專利名稱：：6-氨基己酸的生物化學合成的制作方法6-氨基己酸的生物化學合成本發明是基于發明專利申請No.200580002757.3的分案申請。本發明涉及對6-氨基己酸(6-aminocaproicacid)進行生物化學合成的新方法。6-氨基己酸在下文中也被稱為6-ACA。化合物6-氨基己酸(IUPAC名稱6_氨基-己酸，6-amino-hexanoicacid)是生產ε-己內酰胺(下文中簡稱為己內酰胺)的可能的中間產物，這是生產尼龍-6的基礎。另一方面，6-氨基己酸還可通過己內酰胺的水解形成。己內酰胺是散裝化學物質，其在世界范圍內以非常大的規模被制造。用于對己內酰胺進行工業制造的基礎化學物質通常是散裝化學物質，例如，苯、環己烷、環己酮等，從它們可以制得環己酮肟，然后其再通過所謂的Beckmarm重排轉化為己內酰胺。但是，在回收尼龍-6地毯廢料時，例如，6-氨基己酸(以及在對尼龍-6的去聚合化步驟中形成的一些其它產物)可被用于通過環化反應合成己內酰胺。在對尼龍-6的工業回收中，生產己內酰胺通常是最后的合成步驟。6-氨基己酸(6-ACA)因此適合用于合成己內酰胺，以及隨后的對尼龍-6的生產。但是，6-ACA還可直接用作為生產尼龍-6的原材料。對于6-ACA和/或其酯類的環化而言，多種方法都是技術人員已知的。例如，可以參考US-A-6，194，572中描述的方法，其中，在反應區域中，在不存在催化劑的情況下，用溫度在270至400°C范圍內壓力在0.5至2MPa范圍內的超熱蒸汽去處理6-ACA和/或其酯類。這些方法可連續操作，形成的己內酰胺可通過在反應混和物離開反應區域之后立即在100至170°C范圍內的溫度下進行部分冷凝來分離。將6-ACA直接轉化為尼龍-6例如可以按照JP4050232-A來進行。在本專利申請中，術語“生物化學合成”(在本專利申請上下文中，該術語可被替換為“生物轉化”)的含義不僅指除大量純粹的化學反應步驟之外還包含一種或多種生物催化反應的方法，該術語還包括使用合適的生產菌株的整個細胞來進行的純粹的生物化學過程。此類純粹的生物化學過程在從合適的碳源開始的生物化學合成的情況下指發酵，在從已具有碳骨架(從其可獲得待合成的目標分子)的中間產物開始的生物合成的情況下指前體發酵。這些方法可以在有氧或厭氧條件下進行。生物化學合成可以在體內或體外進行。通常，體內方法是用活細胞(術語“活細胞”還包括所謂的靜止細胞)進行的方法；另一方面，體外方法通常使用細胞裂解物或(部分)純化的酶來進行的。然而，在本文中提及的生物化學合成還可用滲透性(permeabilized)細胞來進行；但是，對于用滲透性細胞進行的方法來說，體內和體外的區別沒有太多意義。本發明還涉及獲得用于合成6-氨基己酸的生物轉化過程的經過遺傳工程改造的合適的宿主細胞的方法，還特別涉及迄今未知的用于從能得到6-氨基己酸的中間產物(即，6-氨基己-2-烯酸)，或從能轉化為其的化合物(即6-氨基-2-羥基己酸)對6-氨基己酸進行前體發酵的方法。在本申請的上下文中，所述化合物6-氨基己-2-烯酸和6-氨基-2-羥基己酸(下文中將有解釋)將被分別稱為6-AHEA和6-AHHA。在對6-氨基己酸的前體發酵中，如下所述，可針對前體發酵將合適的中間產物制備為如下可獲得的形式它們3以非限制性和非抑制性的濃度存在，例如，通過將其補料到其中進行生物化學合成(即，轉化)的反應容器中來進行。本發明還特別涉及新穎的宿主細胞，它們具有針對6-氨基己-2-烯酸，即針對6-AHEA，的烯酸酯(enoate)還原酶活性。特別地，其還涉及具有針對6-AHEA的在空氣中穩定的烯酸酯還原酶活性的新穎的宿主細胞。本文中使用的術語“空氣中穩定的(aerostable)，，表示耐氧的。最后，如下文中所解釋的一樣，本發明涉及通過生物化學方法生產的新穎的化合物6-AHEA和6-ACA，以及從此類6-ACA生產的己內酰胺，涉及尼龍_6和其它衍生物，它們是從此類通過生物化學方法生產的化合物或此類己內酰胺生產的。通常，直到今天，已知的到6-ACA的途徑都是艱苦且麻煩的。通常，如果6-ACA不是從廢的尼龍_6材料生產的話，這些已知的途徑都需要相對昂貴的起始原料和反應試劑(例如，丁二烯和氫氣)，以及相對嚴格的在多步驟和多反應器方案中的溫度和壓力反應條件，以及需要用到昂貴的催化體系。因此，人們需要替代性的到6-ACA的途徑，優選地，從便宜很多的原材料起始的。本領域公知，來自農業生產的天然生長的并且因此可更新的材料是可用于發酵或前體發酵的碳源(例如葡萄糖)(或其它合適的碳源或其混合物)的基礎。此類可更新的材料相對便宜而且可以大量獲得。通常，如果可更新的材料可用作為針對所有類型的化學材料的起始原料，會被認為是非常有利的。本發明的目的之一是使得能夠通過生物化學合成(即，通過生物轉化)來生產6-ACA，這在目前是未知的。本發明的發明人出人意料地發現了一種新穎的方法，用于對6-氨基己酸進行生物化學合成，其中，結構式[1]的6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)H2N-CH2-CH2-CH2-CH=CH-COOH[1]或6-氨基-2-羥基己酸(6-AHHA)(這是一種能被轉化為6_氨基己_2_烯酸的化合物)被具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶處理，所述的酶活性針對含α，β-烯酸酯基團和伯氨基的分子，具體而言，被具有針對6-氨基己-2-烯酸的α，烯酸酯還原酶活性的酶處理。本文中，針對含α，β-烯酸酯基團和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯還原酶活性應被理解為，能將與羧酸(-C00H)或羧酸根(_C00_)或酯(_C00R，R表示至多6個C原子的低級烷基)相鄰的α，β-位置上的α，碳-碳雙鍵轉化為還含有伯氨基(即，不形成酰胺基團一部分的-NH2基團)的分子中的碳-碳單鍵。單取代或二取代的氨基不被包含在本文所使用的伯氨基的定義內。術語α，β-烯酸酯還原酶活性包括可測量到的活性的所有可能水平上的此類活性，包括可通過技術人員已知的方法獲得的增加的活性水平，例如，通過過量表達、誘導或者對相關基因加以調控、增加相關基因的拷貝數、增加相關基因的內源活性等方法來實現，或者通過優化試驗條件來實現。除6-ΑΗΕΑ之夕卜，能通過脫水作用轉化為6-ΑΗΕΑ的、相應的飽和α-輕基-取代的化合物6-ΑΗΗΑ也可用于本發明的方法。在本專利申請的上下文中，該化合物被認為與α-未取代的α，β-烯酸酯6-ΑΗΕΑ等同。應當注意，由本發明發明人發現的生物化學反應，關于含α，烯酸酯基團和伯氨基的分子的轉化方面，在本領域中并未有描述和教導，盡管具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶(大多數情況下，通常特別用于含有不與氫等同的α-取代基的α，β-烯酸酯)是技術人員已知用于針對大范圍底物的其它類型的反應的。通常，此類使用具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶的已知的反應是用于對應異構體特異性酶的合成的。例如，見H.Simonetal.的Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，Vol13(1974)，p.608-609、B.Rambecketal.的如上文中第609頁、I.Thanosetal.的J.Biotechnol.9，13-29(1987)、H.Simonetal.的Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，Vol.24(1985)，p.539-553和US-A-4,464，235。在H.Simon的Chem.Biochem.Flavoenzymes(1991),Chapterl1,pages317-328(出版者CRC,BocaRaton)中可以找到關于具有α，β_烯酸酯還原酶活性的酶的綜述。這些文獻中的后者表明，所述α，β-烯酸酯還原酶活性涉及從被還原的酶到烯酸酯化合物的氫化物轉移。I.Thanosetal.(上文中引用的)關注使用來自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460的烯酸酯還原酶針對α-取代的烯酸酯進行的電酶還原方面。在W0-03/066863中顯示了具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶的其它例子，這些例子涉及對立體化學上純凈的α-取代的羰基化合物的合成。該文獻沒有顯示針對所用的烯酸酯還原酶的任何含有伯氨基的底物。因此，完全沒有教導表明，具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶適合用于對羧酸基團鄰近的α-位置上未被取代且還含有伯氨基的化合物，例如6-ACA進行生物化學合成。事實上，技術人員考慮到上述可能的氫化物轉移機制，將更可能預期到那些要被具有α，烯酸酯還原酶活性的酶轉化的分子中伯氨基的存在，會對此類轉化反應造成負面影響。預期中帶正電的氨基看起來將是被轉移的氫化物的優選受體，因此會對烯酸酯還原酶活性造成負面干擾。還應注意到，SteirAacheretal.(見STN數據庫編號2003:101473)進行的評述指出烯酸酯還原酶具有寬廣的底物特異性，這與來自其它文獻(例如，上文引用的H.Simonetal.)的數據一致，其中顯示了針對菌株ClostridiumtyrobutyricumDSM1460(與上文引用的I.Thanosetal.的工作中使用的同樣的菌株)中烯酸酯還原酶反應的寬廣范圍的底物的使用，這并未改變所述的觀點。此外，在文獻中，對來自不同梭狀芽胞桿菌的烯酸酯還原酶的克隆、測序和表達已有描述(見，F.Rohdich，etal.的J.Biol.Chem.276(6)，5779-5787(2001))。特別地，ClostridiumtyrobutyricumDSM1460禾口ClostridiumthermoaceticumDSM1974(該菌株近來與許多其它Clostridium種的菌柱一起被重新命名，因此現在也被稱為Moorellathermoacetica)的烯酸酯還原酶(enr)基因被克隆和測序。然而，此類克隆目前還沒有在來自例如，Bacillus、Corynel3acterium或Pichia屬的任何種中開展。但是，具體而言，關于在E.coli中克隆來自Moorellathermoacetica和來自Clostridiumtyrobutyricum的enr基因已被F.Rohdich描述過。關于這些克隆，應當注意到，后者(來自C.tyrobutyricum)并未被Rohdichetal.在厭氧條件下(即在厭氧條件下生長)試驗過，并且在有氧條件下的實驗導致烯酸酯還原酶的失活形式；而前者(來自M.thermoacetica)在有氧條件下表達時給出了同樣的結果，僅在厭氧條件下才能產生烯酸酯還原酶的活性形式。此外，在W0-03/066863中，已描述了在E.coli中對從BurWiolderia種獲得的烯酸酯還原酶進行克隆，這些酶已被測序。因此，引用的參考文獻中沒有一篇教導了形成本發明基礎的6-ACA形成反應。如發明人所發現的，具有α，烯酸酯還原酶活性的酶(用于本發明的方法中的)可以是來自一大組的微生物屬(厭氧的以及需氧的那些)的任何合適的酶(即，如果可被確認為具有針對含α，β_烯酸酯基團和伯氨基的分子，尤其是針對6-氨基己-2-烯酸的α，β-烯酸酯還原酶活性，該酶就是合適的)，例如，來自Acetobacterium、AchromobacterλAcremonium、Agrobacterium、Alcaligenes、Bacillus、Bradyrhizobium、Burkholderia、CaloramatorΛCephalosporium、Clostridium、Escherichia、Eubacterium、FilifactorλFusobacterium、Kluyveromyces、Mesorhizobium、Moorella、Ochrobactrum、Oxalophagus、OxobacterΛPaenibacillus、PseudomonasΛRalstonia、Rhizobium、Rhodotorula、Salmonella、Shigella、Sinorhizobium、Sporohalobacter、Syntrophospora、ThermoanaerobacterλThermoanaerobacterium、Tilachlidium、Vibrio、Xanthobacter或Yersinia的屬。優選地，在本發明的方法中，具有α，烯酸酯還原酶活性的酶是來自Acetobacterimsp.、Acremoniumsp.、Agrobacteriumsp.、Burkholderiasp.、Cephalosporiumsp.、Clostridiumsp.、Escherichiasp.、Moorellasp.、Ochrobactrumsp.、Pseudomonassp.、Salmonellasp.、Shigellasp.、Tilachlidiumsp.、Yersiniasp.和Vibriosp.種的組的微生物的酶。更優選地，具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶是來自Acremoniumsp.、Clostridiumsp·、Moorellasp.、或Ochrobactrumsp.的酶。最優選地，具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶是來自AcremoniumstrictumCBSl14157(保藏日2003年12月19日；按照布達佩斯條約保藏)、ClostridiumtyrobutyricumDSM1460(可從DeutscheSammlungMikroorganismenundZellkulturen獲得)、MoorellathermoaceticaDSM1974(可從DeutscheSammlungMikroorganismenundZellkulturen獲得)(該酶還被稱為DSM1974，直到1980年1月1日，被命名為Clostridiumthermoaceticum)>OchrobactrumanthropiNCIMB41200(1H%2003^Ξ12月16日；按照布達佩斯條約保藏)或ClostridiumkluyveriDSM555(可從DeutscheSammlungMikroorganismenundZellkulturen獲得)的酶。在上下文中，應當注意至丨」，大量的Clostridium種近來被重命名。上文中給出的名字因此指出了可由其獲得具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶的菌株(細胞)和品種。使用來自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460或來自MoorellathermoaceticaDSM1974的具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶時，發明人已獲得了根據本發明的向6-ACA的生物化學轉化的好結果。優選地，針對含α，β-烯酸酯基團和伯氨基的分子的具有α，β_烯酸酯還原酶活性的酶具有在空氣中穩定的α，烯酸酯還原酶活性。這意味著，該酶將能在游離氧存在的條件下催化想要的生物轉化，而沒有任何明顯的鈍化，即，在生物轉化過程中鈍化不會超過酶活的標準偏差。此類具有空氣中穩定活性的酶可被稱為耐氧酶。因此，在本發明的一種優選的實施方式中，具有α，烯酸酯還原酶活性的酶具有在空氣中穩定的α，β-烯酸酯還原酶活性，并且是來自Agrobacteriumsp.、Burkholderiasp.^Escherichiasp.>Pseudomonassp.>Salmonellasp.>Shigellasp.、Yersiniasp.和Vibriosp.種的組的微生物的酶。更優選地，具有空氣中穩定的α，β-烯酸酯還原酶活性的酶是來自Escherichiacoli種的，最優選地，是來自EscherichiacoliK12的酶。本發明的方法非常適合在3至9范圍內的pH下通過將6-氨基己_2_烯酸轉化為6-氨基己酸來進行，優選地，4至8范圍內的pH，更優選地，5至8，最優選地，在厭氧條件下5.5至7pH，在有氧條件下，6.5至8pH。可通過以如下方式提供6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)化合物，或者提供能代謝為該化合物的產品(但與純粹的碳源例如葡萄糖不同)，使得起始材料6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)可為根據本發明的生物化學轉化所用，所述方式使得該化合物在所用的反應器中以非限制性和非抑制性的濃度存在，例如通過向其中進行生物化學過程的反應容器(例如，發酵罐)中補料來進行。其中6-AHEA(或其可被代謝的前體)以上述方式用于反應容器中的根據本發明的方法被稱為“前體發酵”。當然，還可通過發生于含α，β-烯酸酯還原酶活性的微生物中的任何合適的生物化學方法，使得6-ΑΗΕΑ(或任何能被代謝為其但與純粹的碳源不同的產品)可以被根據本發明的轉化所利用。例如，人們已知，賴氨酸可通過在Corynebacteriumglutamicum細胞中的生物轉化來產生(例如，見PfefferleW.的Adv.Biochem.Eng.(2003)，Vol.79，p59-l12)。Corynebacteriumglutamicum完整基因組序列的已知對于賴氨酸的生物技術生產的改進產生了重大的影響。假設微生物中的賴氨酸隨后可被轉化為6-AHEA，這是迄今為止未被公開或提出的方法，它將可能是制備可用于本發明轉化的6-AHEA的合適方法。通過技術人員容易獲得的化學方法，可將通過生物化學合成(生物轉化)產生的賴氨酸轉化為6-AHEA。例如，按照Houben-Weyl，MethodsofOrganicChemistry(4thedition),VolE22a,Thieme,Stuttgart,2002page166-191所述，通過首先用賴氨酸-銅(II)復合物方法保護氨基來進行。可選的保護基團是乙酰基、苯甲酰基、苯乙酰基、芐氧羰基或鄰苯二甲酰亞胺基(phthaloylimide)。隨后在硫醇或硒醇存在的情況下對α-氨基進行的亞硝化反應導致了相應的α-硫或α-硒醚的形成。該亞硝化可以在具有NaNO2/H2S04的水性介質中進行，或者在使用例如，亞硝酸異戊酯(iso-amylnitrite)的無水條件下進行。硫醇的合適例子是(被取代的)苯硫酚和苯甲基硫醇；該反應中苯硒醇是作為硒醇優選的。隨后用H2O2對α-硫醚或α-硒醚氧化以及隨后進行原位消去反應將獲得ε-保護的6-ΑΗΕΑ。該過程的例子由S.Bory,M.Gaudry,A.Marquet；NouveauJournaldeChimie(1986)，10，709-713所描述。通過酸或堿催化的對ε-保護基團的水解，獲得6-ΑΗΕΑ。當6-ΑΗΕΑ是在細胞中通過生物化學方法產生(或來自通過生物轉化制造的賴氨酸)的情況下，得到的6-ACA(以及在從細胞中排出和通過任何已知方法進行的環化之后從其獲得的己內酰胺)與從化石給料(fossilefeedstock)的化學途徑獲得的6-ACA(和/或由此獲得的己內酰胺，分別從其獲得的產品，例如，從此類己內酰胺獲得的尼龍-6)可以很容易地區分開。在后一種情況中，分子中不存在14C是顯而易見的。或者，可以用12C比13C比14C同位素的比例(可通過StableIsotopeRatioMassSpectrometry(SIRMS)方法，或通過所謂的經由NuclearMagneticResonance的Site-SpecificNaturalIsotopeFractionation(SNIF-NMR，它們可用于對生物物質的鑒定)作為6-ACA(和/或己內酰胺)來源的指紋，因為，12C比13C比14C同位素的比例將與環境二氧化碳中存在的值大致相同。起始材料，6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)還可通過純粹的化學方法獲得，例如，與P.Hughesetal.關于蘇_3_羥基賴氨酸合成的J.Org.Chem.vol.59(1994)，pages5799-5802中所述的方法中流程2的步驟a和i類似的方法。這被展示在本申請的實驗部分中。根據本發明的方法優選在選自由Aspergillus、Bacillus、Corynebacterium、hcherichia和Pichia屬組成的組的宿主生物中進行。屬于Corynekicteriumsp.的組，例如C.glutamicum的宿主生物是特別優選的，因為這些微生物已知適合用于對賴氨酸的生物合成生產。在本發明的特別優選的實施方式中，適于對6-氨基己酸進行生物化學合成的宿主菌株以及由此的宿主細胞選自Escherichiacoli、Bacillus、Corynebacteriumglutamicum、Aspergillusniger或Pichiapastoris宿主細胞的組，其中，編碼具有針對含α，β-烯酸酯基團和伯氨基的分子的α，烯酸酯還原酶活性的α，β_烯酸酯還原酶基因被克隆和表達。可以代替任何上述α，β-烯酸酯還原酶基因，編碼具有α，β-烯酸酯還原酶活性并且能將6-ΑΗΕΑ以足夠程度轉化為6-ACA的任何其它基因可以使用，其被認為是落在了要求保護的范圍之內。在本申請提到的細胞中，現有技術中僅描述了用來自MoorellathermoaceticaDSM1974或來自Clostridiumtyrobutyricum的α,β-烯酸酯還原酶基因克隆的hcherichiacoli細胞；上面提到的其它細胞都是新穎的細胞。此外，如本發明所發現的，編碼具有空氣中穩定的、針對含α，烯酸酯基團和伯氨基的分子的α，烯酸酯還原酶活性的酶的基因可被用于本發明的方法。例如，發明人發現，已知具有N-乙基馬來酰亞胺還原酶活性的基因，EscherichiacoliK12(菌株W3110)的nemA基因(編號D86931)也具有針對含α，β-烯酸酯基團和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯還原酶活性。nemA基因的這種α，β_烯酸酯還原酶活性以前是未知的。基于與來自E.coli的nemA基因的序列同源性，編碼具有在空氣中穩定的、針對含α，β-烯酸酯基團和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯還原酶活性的酶的其它基因將可從來自例如Agrobacterium、Escherichia、Pseudomonas、Salmonella、Shigella、Yersinia禾口Vibrio的菌株中獲得。就本專利申請的目的而言，編碼具有在空氣中穩定的、針對含α，β-烯酸酯基團和伯氨基的分子的α，烯酸酯還原酶活性的酶的所有此類其它基因都被認為是與nemA等同的。因此，本發明還特別涉及如下新穎的細胞-Escherichiacoli宿主細胞，其中，來自OchrobactrumanthropiNCIMB41200或來自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達；-Bacillus宿主細胞，其中，來自MoorellathermoaceticaDSM1974,或來自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460,^jfegOchrobactrumanthropiNCIMB41200,自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達；-Corynebacteriumglutamicum宿主細胞，其中，來自MoorellathermoaceticaDSM1974，或來自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460，或來自OchrobactrumanthropiNCIMB41200，或來自AcremoniumstrictumCBS114157的α,β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達；-Aspergillusniger,gMoorellathermoaceticaDSM1974,^；JfegClostridiumtyrobutyricumDSM1460,^jftgOchrobactrumanthropiNCIMB41200,或來自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達；-Pichiapastoris宿主細胞，其中，來自MoorellathermoaceticaDSM1974，或來自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460,^jftgOchrobactrumanthropiNCIMB41200,^；來自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達；以及-選自Aspergillus、Bacillus、Corynebacterium和Pichia宿主細胞的組的宿主細胞，其中，來自E.coliK12的在空氣中穩定的α，β-烯酸酯還原酶基因nemA被克隆和表達。通常，具有在空氣中穩定的α，烯酸酯還原酶活性的酶在本發明的上下文中是明確優選的。這是因為在有氧條件下培養和/或使用的微生物中它們能被表達和使用。可以通過技術人員已知的任何合適的克隆策略，例如通過實驗部分中描述的Tj法，來獲得下述Escherichiacoli、或Bacillus、或Corynebacteriumglutamicum、或Aspergillusniger或Pichiapastoris宿主細胞，所述宿主細胞中，來自MoorellathermoaceticaDSM1974,g*自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460,g*自OchrobactrumanthropiNCIMB41200,SAcremoniumstrictumCBSl14157白勺α，β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達(或者，與它們同源、并且編碼具有α，β-烯酸酯還原酶活性且能以足夠程度將6-ΑΗΕΑ轉化為6-ACA的酶的任何此類基因)。還可參考公知的手冊，SambrookJ.,Fritsch,Ε.F.,andManiatis,Τ.MolecularClonning:ALaboratoryManual.2nded.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，NY，1989。類似地，此類克隆策略還可被用于構建上面提到的nemA克隆(或與其等同的克隆)。此外，特別是當從真菌中獲得的基因被克隆到細菌菌種中的情況下，技術人員將使用合適的手段，不僅用于改造轉錄和翻譯控制序列，此外還使用經過分離的或通過合成獲得的cDNA序列，以獲得將被制造的酶的功能性表達。此外，本發明還涉及對6-氨基己酸(6-ACA)進行前體發酵的方法，其中，從6_氨基己-2-烯酸(6-AHEA)或從6-氨基-2-羥基己酸(6-AHHA)開始，應用至少一個酶步驟，其中使用具有針對含α，β-烯酸酯基團和伯氨基的分子的α，烯酸酯還原酶活性的酶，特別是使用具有針對6-氨基己-2-烯酸的α，烯酸酯還原酶活性的酶。在最優選的實施方式中，此類前體發酵在能體內形成6-氨基己-2-烯酸(6-ΑΗΕΑ)的微生物中進行。事實上，在這種情況下，根據本發明的6-ACA的形成是起始自任何合適碳源的向6-ACA的生物轉化。適合用于本發明方法的此類特殊實施方式的碳源是寡糖和二糖，例如，麥芽糖，β-半乳糖苷，蜜二糖，表蜜二糖(印imelibiose)，肌醇半乳糖苷，蜜二醇(melibitol)，半乳糖苷甘油和海藻糖(trehalose)，己糖，例如，D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-山梨糖和D-半乳糖，含有葡萄糖的溶液或漿體，淀粉，含有碳源的溶液或漿體，氨基糖，例如，N-乙酰-D-葡糖胺和D-葡糖胺，甲基戊糖，例如，L-海藻糖(fucose)和L-鼠李糖，戊糖和丙糖，例如，L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、木糖醇、D-來蘇糖、D-核糖、2-脫氧-2-D-核糖和二羥基丙酮，核苷和去氧核苷中的戊糖，例如，胞嘧啶核苷、去氧胞嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、去氧腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、黃嘌呤核苷、胸腺嘧啶脫氧核苷(去氧尿嘧啶核苷)，嘌呤(腺嘌呤、次黃嘌呤、鳥嘌呤核糖核苷)，heXur0nides，heXur0nates和己糖酸酯，例如D-葡9萄糖酸酯和D-半乳糖醛酸酯(D-galactonate)，磷酸化的糖和羧酸酯，例如己糖磷酸酯以及sn-甘油3-磷酸酯，二羧酸酯，例如琥珀酸酯、富馬酸酯和L-蘋果酸酯，三羧酸，多羥基化合物，例如，D-甘露糖醇、D-葡萄糖醇、D-山梨糖醇、半乳糖醇、衛矛醇、D-阿拉伯醇、核糖醇和木糖醇、甘油，二碳化合物，例如乙醇和乙酸酯，脂肪酸，.羥乙酸酯(glycolate)和乙醛酸酯(glyoxylate)以及甲醇，可食用油或任意上述化合物的混合物。最優選地，6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)是在體內從含有合適碳源的溶液或漿體形成的。此類合適的碳源可以選自葡萄糖、含有葡萄糖的溶液或漿體、(甲)乙醇、葡萄糖酸酯、戊糖、己糖、淀粉和脂肪酸的組。特別地，使用的碳源是葡萄糖。如上所述，因為對游離氧耐受的(并且因此可被描述為在空氣中穩定的)、具有針對6-AHEA的烯酸酯還原酶活性的酶是本發明范圍內優選的(即，在有氧條件下培養和/或使用的微生物中可被表達和使用的酶)，因此優選使用在有氧條件下可用的微生物。有氧條件下的生長效率(即，也是生物物質產量)以及相關(多種)酶和/或將被生產的物質產生的效率，通常比厭氧條件下的生長要高得多。例如，能獲得好得多的關于葡萄糖(或其它碳源)的產量。此類優點在，例如，通用手冊H.khlegel，Thieme,Germany(1981)的"AllgemeineMikrobiologie"中有所描述。此外，本發明涉及新穎的、通過生物化學方法生產的如本文所公開的物質，涉及由此獲得的、且12C比13C比14C同位素比例與環境二氧化碳中存在的值大致相同的產品，即，涉及通過生物化學方法生產的、具有與環境二氧化碳中存在的值大致相同的1V比"c比14C同位素比例的6-氨基己-2-烯酸；具有與環境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例的6-氨基-己酸；具有與環境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例的、從通過生物化學方法生產的6-羧基-6-氨基己-2-烯酸或6-氨基-己酸產生的ε-己內酰胺；涉及具有與環境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例的尼龍-6或其衍生物，所述尼龍-6是從通過生物化學方法生產的6-氨基己-2-烯酸或6-氨基-己酸，或從ε-己內酰胺產生的，所述ε-己內酰胺是從通過生物化學方法生產的6-氨基己-2-烯酸或6-氨基-己酸生產的。通過本文描述的方法，可以容易地鑒定出這些新穎的化合物，例如，通過MableIsotopeRatioMassSpectrometry(SIRMS)方法或通過由NMR進行的Site-SpecificNaturalIsotopeFractionation.這些新穎的化合物與從化石碳源通過化學合成獲得的、在現有技術文獻中有所描述的相應的化學結構和結構式明顯不同(即，它們的12C比13C比14C同位素比例方面)。下述實驗結果將對本發明加以詳述，但是，本發明并不被該實驗部分的方法或原理所限制。此外，應當清楚，通過類推，本發明將可用于從ω-氨基2-烯烴羧酸對更高級的α，ω-氨基羧酸進行生物合成(以及隨后對來自其的聚酰胺的生產)。例如，11-氨基-2-十一烯酸可以作為合成聚酰胺-11的起始化合物。用于通過處理其相應的α，β-不飽和羧酸來生產此類高級α，ω-氨基羧酸的實施方式被認落為在本發明權利要求的范圍內。I從4-氨基丁醛二乙縮醛來制備6-氨基己-2-烯酸出-AHEA)在R.Hamiltonetal.,Tet.Letters1993(34)，ρ·2847—2850，在P.Hughesetal.,J.Org.Chem.1994(59),p.5799-5802,以及在C.Stammeretal.,J.Org.Chem.1969(34)，p.2306-2311中分別描述了相關的反應步驟。在Dean-Stark條件下，4-氨基丁醛二乙縮醛(技術級，90%；202.4g,1130mmol)和鄰苯二甲酸酐(186g，1256mmol)在含有大約IOwt.%三乙胺(TEA;166g，1640mmol)的甲苯(1700ml)中進行4小時的反應。冷卻至室溫(RT)后，真空蒸發掉溶劑和多余的TEA。將殘余物溶解，在2MHCl水溶液QOOOml)和丙酮Q800ml)的混合物中回流20分鐘。冷卻至室溫后，真空移除丙酮，用CH2Cl2(h200ml)萃取殘余物。用2MHCl水溶液(3x200ml)和飽和NaHCO3水溶液(h200ml)來洗有機相。在Na2SO4上干燥溶液之后，通過真空蒸發掉CH2Cl2來分離4-鄰苯二甲酰亞氨基正丁醛G-phtalimidobutanal)。在真空下除濕器中于P2O5上干燥之后，獲得了MO.5g的4-鄰苯二甲酰亞氨基正丁醛(產率98%)。再將4-鄰苯二甲酰亞氨基正丁醛(120.9g，556mmOl)溶于600ml的CH2Cl2，用600mlCH2Cl2中的(三苯基正膦基亞基)乙酸甲酯(methyl(triphenylphosphoranylidene)acetate)(186g,556mmol)對其進行處理。1小時后，在真空下對混合物進行濃縮，分七等分進行色譜(MerckKieselgel60；7x14cm柱；用己烷中30%的乙酸乙酯進行洗脫)，得到了145.6g(96%)的甲基-6-鄰苯二甲酰亞氨基己-2-烯酸酯^-phtalimidohex-2_enoate)，其為白色固體。甲基-6-鄰苯二甲酰亞氨基己-2-烯酸酯(145.6g；533mmol)被溶于甲醇(900ml)，與1700ml蒸餾水中的71.6gNa0H(1790mmol)在室溫下攪拌8小時。用木炭處理溶液并過濾。用沈咖丨37%的HCl水溶液對濾出物進行酸化，然后回流3小時。冷卻至室溫后，將小量沉淀物過濾掉，將溶液在真空下濃縮至開始結晶。沉淀物被濾走，在真空下將溶液蒸發至干。用2-丙醇和乙酸乙酯的71(體積/體積)混合物(hSOOml)煮沸殘余物，以提取產物。過濾之后，真空下蒸發溶劑，殘余物從2-丙醇(385ml)中重結晶出來，得到了36.7g(42%)的6-氨基-己-2-烯酸HCl鹽。用250MHz匪R在CD3OD中進行測量得到的關于6-AHEA的匪R數據如下所示權利要求1.通過生物化學方法生產的6-氨基己-2-烯酸，具有與環境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例。2.通過生物化學方法生產的6-氨基-己酸，具有與環境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例。3.e-己內酰胺，其具有與環境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例，是從通過生物化學方法生產的6-氨基己-2-烯酸或6-氨基-己酸制造的。4.從如權利要求1或2所述通過生物化學方法生產的任何產品或從如權利要求3所述的e-己內酰胺制造的尼龍-6和其它衍生物，其具有與環境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例。全文摘要本發明涉及6-氨基己酸的生物化學合成。本發明涉及從6-氨基己-2-烯酸化合物或從6-氨基-2-羥基己酸來進行6-氨基己酸生物化學合成的方法，這是通過用具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶去處理含α，β-烯酸酯基團和伯氨基的分子來實現的。本發明還涉及獲得用于此類生物轉化過程的經過遺傳工程改造的合適的細胞的方法，以及涉及從能得到6-氨基己酸的中間產物進行的對6-氨基己酸的前體發酵。最后，本發明涉及一些新穎的通過生物化學方法生產的化合物，即，6-氨基己-2-烯酸、6-氨基己酸，以及涉及由此生產的己內酰胺，以及尼龍-6和來自此類生物化學方法生產的化合物或己內酰胺的其它衍生物。文檔編號C12P7/42GK102285893SQ201010151079公開日2011年12月21日申請日期2005年1月17日優先權日2004年1月19日發明者保羅·瑪麗亞·布朗特斯,彼得呂斯·馬蒂納斯·馬特烏斯·諾斯恩,斯蒂法恩·馬莉亞·安德勒·德威爾德曼,桑德拉·爾恩斯特,比托納拉·凱薩琳娜·拉伊馬克斯-弗蘭肯,韋南德·彼得·赫勒納·派特斯,馬丁·舒爾曼,馬塞爾·格哈杜斯·烏博爾特斯申請人:帝斯曼知識產權資產管理有限公司