大豆TLP蛋白編碼基因GmTLP1的抗病性基因工程應用的制作方法

專利名稱：大豆TLP蛋白編碼基因GmTLP1的抗病性基因工程應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及大豆TLP蛋白編碼基因GmTLPI的抗病性基因工程應用，屬于基因工程 領域，具體地講涉及植物病毒脅迫應答的第5類病程相關蛋白。
背景技術：
類甜蛋白最早是從非洲甜菊當中分離出來，后來在煙草、土豆、大麥、水稻上相繼 發現，研究表明它在離體條件下具有很強的抑菌抗菌活性(Ren et al.，2000)，將該蛋白導 入植物體內可明顯提高植物的抗病性，而且這類蛋白還對滲透脅迫產生反應(Ren etal., 2005)。許多類甜味蛋白基因已經被分離，并轉化到了土豆，水稻，小麥和其它作物中。土 豆中，轉基因株系提高了對土豆晚疫病的抗性，表現為轉基因株系發病時間晚l-2d，病斑 從接種點蔓延較慢，多數葉片上接種點病斑不擴散，葉片仍為綠色，嫩葉表現尤為突出(金 紅等，2001)。水稻中，轉基因株系提高了對水稻紋枯病的抗性，表現為接種Rhizoctonia solani Kuhn兩周后，T1和T2代轉基因植株的受害面積均明顯小于非轉基因植株(Datta et al.，1999)。小麥中，轉基因株系提高了對小麥白粉病的抗性，表現為T1和T2代轉基 因植株推遲了病斑的發展，并且減輕了白粉病癥狀(XING et al.，2008)。其它作物如西紅 柿(Radhajeyalakshmi et al.，2005)、雜草(Fu et al.，2005)也有類似的報道。本研究從大豆品種科豐1號中利用SMV誘導的雙向電泳技術分離克隆了類甜味蛋 白編碼基因GmTLPI，并研究了其與SMV脅迫的關系，提出了利用GmTLPI基因進行植物提高 綜合抗病性的基因工程改良方法。

發明內容
技術問題本發明的目的在于公開一個大豆TLP蛋白編碼基因GmTLPI的抗病性基因工程應 用，該基因可作為目的基因導入植物，提高植物的綜合抗病性，以進行植物品種改良。技術方案大豆TLP基因GmTLPI，其序列為SEQ ID NO. 2。其基因工程應用，包括1)大豆TLP蛋白編碼基因GmTLPI的克隆通過研究SMV誘導后的蛋白質差異表達圖譜，分析鑒定出一個甜味蛋白，在大豆 序列數據庫中進行搜索，得到大豆TLP基因的全長序列，設計兩端引物，引物序列見SEQ ID NO. 4 和 SEQ ID NO. 5。以大豆(Glycine max)葉片的總RNA為模板，經反轉錄合成cDNA后，進行PCR擴 增，PCR程序如下94°C預變性5分鐘，94°C變性30秒，60°C復性50秒，72°C延伸1分鐘，共 35個循環，72°C保溫10分鐘，隨后12°C恒溫，將PCR產物克隆至pMD18_T載體，測序后獲得 具有完整編碼區的1021bp大小的大豆TLP基因的cDNA序列，見SEQ ID NO. 1，其中編碼區 序列見SEQ ID NO. 2，命名為GmTLPI,由669bp組成； 2)植物表達載體的構建
將GmTLPl基因與試劑盒中的pdonr vector載體進行BP反應，并進行菌液PCR測 序驗證，PCR引物見SEQ ID N0.8和SEQ ID NO. 9，PCR程序同步驟1)，獲得入門克隆(entry clone)；將得到的入門克隆與目的表達載體(destination vector)pMDC83進行重組反應， 得到35S-GmTLPl-pMDC83植物過量表達載體，然后采用凍融法將35S_GmTLPl-pMDC83轉入 根癌農桿菌菌株EHA105中。3)轉基因植株的獲得將步驟2)獲得的表達載體，通過根癌農桿菌介導的煙草葉盤轉化法轉入煙草，對 獲得的轉基因植株進行PCR，引物和具體的PCR過程與步驟1)相同，實時熒光定量PCR引物 序列見 SEQ ID NO. 6 和 SEQ ID NO. 7，Southern blot 分析引物序列見 SEQID NO. 10 和 SEQ ID NO. 11驗證后進行植物的抗病性評價在直徑為15cm的培養皿中，先用含終濃度為50y g/ml篩選抗生素Hgy的1/2MS 生根培養基培養，待野生型未轉基因煙草(C)及代轉基因株系萌發生長成小苗后(約兩 周)，將它們移栽至帶有營養土的花盆中，用保鮮膜封口保濕，待小苗長到頂住保鮮膜后揭 開保鮮膜，讓其自由生長。待長到具有四出復葉時，在第二出復葉上接種煙草花葉病毒，每 株接半片葉子，為避免磨擦接種時力度不一致造成的誤差，接種時輕輕涂抹均勻即可。轉基 因植株出現病斑比野生型未轉基因煙草C早14h，葉片枯斑損失面積達到葉片面積一半時 相對C早20h以上。有益效果GmTLPl基因功能是參與植物的病毒脅迫應答反應，實時熒光定量聚合酶鏈式反 應(Quantitative RT-PCR)分析表明GmTLPl基因在大豆花葉病毒(SMV)脅迫誘導條件下 表達增強，進一步的過表達轉GmTLPl基因煙草與野生型未轉基因煙草(C)相比，過表達轉 GmTLPl基因植株出現病斑比C早14h，葉片枯斑損失面積達到葉片面積一半時相對C早20h 以上，表明GmTLPl基因在植物細胞膜表達后，通過提高病毒復制速度使受病毒侵染的植物 細胞快速凋亡，從而抑制病毒在植物體內進一步擴展，提高植物對病毒的抗性。本發明的 GmTLPl可作為目的基因導入植物，提高植物抗病性，以進行植物品種改良，所編碼的蛋白質 具有抗病功能。使用GmTLPl構建植物表達載體時，可在其轉錄起始核苷酸前加上任何一種增強 型啟動子或誘導型啟動子。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用 植物表達載體進行加工，如在植物中加入選擇性標記基因(GUS基因、螢光素酶基因等)。從 轉基因植物的安全性角度考慮，可不加任何選擇性標記基因，而通過逆境篩選轉化植株。攜帶有本發明GmTLPl的植物表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載 體、DNA直接轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并 將轉化的植物組織培育成植株。被轉化的植物宿主既可以是高粱、水稻、小麥、玉米等單子 葉植物，也可以是花生、大豆、油菜、番茄、楊樹、草坪草、苜蓿等雙子葉植物。下面結合附圖及實施例對本發明做進一步說明。


圖lGmTLPl在大豆不同組織和病毒脅迫誘導下的表達分析A. 1.根，2.莖，3.幼葉，4.莢；B大豆花葉病毒(SMV)脅迫處理0、2、4、8、12、24、48h時在mRNA水平的實時熒光定量PCR表達分析圖2Tq代轉基因植株的qPCR鑒定以轉基因煙草植株L-8，L-17, L_18，L_33，L_49_l，L_49_2，L_1和野生型未轉基因 煙草植株C的cDNA作為模板，以煙草的actin作為內標，進行實時熒光定量PCR分析。圖3轉GmTLPl陽性株系L_17，L_18，L_19，L_49和野生型未轉基因煙草C接種TMV 后Oh的癥狀圖4過表達轉GmTLPl陽性株系L_17，L_18，L_49和野生型未轉基因煙草C接種 TMV后50h的癥狀圖5過表達轉GmTLPl陽性株系L_17，L_18，L_19，L_49和野生型未轉基因煙草C 接種TMV后54h的癥狀
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明，均為常規方法。1)大豆TLP蛋白編碼基因GmTLPl的克隆以大豆品種科豐1號為材料，已報道的大豆TLP蛋白序列(P21，登陸號 gi 1129320)為種子序列，采用生物信息學的方法，搜索大豆的cDNA數據庫，找到一條高度 同源的cDNA片段。設計引物，引物序列見SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5。取大豆的嫩葉，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振蕩后，移至 1. 5mL EP管中，抽提總RNA(TRIzol Reagents，Invitrogen，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定 總RNA質量，分光光度計測定RNA含量。以獲得的總RNA為模板，按照美國Promega公司提 供的反轉錄試劑盒的說明書進行反轉錄，得到cDNA第一鏈后，進行PCR擴增，PCR程序如下 PCR程序如下94°C預變性5分鐘，94°C變性30秒，60°C復性50秒，72°C延伸1分鐘，共35 個循環，隨后72°C保溫10分鐘，最后12°C恒溫。隨后進行PCR產物割膠純化、連接及轉化 工作，挑取陽性單克隆測序。測序后獲得具有完整編碼區的1021bp大小的大豆TLP基因的 cDNA序列，見SEQ ID NO. 1，其中編碼區序列見SEQ ID NO. 2，命名為GmTLPl，由669bp組 成；2)GmTLPl在大豆不同組織和病毒脅迫誘導下的表達分析自然短日照后取根、莖、嫩葉和莢，液氮速凍后于_80°C保存。將培養的大豆品種科 豐1號，進行大豆花葉病毒脅迫處理，取樣時間分別為處理后0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h， 液氮速凍后于-80°C保存。總RNA的提取同步驟1)。以大豆組成型表達的Actin基因(GenBank accessionNo. V00450)為內部參照，以來自栽培大豆品種科豐1號不同組織的總RNA為模板，進行定量反 轉錄聚合酶鏈式反應(Real-time RT-PCR)，引物和具體的PCR過程與步驟1)相同。RT-PCR 分析表明GmTLPl在根、莖、葉和莢中都表達，只是在莢中表達量相對較弱。采用qPCR(實時 熒光定量PCR)引物序列見SEQ ID NO. 6和SEQ IDN0. 7分析了 GmTLPl在SMV脅迫條件下的 表達情況，在4h、8h、24h、48h時，GmTLPl基因在轉錄水平上的表達量明顯上升，說明GmTLPl 基因對SMV的脅迫有應答，應答的模式為雙峰模式。3) GmTLPl的亞細胞定位研究設計包含GmTLPl基因完整0RF的引物(不包含終止密碼子)，引物序列見SEQIDNO. 8和SEQ ID NO. 9，通過RT-PCR的方法從大豆科豐1號嫩葉的cDNA中分離出GmTLPl 基因，全長為730bp，但是不包含終止密碼子，具體的PCR過程與步驟1)相同。。然后跟 據Invitrogen公司Gateway試劑盒的操作說明進行BP和LR反應，將不包含終止密碼子 的GmTLPl基因完整的0RF插入到Invitrogen公司開發的表達載體pMDC83中，這樣就 把GmTLPl基因完整的0RF與表達載體pMDC83上的報告基因GFP的3，端融合，形成一個 35S-GmTLPl-GFP的嵌合基因，構建了植物過量表達表達載體35S-GmTLPl_GFP-pMDC83。將 其和空載體分別通過凍融法轉化根癌農桿菌EHA105，然后通過農桿菌介導法轉化洋蔥表皮 細胞，結果GmTLPl基因定位在細胞膜上。4)基因GmTLPl的基因工程應用將步驟3)獲得的植物過量表達表達載體35S-GmTLPl_pMDC83，通過根癌農桿菌 EHA105介導葉盤轉化法轉入煙草，對獲得的轉基因植株進行PCR，引物和具體的PCR過程與 步驟1)相同，實時熒光定量PCR(qPCR)引物序列見SEQ ID NO. 6和SEQID NO. 7, Southern blot分析引物序列見SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 11驗證后進行植物的抗病性評價在直徑為15cm的培養皿中，先用含終濃度為50 u g/ml篩選抗生素Hgy的1/2MS 生根培養基培養，待野生型未轉基因煙草(C)及代轉基因株系萌發生長成小苗后(約兩 周)，將它們移栽至帶有營養土的花盆中，用保鮮膜封口保濕，待小苗長到頂住保鮮膜后揭 開保鮮膜，讓其自由生長。待長到具有四出復葉時，在第二出復葉上接種煙草花葉病毒，每 株接半片葉子，為避免磨擦接種時力度不一致造成的誤差，接種時輕輕涂抹均勻即可。接種 TMV36h后，GmTLPl基因過表達轉基因株系開始出現病斑，此時未轉基因煙草C未出現病斑， 隨著接種TMV時間的延長，C也開始出現病斑，但GmTLPl基因過表達轉基因株系病斑面積 相對C擴展更快，接種TMV48h后，部分轉基因株系已經開始枯萎，而C只是病斑面積擴大， 并未出現枯萎現象，即過表達轉GmTLPl基因植株出現病斑比未轉基因煙草C早14h，葉片枯 斑損失面積達到葉片面積一半時相對C快至少20h以上(圖3、4、5)。
權利要求
大豆TLP蛋白編碼基因GmTLP1，其序列為SEQ ID NO.2。
2.權利要求所述大豆TLP蛋白編碼基因GmTLPl的基因工程應用，包括；1)大豆TLP蛋白編碼基因GmTLPl的克隆以大豆(Glycine max)品種科豐1號葉片的總RNA為模板，經反轉錄合成cDNA第一鏈 后，進行PCR擴增，引物序列見SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5，PCR程序如下94°C預變性5 分鐘，94°C變性3秒，60°C復性50秒，72°C延伸1分鐘，共35個循環，最后72°C保溫10分 鐘，隨后12°C恒溫，將PCR產物克隆至pMD18-T載體，測序后獲得具有完整編碼區的1021bp 大小的大豆TLP基因的cDNA序列，見SEQ ID NO. 1，其中編碼區序列見SEQ ID NO. 2，命名 為 GmTLPl,由 669bp 組成；2)植物表達載體的構建將 GmTLPl 基因序列與 Invitrogen 公司的Gateway Technology with Clonase II 試 劑盒中的pdonr vector載體進行BP反應，并進行菌液PCR測序驗證，引物序列見SEQ ID N0.8和SEQ ID NO. 9，具體的PCR過程與步驟1)相同，獲得入門克隆；將得到的入門克隆與 Invitrogen公司開發的目的表達載體pMDC83進行重組交換，得到35S-GmTLPl-pMDC83植物 過量表達表達載體，PMDC83載體自身帶有GFP報告基因，然后通過凍融法將載體轉入根癌 農桿菌菌株EHA105中；3)轉基因植株的獲得將步驟2)獲得的含35S-GmTLPl-pMDC83載體的根癌農桿菌菌株EHA105通過葉盤轉化 法轉入煙草，對獲得的轉基因植株進行PCR，引物和具體的PCR過程與步驟1)相同，實時熒 光定量qPCR引物序列見SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7, Southern blot分析引物序列見SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 11驗證后進行植物的抗病性評價在直徑為15cm的培養皿中，先用含終濃度為50 u g/ml篩選抗生素Hgy的1/2MS生根培 養基培養，待野生型未轉基因煙草C及代轉基因株系萌發生長兩周成小苗后，將它們移 栽至帶有營養土的花盆中，用保鮮膜封口保濕，待小苗長到頂住保鮮膜后揭開保鮮膜，讓其 自由生長，待長到具有四出復葉時，在第二出復葉上接種煙草花葉病毒，每株接半片葉子， 出現病斑比野生型未轉基因煙草C早14h，葉片枯斑損失面積達到葉片面積一半時相對C早 20h以上的植株即為獲得的過表達轉GmTLPl基因植株。
全文摘要
本發明公開了大TLP蛋白編碼基因GmTLP1的抗病性基因工程應用，屬于生物技術領域。GmTLP1是定位于細胞膜上的類甜味蛋白，mRNA表達分析表明該基因為組成性表達，只是莢中表達量相對低一些，并且GmTLP1的表達受大豆花葉病毒(SMV)脅迫的誘導。將構建的植物過量表達載體35S-GmTLP1-pMDC83轉化煙草獲得過量表達GmTLP1的轉基因煙草，并且得到mRNA高水平表達，過表達轉GmTLP1基因植株出現病斑比野生型未轉基因煙草早14h，葉片枯斑損失面積達到葉片面積一半時相對對照早20h以上，表明該基因可作為目的基因反義導入植物，提高轉基因植物的綜合抗病性。
文檔編號C12N15/82GK101857869SQ201010156250
公開日2010年10月13日 申請日期2010年4月23日 優先權日2010年4月23日
發明者喻德躍, 楊華, 黃燕平 申請人:南京農業大學