而選擇性分解糖基化血紅蛋白的蛋白酶，其中所述蛋白酶是選自菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和來源于豬胰臟的胰蛋白酶的至少一種蛋白酶。
15.權利要求13或14的測定試劑盒，它還包含糖基化氨基酸氧化還原酶。
16.權利要求15的測定試劑盒，其中所述糖基化氨基酸氧化還原酶是以選自糖基化 蛋白、糖基化肽以及糖基化氨基酸的至少一種糖基化胺為底物，作用于所述糖基化胺的 a -氨基糖基化部分和側鏈氨基糖基化部分的至少一方，催化生成過氧化氫的反應的酶。
17.權利要求16的測定試劑盒，它還包含過氧化物酶和因氧化而發色的底物。
18.權利要求17的測定試劑盒，其中所述因氧化而發色的底物是N_(羧甲基氨基羰 基)_4，4_雙(二甲氨基)聯苯胺鈉。
19.用于測定血紅蛋白糖基化量的測定試劑，它包含區別于其他蛋白和肽而選擇性分 解糖基化血紅蛋白的蛋白酶，其中所述蛋白酶是選自菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和來源于豬 胰臟的胰蛋白酶的至少一種蛋白酶。
20.用于測定經溶血處理的全血中的血紅蛋白糖基化量的測定試劑，它包含區別于其 他蛋白和肽而選擇性分解糖基化血紅蛋白的蛋白酶，其中所述蛋白酶是選自菠蘿蛋白酶、 木瓜蛋白酶和來源于豬胰臟的胰蛋白酶的至少一種蛋白酶。
21.權利要求19或20的測定試劑，它還包含糖基化氨基酸氧化還原酶。
22.權利要求21的測定試劑，其中所述糖基化氨基酸氧化還原酶是以選自糖基化蛋 白、糖基化肽以及糖基化氨基酸的至少一種糖基化胺為底物，作用于所述糖基化氨基的 a -氨基糖基化部分和側鏈氨基糖基化部分的至少一方，催化生成過氧化氫的反應的酶。
23.權利要求22的測定試劑，它還包含過氧化物酶和因氧化而發色的底物。
24.權利要求23的測定試劑，其中所述因氧化而發色的底物是N-(羧甲基氨基羰 基)_4，4_雙(二甲氨基)聯苯胺鈉。
全文摘要
提供可以高精度且容易地測定樣品中的血紅蛋白的糖基化率的方法。用蛋白酶選擇性地分解全血樣品中的糖基化血紅蛋白，使該糖基化血紅蛋白分解物的糖基化部分與糖基化氨基酸氧化還原酶反應，通過測定該氧化還原反應可確定血紅蛋白的糖基化率。另外，如圖1所示，在全血樣品中，由該方法得出的糖基化血紅蛋白的測定值與HbAlc濃度之間存在相互關系，從而無需測定作為HbAlc的特征結構的α-氨基的糖基化部分，即可高精度且簡便地由糖基化血紅蛋白的測定值求出HbAlc量。
文檔編號C12Q1/28GK101875963SQ201010156399
公開日2010年11月3日 申請日期2001年7月12日 優先權日2000年7月14日
發明者米原聰 申請人:愛科來株式會社