專利名稱：納米復合探針及其用于基因芯片膜轉印的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種納米復合探針及其用于基因芯片膜轉印的檢測方法，可以應用于生物學及醫學領域。
背景技術：
基因芯片技術是上世紀90年代初發展起來的一種全新的生物微量分析技術。目 前通用的基因芯片技術，且多采用熒光素為信號報告分子，難以臨床推廣。2001年的發明專 禾Ij“一種基因芯片的膜轉印檢測法及其應用”(ZL01113298. 1)雖提供了一種簡單快速、低成 本的基因芯片檢測技術，該技術采用裸眼或者普通的光學掃描儀分析記錄實驗結果，擺脫 了基因芯片技術對昂貴的熒光檢測設備的依賴，為基因芯片的推廣應用起到了巨大的推動 作用。但是，檢測靈敏度不夠高，生物樣品DNA需經PCR擴增以后方能檢測，由此帶來的樣 品污染等問題一直未能解決。近年隨著納米科學技術的不斷發展，納米材料和納米結構取得了引人矚目的成 就，各種不同的納米功能材料不斷涌現，比如各種納米顆粒(納米磁珠、納米金粒子)、納米 管、納米棒、納米絲和納米薄膜等。納米材料具有傳統材料所不具備的三大效應表面效應、 小尺寸效應和宏觀量子隧道效應。使得納米粒子在生物、醫學方面的應用越來越廣泛。各種 納米信號分子，包括量子點、各種熒光微球、納米金或者基于各種納米粒子的納米探針等， 由于其信號強度可以達到傳統熒光信號或者幾倍甚至幾十倍，成為較熒光分子更為理想的 生物標記材料。從而，本發明試圖將納米技術引入膜轉印檢測法中，用納米顆粒同時標記檢 測探針，不需要擴增即可通過普通光學掃描儀或肉眼直接判讀信號有無成為可能。
發明內容
本發明的目的在于建立一種納米復合探針及其用于基因芯片膜轉印的檢測方法， 通過納米復合探針的信號放大作用，進一步提高基因芯片膜轉印檢測法的靈敏度。本發明的主要內容包括結構獨特的納米復合探針的構建以及其在基因芯片膜轉 印檢測技術中的應用。所敘述的納米復合探針為通過一定比例的，三種探針標記的直徑 5 50nm的納米粒子。具體關鍵技術如下1、納米復合探針的構建用納米顆粒同時標記檢測探針P2和兩種長短不同的信號探針，檢測探針與靶DNA 一端互補，兩種帶有生物素的信號探針起信號放大作用。檢測探針及信號探針的一端根據 納米顆粒表面的活性基團進行不同的修飾。采用納米金顆粒，則表面進行巰基(-SH)修飾， 如果為羧基修飾的納米顆粒表面則進行氨基修飾等等。信號探針的另一端進行生物素修 飾。為了降低空間位阻以實現最大的雜交效率及親和素_生物素反應效率，三條探針 的長度應該為DP2彡SPl > SP2，且SPl堿基長度比SP2長IOmer以上。DP2、SP1、SP2以一定的比例混合，檢測探針與信號探針的比例[DP2 (SP1+SP2)]可根據納米粒子才尺寸來調整，對于常用的10-30nm納米粒子，其比例在1 5 1 30 之間效果最佳。SPl與SP2的比例亦在1 5 1 30之間，1 10效果最佳。(圖la)三種長度的探針以一定的比例混合，共同標記納米顆粒，所形成的空間立體結構可以大大降低雜交及生物素-鏈親和素反應的空間位阻，提高檢測的靈敏度。2、雜交及顯色雜交時，將制備好的納米復合探針與靶DNA混合，與芯片雜交(也可分步雜交，靶 DNA先與芯片雜交，然后再加入納米復合探針，中間無需洗滌)，然后加入鏈親和素_堿性磷 酸酶反應，最后膜轉印法顯色。，鏈親和素-堿性磷酸酶也可以事前標記到包括納米金在內的納米顆粒上，這樣做 要求DP2探針長度要長。膜轉印檢測法的信號檢測原理是基于堿性磷酸酶的顯色反應。本發明擬通 過信號探針的標記將生物素分子結合到包括納米金在內的納米顆粒表面，但是由于 SA-AP (Str印tavidin-AP-conjugate)的尺寸效應大大限制了同一平面上生物素分子的利 用率。本發明是采用長短不同的兩種信號探針同時對包括納米金在內的納米顆粒進行標 記，從空間三維立體上降低了 SA-AP與生物素反應過程中由SA-AP的尺寸效應所帶來的空 間位阻的影響，因此可以有效的增加檢測信號強度。總之，本發明提供了一種用于基因芯片膜轉印檢測法的納米復合探針檢測方法及 應用。本發明旨在用納米顆粒同時標記檢測探針DP2和兩種長短不同的信號探針(SP1、 SP2)，檢測探針與靶DNA—端互補，兩種帶有生物素標記的信號探針起信號放大作用。當 靶DNA存在時，芯片上捕捉探針Pl (與靶DNA的另一端互補)通過堿基互補配對原則結合 靶DNA分子，將靶DNA分子固定于芯片上，包括納米金顆粒在內的納米復合探針通過檢測探 針與靶DNA分子結合，在芯片上形成“三明治”結構(Pl-靶、DNA-納米復合探針)，利用鏈 霉親和素_生物素反應，使芯片上對應有靶DNA分子的部位結合上堿性磷酸酶，通過BCIP/ NBT顯色系統使芯片表面的結果鏡面轉印到尼龍膜上(圖lb)，檢測結果通過普通的光學掃 描儀讀取或肉眼直接判讀信號有無。本發明所涉及的基于納米復合探針的基因芯片膜轉印檢測法，與常規基因芯片檢 測技術相比，有以下優勢[1]基于納米復合探針的信號放大作用，使檢測的靈敏度大大提高；[2]避免常規檢測方法中熒光檢測技術所需的特殊、昂貴的檢測設備，易于推廣。
圖1 :a.納米金復合探針標記過程示意圖b.靶DNA檢測過程示意圖；圖2 標記DNA探針前后的納米金TEM圖和紫外-可見光光譜掃描圖；圖3:基因芯片點樣模式；圖4:納米金復合探針檢測不同濃度合成靶DNA芯片轉膜顯色圖；其中， (a) l(T10mol/L ； (b) 10_11mol/L ； (c) l(T12mol/L ； (d) l(T13mol/L ； (e)0mol/L ；圖5 :PCR擴增產物電泳圖；圖6:納米金復合探針檢測不同濃度PCR擴增產物芯片轉膜顯色圖；其中， (a) 2. 3X l(rumol/L ； (b) 2. 3X l(T12mol/L ； (c) 2. 3X l(T13mol/L ； (d) 2. 3X l(T14mol/L ；(e)Omol ；圖7 納米金復合探針檢測不同濃度合成靶DNA芯片轉膜顯色圖；其中， (a) l(T10mol/L ； (b) 10_11mol/L ； (c) l(T12mol/L ； (d) l(T13mol/L ； (e)0mol/L。
具體實施例方式下面用具體的實施例來解釋本發明的突出的特點和顯著進步，但本發明決非僅局 限于實施例。實施例1 基于納米金復合探針的基因芯片膜轉印法檢測合成靶DNA分子本實施例是當納米金上的檢測探針和總信號探針數量比為1 10，兩種信號探針 TlO和T40的數量比為9 1時的結果。1芯片制備芯片點樣儀將氨基修飾探針(表1P1、P3、P4)點陣于醛基化修飾芯片表面，點直徑 100 μ m,點間距500 μ m,點樣量為0. 7nL, DNA探針濃度為75 μ mol/L，用點樣儀分別取三種 探針溶液點于芯片相應位置(見圖3)。點陣好的芯片置于相對濕度為75%、溫度為30°C的 密閉空間固定24 48小時。如表1所示，所需探針序列均由TakaRa公司合成。表1核酸探針序列表
Name Probe sequences Synthesized target DNA 5' -ggccgtatctcagtccagacatgcatcccgtg-3' Detecting probe (P2, thiol-modified) 5' -ggactgagatacggcc-poly(t)28-SH-3' Signal probe 1 (T10, thiol and biotin-modified) 5，-SH-poly(t)40 -Biotin-3' Signal probe 2 (T40, thiol and biotin-modified) 5'-SH-poly(t),0-Biotin-3' Capture probe (PI, amino-modified) 5'-NH2-poly(t)i0-cacgggatgcatgtct-3' Negative control probe (P3, amino-modified) 5'-NH2-poly(t)10- cacgggaagcatgtct-3' Anchor point probea (P4，amino-modified)_5'-NH2-poly(t)10- ggccgtatctcagtcc-3，_a Anchor point probe is complementary sequence of detecting probe.2納米金復合探針制備2. 1納米金顆粒的制備配制lnmol/L的HAuC14、38. 8mmol/L檸檬酸三鈉溶液。按預先設計的反應條件 量取250ml HAuC14加熱回流IOmin并攪拌，快速加入檸檬酸三鈉溶液25ml，溶液顏色由淺 黃迅速變為深紅時，再持續加熱回流15min并攪拌，待溶液自然冷卻至室溫(持續攪拌)， 用0. 22 μ m硝酸纖維薄膜過濾器過濾，即可得到尺寸為13nm的納米金溶液，4°C避光保存備用。2. 2納米金復合探針標記納米金顆粒表面標記有三種巰基修飾的DNA探針兩種是帶有生物素的信號探針 (T10、T40)，起信號放大作用；第三種是能與靶DNA分子另一端互補的檢測探針(Ρ2)。納米金復合探針的標記方法取濃度為12. 5nmol/L的13nm納米金溶液Iml于EP管中，離心洗滌，沉淀用100 μ 1 0. lmol/L PB (0.01% SDS, ΡΗ7. 2)重懸；向重懸液中加入 100 μ mol/L的DNA探針4 μ 1 (Ρ2、Τ10、Τ40按一定比例混合，使探針終濃度為4 μ mol/L)， 充分混勻，用5M NaCl調NaCl濃度至0. 1M，超聲處理IOs后；放置25°C雜交儀中孵育過夜 (6rpm)，然后加入1/10體積5% PEG (分子量為2000)，4°C過夜。用膠體金重懸液洗滌4次， 棄上清，加100 μ 1膠體金重懸液重懸，4°C儲存備用。用紫外_可見光光譜儀測其吸光光譜 及OD值；用透射電鏡掃描DNA探針標記前后的納米金。3芯片雜交及轉膜顯色
檢測過程1 μ 1合成靶DNA與9 μ 1雜交液混勻，均勻滴于芯片點陣區，蓋上蓋玻 片，置35°C預熱的雜交盒中雜交30min，洗液I (0. 2X SSC, 0. 1 % SDS)洗滌芯片2min，氮氣吹 干。2 μ 1納米金復合探針溶液與8 μ 1雜交液混勻，均勻滴于晾干芯片的點陣區，35°C雜交， 30min，洗液I洗滌芯片5min，氮氣吹干。向點陣區加Str印tavidin-AP-con jugate (SA-AP) 稀釋液(用封阻液稀釋500倍)15 μ 1，室溫反應30min，洗液II (0. 05MTris_HCl，0. 15M NaCl,0. 3% tween-20, PH7. 5)洗滌芯片 5min，然后用平衡液(0. IM NaCl,0. 05M MgCl2, 0. IMTris-HCl PH9. 5)平衡lmin，氮氣吹干。用尼龍膜蘸取BCIP/NBT顯色液后覆蓋于芯片 點樣區，室溫避光放置30min，純化水洗滌尼龍膜，根據信號有無肉眼判讀結果(見圖4)。本 方法可以檢測lpmol/L的合成靶DNA分子。實施例2 基于納米金復合探針的基因芯片膜轉印檢測法檢測結核分枝桿菌PCR 產物1結核分枝桿菌16SrDNA基因保守區擴增PCR采用50μ1擴增體系，共3管。結核分枝桿菌基因組DNA樣品2 μ 1與 48 μ IPCR擴增體系混合(擴增體系包括10XPCR反應緩沖液，25mM MgCl2，650 μ MdNTP，各 0. 5 μ M的上游及下游引物，2U Taq DNA聚合酶)進行PCR擴增，PCR擴增條件94°C 5min， 30 X (94 °C 30s, 60 °C 30s, 72 °C 30s),72°C 5min。擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。在紫 外光照射下可見一條長度約200bp的dsDNA條帶(見圖5)。將三管PCR產物混合，取50 μ 1 用QIAquick PCRpurification kit純化，純化產物用純化水定容至500 μ 1，用紫外-可見 光光譜儀測其濃度為2. 85ng/ μ 1，并根據QIAquick PCR purification kit對PCR產物的 回收效率為95%，計算出原PCR產物濃度為30ng/μ 1。根據PCR產物長度(200bp)、堿基對 平均分子量(649)，計算得出PCR擴增產物的摩爾濃度約為0. 23 μ mol/L。2納米金探針制備與實施例1同。3芯片雜交及轉膜顯色檢測過程1 μ IPCR產物與9μ 1雜交液混勻，均勻滴于芯片點陣區，蓋上蓋玻 片，置35°C預熱的雜交盒中雜交30min，Wash buffer I (0. 2X SSC，0. 1 % SDS)洗滌芯 片2min，氮氣吹干。2μ 1納米金復合探針溶液與8 μ 1雜交液混勻，均勻滴于晾干芯 片的點陣區，35°C雜交，30min，Wash buffer I洗滌芯片5min，氮氣吹干。向點陣區加 Str印tavidin-AP-con jugate (SA-AP)稀釋液(用封阻液稀釋500倍)15 μ 1，室溫反應 30min, Wash buffer 11(0. 05MTris-HCl, 0. 15M NaCl，0· 3 % tween-20，ΡΗ7· 5)洗滌芯片 5min，然后用平衡液(0. IM NaCl，0. 05M MgC12，0. IMTris-HCl PH9. 5)平衡 lmin，氮氣吹干。 用尼龍膜蘸取BCIP/NBT顯色液后覆蓋于芯片點樣區，室溫避光放置30min，純化水洗滌尼龍膜，根據信號有無肉眼判讀結果(見圖6)。本方法可以檢測0. 23pmol/L的結核分枝桿菌 16srRNA PCR擴增產物。若對納米金復合探針的化學組成及立體空間結構進行進一步的研究與優化，可以 進一步提高核酸檢測的靈敏度。這種檢測方法簡便快速，無需特殊儀器，在生物分子的檢測 方面具有較高的應用價值。實施例3 基于納米硅珠復合探針的基因芯片膜轉印法檢測合成靶DNA分子本實施例是當納米硅珠上的檢測探針和總信號探針數量比為1 10，兩種信號探 針TlO和T40的數量比為9 1時的結果。1芯片制備與實施例一同。表2核酸探針序列表
NameProbe sequences
Synthesized target DNA5' -ggccgtatctcagtccagacatgcatcccgtg-3'
Detecting probe (P2, amino-modified)5' -ggactgagatacggcc-poly(t)28- NH2-3'
Signal probe 1 (T10, amino and biotin-modified) 5'- NH2-poly(t)40 -Biotin-3' Signal probe 2(T40, amino and biotin-modified) 5'- NH2-poly(t)10-Biotin-3， Capture probe (PI, amino-modified)5'-NH2-poly(t)i0-cacgggatgcatgtct-3'
Negative control probe (P3, amino-modified) 5'-NH2-poly(t)io- cacgggaagcatgtct-3' Anchor point probe3 (P4, amino-modified) 5，-NH2-poly(t)10-ggccgtatctcagtcc-3，a Anchor point probe is complementary sequence of detecting probe.2納米硅復合探針制備納米硅顆粒(IOnm)為羧基(-C00H)修飾，表面標記有三種氨基修飾的DNA探針 兩種是帶有生物素的信號探針(T10、T40)，起信號放大作用；第三種是能與靶DNA分子另一 端互補的檢測探針(Ρ2)。納米硅復合探針的標記方法用Iml 0. IM MES (ρΗ5. 0)洗滌納米硅顆粒(9000rpm，45min)，2次。第二次洗滌完 畢用 100 μ 1 0. IM MES (ρΗ5. 0)懸浮硅珠。將 IOmg EDC 溶解于 100 μ 10. IM MES (ρΗ5. 0)中， 加入上述硅珠懸液，室溫輕搖孵育IOmin ；用Iml 0. IM MES (ρΗ5. 0)洗滌硅珠 2 次(9000rpm，5min)，用 100 μ 1 0. IMMES (ρΗ5. 0)懸浮磁珠，加入400pmol核酸(P2、T10、T40按一定比例混合，溶于MES中)， 室溫輕搖孵育2h ；用Iml PBS洗滌3次(9000rpm，5min)，用Tris-HCl緩沖液(含0. 1 % BSA,0. 05% Sodium azid)懸浮，4°C儲存備用。3芯片雜交及轉膜顯色檢測過程1 μ 1合成靶DNA與9 μ 1雜交液混勻，均勻滴于芯片點陣區，蓋上蓋玻 片，置35°C預熱的雜交盒中雜交30min，洗液I (0. 2X SSC, 0. 1 % SDS)洗滌芯片2min，氮氣吹 干。2μ 1納米硅復合探針溶液與8μ 1雜交液混勻，均勻滴于晾干芯片的點陣區，35°C雜交， 30min，洗液I洗滌芯片5min，氮氣吹干。向點陣區加Str印tavidin-AP-con jugate (SA-AP) 稀釋液(用封阻液稀釋500倍)15μ 1，室溫反應30min，洗液11(0. 05MTris-HCl，0. 15MNaCl,0. 3% tween-20, PH7. 5)洗滌芯片 5min，然后用平衡液(0. IM NaCl，0.05M MgCl2, 0.IMTris-HCl PH9. 5)平衡lmin，氮氣吹干。用尼龍膜蘸取BCIP/NBT顯色液后覆蓋于芯片 點樣區，室溫避光放置30min，純化水洗滌尼龍膜，根據信號有無肉眼判讀結果(見圖7)。本 方法可以檢測lpmol/L的合成靶DNA分子。
權利要求
一種用于基因芯片膜轉印檢測法的復合探針，其特征在于所述的納米復合探針為三種探針共同標記的納米顆粒，其中所述的三種探針分別為檢測探針DP2和兩種長短不同的信號探針SP1和SP2，三種探針的長度DP2≥SP1＞SP2，且SP1堿基長度比SP2長10mer以上；DP2、SP1和SP2混合的比例為DP2/(SP1+SP2)＝1∶5-1∶30，其中SP1與SP2的比例在1∶5-1∶30之間。
2.按權利要求1所述的納米復合探針，其特征在于所述的三條探針共同標記納米顆粒 所形成的空間立體結構降低雜交及生物素——鍵親和素反應的空間位阻，從而提高檢測靈 敏度。
3.按權利要求1所述的納米復合探針，其特征在于SPl和SP2的比例為1 10。
4.按權利要求1所述的納米復合探針，其特征在于檢測探針DP2與靶DNA—端互補，兩 種帶有生物素標記的信號探針起信號放大作用。
5.按權利要求1所述的納米復合探針，其特征在于檢測探針的一端根據納米顆粒表面 的活性基團進行不同的修飾；所述的納米顆粒為5-50nm。
6.按權利要求5所述的納米復合探針，其特征在于納米金顆粒進行疏基修飾；羧基修 飾的納米顆粒表面進行氨基修飾。
7.基于權利要求1-6中任一項所述的納米復合探針用于基因芯片膜轉印的檢測方法， 其特征在于將納米復合探針與靶DNA混合，與芯片雜交，然后加入鏈柔和素-堿性磷酸酶反 應，最后膜轉印法顯色；具體步驟是當靶DNA存在時，芯片上與靶DNA的另一端互補的捕捉 探針Pl通過堿基互補配對原則結合靶DNA分子，將靶DNA分子固定于芯片上，包括納米金 顆粒在內的納米復合探針通過檢測探針與靶DNA分子結合，在芯片上形成Pl-靶DNA-納米 復合探針的“三明治”結構，利用鏈霉親和素_生物素反應，使芯片上對應有靶DNA分子的 部位結合上堿性磷酸酶，通過BCIP/NBT顯色系統使芯片表面的結果鏡面轉印到尼龍膜上， 檢測結果通過普通的光學掃描儀讀取或肉眼直接判讀信號。
8.按權利要求7所述的檢測方法，其特征在于芯片雜交為分步雜交，靶DNA先與芯片雜 交，然后再加入納米復合探針，中間無需洗滌。
9.按權利要求1所述的納米復合探針的應用，其特征在于所述的納米復合探針用于檢 測合成靶DNA分子或檢測結核分枝桿菌PCR產物。
10.按權利要求9所述的納米復合探針的應用，其特征在于①基于納米金復合探針的基因芯片膜轉印法檢測合成靶DNA分子時可檢測lpmol/L的 合成靶DNA分子；②基于納米金復合探針的基因芯片膜轉印法檢測結核分枝桿菌時可檢測0.23pmol/L 的結核分枝桿菌16srRNA PCR擴增產物；③基于納米硅珠復合探針的基因芯片膜轉印法檢測DNA分子時可檢測到lpmol/L的合 成靶DNA分子。
全文摘要
本發明涉及一種納米復合探針及其在基因芯片膜轉印的檢測方法，其特征在于所述的納米復合探針為三條探針共同標記的納米顆粒，其中所述的三種探針分別為檢測探針DP2和兩種長短不同的信號探針SP1和SP2，三種探針的長度DP2≥SP1＞SP2，且SP1堿基長度比SP2長10mer以上；DP2、SP1和SP2混合的比例為DP2/(SP1+SP2)＝1∶5-1∶30，其中SP1與SP2的比例在1∶5-1∶30之間。所述的三條探針共同標記納米顆粒所形成的空間立體結構降低雜交及生物素——鍵親和素反應的空間位阻，提高檢測靈敏度。采用雜交和顯色的方法用于檢測合成靶DNA分子和結核分枝桿菌，具有靈敏度高和探眼可分辨的特點。
文檔編號C12R1/32GK101812529SQ20101015601
公開日2010年8月25日 申請日期2010年4月23日 優先權日2010年4月23日
發明者景奉香, 李海燕, 賈春平, 趙建龍, 金慶輝 申請人:中國科學院上海微系統與信息技術研究所