專利名稱：誘導提高生防酵母對果實病害防治效力方法及所用培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及的是果實采后病害防治技術領域。
背景技術：
傳統上，國內外對果實采后病害的控制主要依賴于殺菌劑。但是，隨著人們對食 品安全和環境保護意識的不斷增強，化學殺菌劑的使用范圍和劑量受到了越來越嚴格的限 制。在歐美發達國家，許多高效但存在食品安全和環境污染隱患的化學殺菌劑被禁止使用。 因此，研究、開發能替代化學殺菌劑的方法和技術具有重大的社會意義和廣闊的應用前景。在眾多被研究的可能替代化學殺菌劑的方法中，利用拮抗微生物，特別是拮抗酵 母抑制采后果實病害的生物防治技術是當前國內外最為關注的新型采后病害控制方法之 一(Droby等，2009)。這主要是由于酵母具有遺傳穩定、抑菌譜廣、效價高、一般不產生對 人和寄主植物有害的代謝產物、安全性高等特點；且其對營養要求低，生長快；并有對多種 脅迫、逆境具有較強的耐受力，對大多數殺菌劑不敏感，并能與多種其它化學和物理處理相 容。但目前國內外已報道，甚至已商業化開發的拮抗酵母對果實病害的控制效力與化 學殺菌劑相比還存在差距(Droby等，2009)。而且由于國內外研究的果實病害生防酵母均 為非模式酵母，其遺傳背景信息大多不明確，對其生防生理代謝的研究也尚少，嚴重限制了 定向提高果實生防酵母活性技術的發展。幾丁質，又稱甲殼素，廣泛分布于蝦蟹殼、軟體動物的外殼與內骨骼，節肢動物的 外骨骼及真菌、酵母菌等微生物細胞壁中。幾丁質不僅資源豐富，而且具有多種重要的生物 學特性，因此幾丁質的開發利用深受國內外的關注。一般認為，細菌細胞壁主要由肽聚糖等 成分組成，絲狀真菌細胞壁的主要成分是幾丁質，而酵母細胞壁的主要是由葡聚糖(約 占細胞壁干重35-60% )和幾丁質(約占細胞壁干重1. 5-6% )等成分組成。中國發明專利(專利號03135134. 4，一種防治植物寄生線蟲的生防制劑)顯示與 含有幾丁質等成分的物質混合后，能提高中華輪枝菌對防治植物寄生線蟲的效果。中國發 明專利(專利號ZL200410075042.8，海洋小單孢菌抗菌活性物質發酵促進劑)將幾丁質作 為用于海洋小單孢菌(一種放線菌)抗菌活性物質發酵促進劑，可提高對枯草芽孢桿菌和 念珠菌的抗菌效價。中國發明專利(專利號200510039128. X，一種抗灰霉病的生物殺菌劑 及其制備方法)通過含幾丁質等培養基培養木霉菌，可防治植物的灰霉病。此外，中國國家 發明申請號=200710057189. 8 (—種利用表面活性劑提高綠色木霉生防活性的方法)公開 了一種利用表面活性劑提高綠色木霉生防活性的方法。該方法在綠色木霉孢子培養后，與 含有幾丁質等物質混和，可以提高對蔬菜灰霉病、白粉病等的防治效果，提高綠色木霉在植 株的定殖能力。中國國家發明申請號=200710300087. 4 (—種防治煙草黑脛病的菌株及其 菌劑)公開了一種以0.8 2.0%膠體幾丁質為碳源培養淡紫擬青霉的方法，通過該方法可 提高其對煙草黑脛病的防治能力。此外，中國發明專利(專利號ZL200510090063. 1，一種酵 母拮抗菌的培養方法及其專用培養基)還公開了一種羅倫隱球酵母的培養基配方，該培養
3基由檸檬酸、大豆蛋白胨、硫酸錳、氯化鈣和水組成。但是，目前還沒有專門用于誘導提高生防酵母對果實病害防治效力的培養基。參考文獻Droby S. , ffisniewski M. , Macarisin D. , Wilson C. 2009. Twenty years of postharvestbiocontrol research :Is it time for a new paradigm ？ Postharvest Biology and Technology 52:137-145.(爵勞比等，2009，20年采后生物防治研究采后生 物學和技術，52 :137-145.)。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種誘導提高生防酵母對果實病害防治效力的 培養基，以及利用該培養基進行的誘導提高生防酵母對果實病害防治效力的方法。為了解決上述技術問題，本發明提供一種誘導提高生防酵母對果實病害防治效力 的培養基，包括活化培養基和種子培養基；活化培養基為牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖2 30g、瓊脂20g和幾丁質1 50g，水定容至1000ml，高壓滅菌后得NYCA活化培養基；種子培養基為牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖2 30g和幾丁質1 50g (較優 為1 20g)，水定容至1000ml，高壓滅菌后得NYCB種子培養基。本發明還同時提供了利用上述培養基進行的誘導提高生防酵母對果實病害防 治效力的方法，生防酵母為羅倫隱球酵母，其保藏名稱為羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)ZJU 10，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地 址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；保藏日期2010年1月 20日，保藏號CGMCC NO. 3590 ；依次進行以下步驟1)、活化:①、羅倫隱球酵母CGMCC N0. 3590在NYCA活化培養基中25 28 °C培養46 50 小時，然后在相同條件下重復傳代培養2次；②、將上述重復傳代培養2次所得的活化好的酵母用接種環接到NYCB種子培養基 中，于150 200rpm、25 28°C的條件下培養22 26小時；然后在上述相同條件下重復 培養1次；2)、液體培養將步驟1)活化所得的酵母按照5%重量比的接種量接到NYCB種子培養基中，于 150 200rpm、25 28°C的條件下培養24 144小時。作為本發明的誘導提高生防酵母對果實病害防治效力的方法的改進將步驟2) 液體培養后的所得物依次進行以下步驟離心分離將步驟2)液體培養后的所得物在3000rpm離心10分鐘，并用滅菌蒸餾水洗以去 除培養介質；懸浮和確定濃度用無菌蒸餾水重新懸浮酵母細胞，并用無菌蒸餾水調整到細胞濃度為1 X 106細胞 /毫升 1X109細胞/毫升。
本發明利用幾丁質作為拮抗酵母活性激發子，從而來誘導培養獲得對果實病害控 制更高活性的方法。利用本發明的培養基對羅倫隱球酵母CGMCC NO. 3590進行培養，所得 酵母細胞具有更好的對果實進行防腐保鮮的效果。本發明所得的濃度為1乂106細胞/毫 升 1 X 109細胞/毫升的懸浮酵母細胞能作為果實生物保鮮劑，將上述果實生物保鮮劑對 采前果實進行表面噴灑(果實表面潤濕即可)或采后浸泡1-5分鐘的方法，可防治青霉病 等；果實包括蘋果、梨和桃等等。綜上所述，采用本發明所提供的拮抗酵母誘導培養方法，能有效激發拮抗酵母的 活性，具有促進拮抗酵母在果實內生長繁殖，增強抑菌物質分泌和病原菌水解酶活性等作 用，從而顯著抑制果實病害的發生和發展。本發明具有安全高效、環境友好，病害防治效果 突出等優點。本發明的使用有利于轉變長期以來依賴化學殺菌劑為主的果實真菌病害控制 方法，對確保食品安全、環境保護和農業增效、農民增收和經濟社會可持續的發展等具有重 要意義。
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1是幾丁質對羅倫隱球酵母在液體培養基中生長的影響對比圖；圖中(a)為在NYDB或在不同幾丁質含量的NYCB中培養的對比圖；(b)為在不同葡萄糖濃度的NYCB中培養的對比圖；圖2是幾丁質培養后羅倫隱球酵母在梨果實體內的生長動態對比圖；圖中6-D代表NYDB培養基培養的原始接入濃度為106個細胞
浮液，6-C代表NYCB培養基培養的原始接入濃度為106個細胞 浮液，7-D代表NYDB培養基培養的原始接入濃度為107個細胞
浮液，7-C代表NYCB培養基培養的原始接入濃度為107個細胞 浮液，8-D代表NYDB培養基培養的原始接入濃度為108個細胞 浮液，8-C代表NYCB培養基培養的原始接入濃度為108個細胞浮液。圖3是幾丁質培養后羅倫隱球酵母在蘋果果實體內的生長動態對比圖；圖4是幾丁質培養后的羅倫隱球酵母對蘋果誘導抗性的增強效應對比圖；圖中7-D代表NYDB培養基培養的原始接入濃度為107個細胞/毫升的C. laurentii懸 浮液，7-C代表NYCB培養基培養的原始接入濃度為107個細胞/毫升的C. laurentii懸 浮液，
/毫升的C. laurentii懸 /毫升的C. laurentii懸 /毫升的C. laurentii懸 /毫升的C. laurentii懸 /毫升的C. laurentii懸 /毫升的C. laurentii懸
8-D代表NYDB培養基培養的原始接入濃度為108個細胞/毫升的C. laurentii懸 浮液，8-C代表NYCB培養基培養的原始接入濃度為108個細胞/毫升的C. laurentii懸 浮液，9-D代表NYDB培養基培養的原始接入濃度為109個細胞/毫升的C. laurentii懸 浮液，9-C代表NYCB培養基培養的原始接入濃度為109個細胞/毫升的C. laurentii懸 浮液；圖5是不同濃度幾丁質培養基對羅倫隱球酵母幾丁質酶和0 -1，3-葡聚糖酶活性 的影響對比圖；圖中，(a)為不同濃度幾丁質培養基對羅倫隱球酵母幾丁質酶活性的影響對比 圖；(b)為不同濃度幾丁質培養基對0 -1,3-葡聚糖酶活性的影響對比圖。
具體實施例方式
下面詳細說明本發明的具體實施例。實施例1、一、培養基的配置NYCA活化培養基將牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g、瓊脂20g和幾丁質5g， 水定容至1000ml，高壓滅菌(121°C，30分鐘)后得NYCA活化培養基；NYCB種子培養基將牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g和幾丁質5g，水定容至 1000ml，高壓滅菌(121°C，30分鐘)后得NYCB種子培養基。二、菌種活化和制備1)、活化①、選用于低溫(4°C)下保存在NYCA活化培養基中的羅倫隱球酵母CGMCC NO. 3590 ；將上述羅倫隱球酵母CGMCC NO. 3590在NYCA活化培養基中28°C培養48小時，然 后在相同條件下重復傳代培養2次(每次均為在NYCA活化培養基基中28°C培養48小時)。②、將上述重復傳代培養2次所得的活化好的酵母用接種環接到NYCB種子培養基 中，于200rpm、28°C的條件下培養24小時；然后在上述相同條件下重復培養1次，即將NYCB種子培養基中培養而得的酵母再 次用接種環接到NYCB種子培養基中，于200rpm、28°C條件下培養24小時。2)、液體培養將步驟1)活化所得的酵母按照5%重量比的接種量接到NYCB種子培養基中(即 酵母與NYCB種子培養基的重量比為5% )，于200rpm、28°C的條件下培養24小時。3)、離心分離將步驟2)液體培養后的所得物在3000rpm條件下離心10分鐘，并用滅菌蒸餾水 洗2次，以去除培養介質；4)、懸浮和確定濃度
用無菌蒸餾水重新懸浮酵母細胞，用血球記數板的方法確定酵母的濃度，并用無 菌蒸餾水調整到濃度為1 x 106細胞/毫升 1 X 109細胞/毫升；得C. laurentii懸浮液。實施例2、將NYCB種子培養基中幾丁質的重量由5g改成10g，其余同實施例1。實施例3、將NYCB種子培養基中幾丁質的重量由5g改成20g，其余同實施例1。實驗1、對果實的生防實驗實驗1.1、對梨的生防實驗以相同品種及成熟度的梨果實作為實驗對象，用消過毒的打孔器在每個果實表面 形成統一大小和深度的傷口。實驗組1 實驗組5、對比組1 對比組3以及空白對照組均為先加入30 yl不同的試劑，加入試劑2小時后在每個傷口加入等量(30 yl)的 P. expansum孢子懸浮液，濃度為1 X 104SpOreS/ml。處理完畢后在常溫下(20-25°C )貯藏， 并用PE塑料膜密封作保濕處理。每天定時對果實傷口處病害發生和發展情況進行觀察和 記錄，結果以平均病害發生率(％ )和平均病斑直徑(mm)表示。每處理重復4次，每個重復 24個果實。整個實驗重復2次以上。每個傷口處加入的30 U 1試劑具體如下實驗組1、果實傷口處加入30 iU實施例1所得的濃度為 C. laurentii懸浮液(NYCB種子培養基中幾丁質濃度為0. 5% )；實驗組2、果實傷口處加入30 yl實施例2所得的濃度為 C. laurentii懸浮液(NYCB種子培養基中幾丁質濃度為)；實驗組3、果實傷口處加入30 yl實施例3所得的濃度為 C. laurentii懸浮液(NYCB種子培養基中幾丁質濃度為2% )；實驗組4、果實傷口處加入30 ill實施例2所得的濃度為 C. laurentii懸浮液(NYCB種子培養基中幾丁質濃度為)；實驗組5、果實傷口處加入30 ill實施例2所得的濃度為 C. laurentii懸浮液(NYCB種子培養基中幾丁質濃度為)；對比實驗以NYDA活化培養基替代NYCA活化培養基，以NYDB種子培養基替代NYCB種子培 養基，其余均同實施例1，得對比例。NYDA活化培養基將牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g和瓊脂20g，水定容至 1000ml，高壓滅菌(121°C，30分鐘)后所得NYDA活化培養基。NYDB種子培養基將牛肉浸膏8g、酵母粉5g和葡萄糖10g，水定容至1000ml，高壓 滅菌(12rc，30分鐘)后所得NYDB種子培養基。對比組1、果實傷口處加入30 ill對比例所得的濃度為108個細胞/毫升的 C. laurentii 懸浮液；對比組2、果實傷口處加入30iU對比例所得的濃度為106個細胞/毫升的 C. laurentii 懸浮液；對比組3、果實傷口處加入30iU對比例所得的濃度為107個細胞/毫升的 C. laurentii 懸浮液。空白對照組果實傷口處加入30 U 1的無菌水。
108個細胞/毫升的 108個細胞/毫升的 108個細胞/毫升的 106個細胞/毫升的 107個細胞/毫升的
以下結果分別為在處理后5天和6天檢測而得，具體結果如表1所示表1、對梨青霉病的控制效果
~ 表中數字為平均數士標準誤。實驗1. 2、對蘋果的生防實驗將實驗1. 1中的梨改成蘋果，并選取實驗1. 1中的若干個實驗組和對比組，其余等 同實驗1.1，結果如表2所示表2、對蘋果青霉病的控制效果 表中數字為平均數士標準誤。實驗1. 3、對桃果實的生防實驗將實驗1. 1中的梨改成油桃，并選取實驗1. 1中的若干個實驗組和對比組，其余同 實驗1.1，結果如表3所示(為病原菌接種后第6天的統計數)表3、對桃青霉病的控制效果
度為0%) 與利用現有技術給出的NYDA活化培養基和NYDB種子培養基相比，利用本發明的 NYCA活化培養基和NYCB種子培養基培養的C. Iaurentii能顯著提高其拮抗效力，即降低了 水果果實的發病率(％ )、減小了水果果實的病斑直徑(mm)。C. Iaurentii的拮抗效力總體 上與酵母的濃度成正相關。實驗2、幾丁質對羅倫隱球酵母在培養基中生長的影響按5% (V/V)接種量將羅 倫隱球酵母菌接入不同的NYCB培養基中(幾丁質含量分別為0. 1，0. 2，0. 5，1. 0，2. 0%，w/ ν ；葡萄糖均為IOg ；)以NYDB為對照；或者該不同的NYCB培養基為幾丁質恒定(w/v)，葡萄糖加入量分別設置在每 L 中含 0、2、4、8、10、12、14、16、18 和 20 克。
在28°C條件下震蕩培養(200rpm) 24-144小時后，取樣在顯微鏡下用血球計數器 對酵母數量進行統計，結果以每ml總酵母數量為單位(log細胞數/毫升)。每個處理重復 3次，每重復4個獨立樣品。整個實驗重復2次。結果如下C. Iaurentii在含0. 1-2. 0% (w/v)幾丁質的NYCB培養基中培養24-144小時的 生長量沒有顯著差異，C. Iaurentii在不同葡萄糖濃度的NYCB培養基中培養24-144小時 的生長量沒有顯著差異(圖1)。實驗3、幾丁質培養后的羅倫隱球酵母在果實傷口處的生長動態用消過毒的打 孔器在每個果實表面形成統一大小和深度的傷口，在每個傷口處加入等量(30μ1)的經過 NYCB培養基(IOg幾丁質，IOg葡萄糖)培養后C. Iaurentii細胞懸浮液。以在正常NYDB 培養基培養的作為對照。處理后貯藏在常溫(20°C )下，并定期取樣對酵母的群體數量進行 測定。測定方法是用打孔器將果實傷口處組織完全取出(確保酵母的完全提取)，放于定 量無菌蒸餾水中，并用捻缽搗碎，取樣在顯微鏡下用血球計數器對酵母菌數量進行統計，結 果以每個傷口處總酵母數量為單位(log細胞數/孔)。每個處理重復3次，每重復6個果 實。整個實驗重復2次。1、梨果實果實生物防腐保鮮實驗設置以下處理(1)處理1 果實傷口處加入上述體積經過NYDB培養基培養的濃度為IO8個細胞 /毫升的C. Iaurentii懸浮液。(2)處理2 果實傷口處加入上述體積經過NYCB培養基(幾丁質濃度為l%，10g 葡萄糖)培養的濃度為IO8個細胞/毫升的C. Iaurentii懸浮液。(3)處理3 果實傷口處加入上述體積經過NYDB培養基培養的濃度為IO7個細胞 /毫升的C. Iaurentii懸浮液。(4)處理4 果實傷口處加入上述體積經過NYCB培養基(幾丁質濃度為l%，10g 葡萄糖)培養的濃度為IO7個細胞/毫升的C. Iaurentii懸浮液。(5)處理5 果實傷口處加入上述體積經過NYDB培養基培養的濃度為IO6個細胞 /毫升的C. Iaurentii懸浮液。(6)處理6 果實傷口處加入上述體積經過NYCB培養基(幾丁質濃度為l%，10g 葡萄糖)培養的濃度為IO6個細胞/毫升的C. Iaurentii懸浮液。2、蘋果果實生物防腐保鮮實驗設置以下處理(1)處理1 果實傷口處加入上述體積經過NYDB培養基培養的濃度為IO8個細胞/毫升的C. laurentii懸浮液；(2)處理2 果實傷口處加入上述體積經過NYCB培養基(1 %幾丁質，10g葡萄糖) 培養的濃度為108個細胞/毫升的C. laurentii懸浮液。C. laurentii在梨和蘋果果實傷口處的生長速度分別如圖2和圖3所示，說明 C. laurentii本發明經過本發明培養基的誘導培養后在梨和蘋果果實傷口處的生長速度明 顯優于在常規培養基中的生長速度。實驗4、培養液上清液對果實病害的抑制效應實施例1的步驟3)離心分離所得液體經0.45 ym膜過濾，得培養液上清液。實驗4. 1、培養液上清液對梨果實病害的抑制，設置以下處理以相同品種及成熟度的梨果實作為實驗對象，用消過毒的打孔器在每個果實表面 形成統一大小和深度的傷口(使用5mm直徑打孔器)，先加入30 yl不同的試劑，2小時后 在原傷口接入病原菌P.expansum孢子懸浮液(1 X 104個孢子/毫升)30 yl。上述處理完 成后，將果實貯藏于常溫(20-25°C )下貯藏，并用PE塑料膜密封作保濕處理。4天后對病 害發生率(％)進行統計。每個處理重復3次，每重復12個果實，整個實驗重復2次。每個傷口處加入的30 U 1試劑具體如下無菌水，對照；NYDB培養基培養后的上清液；NYCB培養基(幾丁質含量為0. 5%,10g葡萄糖)培養后的上清液；NYCB培養基(幾丁質含量為l%，10g葡萄糖)培養后的上清液。培養液上清液的抑菌效果如表4所示。表4、培養液上清液對梨青霉病的控制效果 表中數字為平均數士標準誤。實驗4. 2、培養液上清液對蘋果病害的抑制，設置以下處理將實驗4. 1中的梨改成蘋果，并選取實驗4. 1中的若干個實驗組和對比組，其余同 實驗4. 1，結果如表5所示表5、培養液上清液對蘋果青霉病的控制效果
表中數字為平均數士標準誤。實驗4. 3培養液上清液對桃病害的抑制設置以下處理將實驗4. 1中的梨改成桃，每個傷口處加入的30 iU試劑具體如下無菌水，對照；NYDB培養基培養后的上清液；NYDB培養基培養后的上清液并經過100°C、15分鐘加熱處理；NYCB培養基(幾丁質濃度為1%，葡萄糖10克)培養后的上清液；NYCB培養基(幾丁質濃度為1 %，葡萄糖10克)培養后的上清液并經過100°C、15 分鐘加熱處理；其余內容同實驗4. 1，結果如表6所示表6、培養液上清液對桃青霉病的控制效果 表中數字為平均數士標準誤。根據上述表格可知，C. laurentii在NYDB中培養后的上清液沒有抑菌效力。而在 NYCB培養基培養后，C. laurentii的發酵上清液(培養液上清液)顯示了出對擴展青霉在梨果實傷口處侵染的抑制作用。特別是完全抑制了早期(第4天)病害癥狀的出現，而且 到第7天時仍能顯著抑制青霉病的病斑直徑(表4)。在蘋果果實傷口上也有類似的結果 (表5)。在水蜜桃果實上(表6)，NYDB中培養后酵母上清液，同樣對P.expansum沒有抑制 作用。但在NYCB培養基(幾丁質)培養后的酵母上清液，能對桃果實青霉病產生20% 左右的抑制作用(平均病斑直徑)。NYCB培養基加熱后的發酵上清液沒有抑菌性能。實驗5、對果實傷口系統抗性的誘導果實先用消過毒的打孔器在每個果實表面 形成統一大小和深度的傷口。每個傷口處30 yl等量以下處理在NYDB培養基培養的濃度為107個細胞/毫升酵母懸浮液；在NYDB培養基培養的濃度為108個細胞/毫升酵母懸浮液；在NYDB培養基培養的濃度為109個細胞/毫升酵母懸浮液；NYCB培養基中(1%幾丁質，葡萄糖10克)培養的濃度為107個細胞/毫升酵母 懸浮液；NYCB培養基(1 %幾丁質，葡萄糖10克)培養的濃度為108個細胞/毫升酵母懸 浮液；NYCB培養基(1 %幾丁質，葡萄糖10克)培養的濃度為109個細胞/毫升酵母懸 浮液；無菌水(作為對照)。上述處理完成后，將果實貯藏于常溫(20_25°C )下貯藏，并用PE塑料膜密封作保 濕處理。72小時后在離原傷口 5mm處新開一個同樣大小的傷口，并接入病原菌P. expansum 孢子懸浮液(1乂104個孢子/毫升)。病原菌接種處理后果實繼續貯藏在原先同樣條件下， 4天后對病害發生率(％)進行統計。每個處理重復3次，每重復12個果實，整個實驗重復 2次。結果如下在NYDB中培養的C. laurentii在最高使用濃度(109個細胞/毫升)能誘導蘋果 果實產生對青霉病的抗性，而在較低濃度(107個細胞/毫升和108個細胞/毫升)均不能 誘導果實的抗性(圖4)。而經過NYCB培養基培養后的C. laurentii，在接種處理到蘋果果實上后，其對蘋 果抗性的誘導能力顯著增強，且在較低濃度(108個細胞/毫升)時也能誘導果實產生對青 霉病的抗性。實驗6、羅倫隱球酵母對幾丁質酶和0 -1. 3-葡聚糖酶的活性實驗6. 1、羅倫隱球酵母對幾丁質酶活性酵母經過NYDB或NYCB培養基(分別含0. 1、0. 5、1或2%幾丁質，葡萄糖均為10 克)培養后所得的培養物經過3000rpm離心、0. 45 u m膜過濾后所得上清液作為酶測定提 取液。反應液組成為1ml濃度為0.4% (w/v)膠體幾丁質，lml 50mmol/l醋酸緩沖液(Ph 5. 0)，lml上清液。反應液在37°C培養反應1小時后，離心去除沉淀，所得的上清液取0. 5ml 加入lOiU濃度為20% (w/v)的蝸牛酶溶液，繼續在37°C培養反應1小時。釋放出的N-乙 酰葡萄糖胺含量按以下方法進行測定加入0. 2ml濃度為0. 8mol/l四硼酸納，沸水浴中 加熱3分鐘，迅速冷卻；加入預先用2. 7ml冰醋酸和0. 3ml濃度為10%的二甲氨苯甲醛〔 dimethylaminobenzaldehyde，DMAB，用冰醋酸和濃鹽酸按87. 5 12. 5(體積比)比例配制而成〕混合的溶液，37°C培養反應20分鐘后迅速冷卻；在585nm測定吸光度。以反應0小 時樣品作為對照，同時測定N-乙酰葡萄糖胺含量；用N-乙酰葡萄糖胺做標準曲線；以每ml 上清液每小時分解膠體幾丁質產生釋放lnmol N-乙酰葡萄糖胺作為一個酶活力單位(U)； 每個處理設3個重復，整個實驗重復2次。實驗6. 2、對0 -1. 3-對葡聚糖酶活性酵母經過NYDB或NYCB培養基(分別含0. 1、0. 5、1或2%幾丁質，葡萄糖均為10 克)培養后所得的培養物經過3000rpm離心、0. 45 u m膜過濾后所得上清液作為酶測定提 取液。反應液組成為1ml濃度為0.4% (w/v)昆布多糖(Sigma)溶液，lml 50mmol/l醋酸 緩沖液(Ph 5. 0)，lml上清液。在37°C培養反應1小時后，加入1. 5mL3. 5 一二硝基水揚酸 試劑(DNS)試劑，在沸水浴中保溫10分鐘，取出試管，冷卻后測定530nm吸光度；并以反應 0小時樣品同時做測定葡萄糖含量；用葡萄糖做標準曲線；以每ml上清液每小時分解產生 lnmol葡萄糖作為一個酶活力單位(U)；每個處理設3個重復，整個實驗重復2次。上述實驗6. 1和實驗6. 2的統計分析為每個單獨的試驗中每個處理至少設3個 以上重復，并按照完全隨機區組原則進行設計。每個獨立的試驗至少重復2次。實驗結果 用SPSS/PC統計軟件進行統計分析。當組內比較個數為3個及3個以上時，采用Duncan' s 多重比較進行方差分析，分離平均數；當組內個數為2個時，采用獨立樣品t檢驗進行平均 數分離。結果如圖5所示；C. laurentii在NYCB培養基(0.5-2%幾丁質)培養24小時后， 其上清液中的幾丁質酶活性顯著提高，特別是在最佳濃度(1%)時，幾丁質酶活性是未添 加幾丁質對照的5倍左右。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發 明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容 直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
權利要求
誘導提高生防酵母對果實病害防治效力的培養基，包括活化培養基和種子培養基，其特征是所述活化培養基為牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖2～30g、瓊脂20g和幾丁質1～50g，水定容至1000ml，高壓滅菌后得NYCA活化培養基；所述種子培養基為牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖2～30g和幾丁質1～50g，水定容至1000ml，高壓滅菌后得NYCB種子培養基。
2.利用權利要求1所述培養基進行的誘導提高生防酵母對果實病害防治效力的方法， 其特征是所述生防酵母為羅倫隱球酵母，其保藏名稱為羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)ZJU 10，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地 址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；保藏日期2010年1月 20日，保藏號CGMCCN0. 3590 ；依次進行以下步驟1)、活化:①、羅倫隱球酵母CGMCCNO. 3590在NYCA活化培養基中25 28°C培養46 50小時， 然后在相同條件下重復傳代培養2次；②、將上述重復傳代培養2次所得的活化好的酵母用接種環接到NYCB種子培養基中， 于150 200rpm、25 28°C的條件下培養22 26小時；然后在上述相同條件下重復培養 1次；2)、液體培養將步驟1)活化所得的酵母按照5%重量比的接種量接到NYCB種子培養基中，于150 200rpm、25 28°C的條件下培養24 144小時。
3.根據權利要求2所述的誘導提高生防酵母對果實病害防治效力的方法，其特征是 將步驟2)液體培養后的所得物依次進行以下步驟離心分離將步驟2)液體培養后的所得物在3000rpm離心10分鐘，并用滅菌蒸餾水洗以去除培 養介質；懸浮和確定濃度用無菌蒸餾水重新懸浮酵母細胞，并用無菌蒸餾水調整到細胞濃度為1 X 106細胞/毫 升 1X109細胞/毫升。
全文摘要
本發明公開了一種誘導提高生防酵母對果實病害防治效力的培養基，包括活化培養基和種子培養基，活化培養基為牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖2～30g、瓊脂20g和幾丁質1～50g，水定容至1000ml，高壓滅菌后得NYCA活化培養基；種子培養基為牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖2～30g和幾丁質1～50g，水定容至1000ml，高壓滅菌后得NYCB種子培養基。本發明還同時公開了利用上述培養基進行的誘導提高生防酵母對果實病害防治效力的方法，包括對羅倫隱球酵母CGMCC NO.3590進行活化和液體培養等步驟。
文檔編號A23B7/155GK101857843SQ20101015356
公開日2010年10月13日 申請日期2010年4月22日 優先權日2010年4月22日
發明者余挺, 盧黃娉, 王一非, 鄭曉冬 申請人:浙江大學