專利名稱：小麥印度腥黑穗病菌檢測標準分子及其構建方法
技術領域：
本發明涉及一種口岸檢驗檢疫、農業生產、植物保護領域檢測用的標準分子，特別是涉及一種小麥印度腥黑穗病菌檢測用標準分子及其制備方法。
背景技術：
小麥印度腥黑穗病菌(Tilletiaindica Mitra 異名 Neovossia indica(Mitra) Mundkur)是一種擴散較快、危害性很大的病原真菌，已有40多個國家將其列為檢疫性有害生物(0ΕΡΡ/ΕΡΡ0，1980 ;CABI/EPP0，1992)。迄今為止，除原產地印度外，該病已在巴基斯坦、伊拉克、尼泊爾、阿富汗、墨西哥、南非和美國等地都有報道(Warham，1986 ；Singh et al. , 1989 ；Bonde et al.，1997)，成為威脅世界小麥生產和貿易的最具危險性的真菌病害之一。小麥印度腥黑穗病菌主要危害小麥(Triticum aestivum L.)，也可以危害硬質小麥(T. durum Desf.)。它不僅能引起小麥減產，使一些田塊的損失高達89% (Matsumoto et al.，1989)，還降低小麥種子的萌發率(Goel et al.，1992)，而且更重要的是影響小麥的品質(Singh et al.，1990)。小麥印度腥黑穗病的癥狀在田間不易被發現(Bonde et al., 1997)，通常對寄主造成局部侵染，沿腹溝在種皮下產生粉狀孢子堆，在籽粒表面形成皰斑； 只有感染嚴重時病粒的大部分或全部形成黑粉腔(Zhang et al.，1984)。對小麥印度腥黑穗病菌的鑒定，早期主要在于比較小麥印度腥黑穗病菌和水稻腥黑粉菌之間的區別。Aggarwal等、Peterson等分別對小麥印度腥黑穗病菌冬孢子形態特征進行研究，并建立形態學鑒定方法，但由于這些方法未包括美國于1997年報道的黑麥草腥黑粉菌，從而使該方法失去了應用價值。Castlebury等對小麥印度腥黑穗病菌和黑麥草上腥黑粉菌(當時還未定名)等近似種進行了比較形態學研究，認為小麥印度腥黑穗病菌與黑麥草上的腥黑粉菌冬孢子則在大小和顏色上較為接近。章桂明等對小麥印度腥黑穗病菌及其近似種在光學顯微鏡和掃描電鏡下冬孢子的形態特征進行了比較，認為小麥印度腥黑穗病菌與黑麥草腥黑粉菌非常接近，只獲得少量孢子的情況下難以從形態學方面將兩菌區另lj。1997年后，對小麥印度腥黑穗病菌檢測方法的研究主要集中在區分小麥印度腥黑穗病菌與黑麥草腥黑粉菌。在實際檢測過程中分子檢測方法需要設置陽性參考物質對照，以作為檢測結果判定和評價以及質量控制的依據，對分子檢測方法有重要意義。現階段小麥印度腥黑穗病菌分子檢測方法研究中所用的陽性參考物質通常是小麥印度腥黑穗病菌的基因組DNA。其抽提過程較復雜，制備不方便，抽提的基因組DNA穩定性也不能滿足長期及經常性使用的需要，并且由于不同檢測方法或檢測實驗室間所用的基因組DNA質量存在差異，從而制約了小麥印度腥黑穗病菌檢測標準及其它分子檢測方法的推廣應用。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種制備簡便、特異性強、具有良好均勻性和穩定性的小麥印度腥黑穗病菌檢測標準分子。本發明的另一目的在于提供上述標準分子的制備方法。
本發明的再一目的在于提供上述標準分子的檢測方法。為實現上述目的，本發明采用了以下技術方案本發明公開了一種小麥印度腥黑穗病菌檢測標準分子，所述標準分子為能夠進行復制的質粒，且所述質粒含有以下序列A和序列B中的至少一種，所述序列A與Genebank中編號為AF218059的序列99. 56%同源；所述序列B與Genebank中編號為AF399888的序列99. 85%同源；。在本發明具體的實施方式中，所述序列A為kq ID No. 1所示的序列，所述序列B Skq ID No. 2所示的序列。所述質粒優選為T載體，更優選為pMD19-T。本發明還公開了上述小麥印度腥黑穗病菌檢測標準分子的制備方法，所述方法包括以小麥印度腥黑穗病菌DNA為模板進行PCR擴增，所述PCR擴增的引物包括下述引物對 a和引物對b中的至少一對，將擴增得到的DNA序列轉化質粒，引物對a:Seq ID No. 3 5' -TGGGCTGAGTCTGAGATGC-3‘Seq ID No. 4 5' -AGTAATACCTGCGTCTCATAGC-3‘引物對b:Seq ID No. 5 5' -TAGGTACCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘Seq ID No. 6 5' -GTTCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3‘。在本發明具體的實施方式中，是采用所述引物對a和引物對b分別進行PCR擴增， 將引物對a擴增得到的片段與pMD19-T載體進行連接，將連接后得到的重組子以及引物對b 擴增得到的片段分別用限制性內切酶)(bal和KpnI進行雙酶切，分別回收酶切產物的大片段，將回收的片段進行連接。本發明還公開了上述小麥印度腥黑穗病菌檢測標準分子的檢測方法，所述方法包括，利用特異性檢測引物和探針，以所述標準分子為模板進行實時熒光PCR反應，并且所述探針5'端和3'端分別標記有熒光報告基團和熒光淬滅基團。所述特異性檢測引物分別含有kq ID No. 7和kq ID No. 8所示的序列，探針含有kq ID No. 9所示的序列Seq ID No. 7 5' -AGCCATCACTGGAGTTGTCATG-3‘5 ‘ -CCCAGCAAGGTCACCTTTGA-3‘ 5 ‘ -CCGACCGTATCGGTCT-3‘由于采用了以上技術方案，使本發明具備的有益效果在于利用本發明的方法制備得到的小麥印度腥黑穗病菌檢測標準分子，具有可以長期穩定保存、高拷貝數、易獲得、純度高和制備方便等特點，并且制備簡便、特異性強、具有良好的均勻性和穩定性，可以替代小麥印度腥黑穗病菌的基因組DNA用于小麥印度腥黑穗病菌的定性PCR、定量PCR檢測及分析，解決了小麥印度腥黑穗病菌檢測中標準分子缺乏的難題。該標準分子適合于口岸檢驗檢疫、農業生產、植物保護等部門使用。Seq ID No. 8Seq ID No. 9
圖1為本發明所述標準分子示意圖。圖2為以引物SZFP254-1、SZFP254-2和探針SZFPb255對本發明所述標準分子以及小麥印度腥黑穗病菌基因組DNA的實時熒光PCR特異性檢測結果圖。圖3為以引物SZFP254-1、SZFP254-2和探針SZFPb255對本發明所述標準分子的實時熒光PCR靈敏度檢測結果圖。圖4為以引物SZFP254-1、SZFP254-2和探針SZFPb255對本發明所述標準分子的實時熒光PCR擴增標準曲線。圖5為本發明所述標準分子測序結果與網上公布的小麥印度腥黑穗病菌及其近似種線粒體2. 3kb序列比對結果。圖6為本發明所述標準分子測序結果與網上公布的小麥印度腥黑穗病菌及其近似種ITS序列比對結果。
具體實施例方式以下實施例僅僅對本發明進行進一步的說明，不應理解為對本發明的限制。實施例1小麥印度腥黑穗病菌檢測標準分子的構建一、實驗材料1、供試菌株小麥印度腥黑穗病菌截獲來自印度、巴西和墨西哥小麥，黑麥草腥黑粉菌截獲來自美國小麥，上述供試菌株均由深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術研究中心保存 (表 1)。表1供試菌株
菌林編號種名種學名來源采集曰期
Szf76小麥印度股黑穗病菌Tillemindica印度1997
Szf79*小麥印度腥黑穗病菌Tilletia indica巴西2001Szf80小麥印度腥黑穗病菌Tilletia indica墨西哥1997 Szf82小麥印度腥黑穗病菌Tilletia indica印度2001 Szf85 黑麥草腥黑粉菌Tilletiawalkeri美國2000 Szf86 黑麥草腥黑粉菌Tilletiawalkeri美國1999注標“*”為本研究用于克隆的菌株。2、實驗材料限制性內切酶Xbal，KpnI以及限制性內切酶緩沖液，pMD19_T載體，T4DNA連接酶及其緩沖液，dNTPs, Taq DNA聚合酶及其緩沖液、DL2000Marker，Agarose Gel DNA Purification Kit 和 MiniBEST Plasmid Purification Kit 購自大連寶生物工程有限公司。DH5ci感受態細胞購自北京天根生物公司。TaqMan探針及引物由上海超世生物科技有限公司合成。其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。
二、實驗儀器DY-8型核酸電泳儀(北京六一儀器有限公司)，Biometra Grident PCR儀， Syngene凝膠成像系統，其他儀器包括離心機，恒溫水浴鍋，培養箱，天平等。三、制備方法1、序列獲得在GenBank中搜索小麥印度腥黑穗病菌及其近似種線粒體2. 3kb片段序列和核糖體內轉錄間隔區序列。2、引物設計根據獲得的線粒體2. 31Λ片段序列和核糖體內轉錄間隔區序列，利用軟件ft"imer premier 5. 0設計PCR擴增引物(表2)。表2供試引物
權利要求
1.一種小麥印度腥黑穗病菌檢測標準分子，其特征在于所述標準分子為能夠進行復制的質粒，且所述質粒含有以下序列A和序列B中的至少一種，所述序列A為Seq ID No. 1所示序列； 所述序列B為Seq ID No. 2所示序列。
2.根據權利要求1所述的標準分子，其特征在于所述序列A為SeqIDNo. 1所示序列與Genebank中編號為AF218059的小麥印度腥黑穗病菌2. 3kb序列99. 56%同源；所述序列B為Seq ID No. 2所示序列與編號為AF399888的小麥印度腥黑穗病菌ITS序列99. 85% 同源。
3.根據權利要求1 2任意一項所述的標準分子，其特征在于所述質粒為T載體。
4.根據權利要求3所述的標準分子，其特征在于所述T載體為pMD19-T。
5.權利要求1 4任意一項所述的小麥印度腥黑穗病菌檢測標準分子的制備方法，所述方法包括以小麥印度腥黑穗病菌DNA為模板進行常規PCR擴增，所述PCR擴增的引物包括下述引物對a和引物對b中的至少一對，將擴增得到的DNA序列轉化質粒，引物對a:Seq ID No. 3:5' -TGGGCTGAGTCTGAGATGC-3‘ Seq ID No. 4:5' -AGTAATACCTGCGTCTCATAGC-3‘ 引物對b :Seq ID No. 5:5' -TAGGTACCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘ SeqIDNo. 6:5' -GTTCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3‘。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于采用所述引物對a和引物對b分別進行PCR擴增，將引物對a擴增得到的片段與PMD19-T載體進行連接，將連接后得到的重組子以及引物對b擴增得到的片段分別用限制性內切酶XbaI和KpnI進行雙酶切，分別回收酶切產物的大片段，將回收的片段進行連接。
7.權利要求1 4任意一項所述的小麥印度腥黑穗病菌檢測標準分子的檢測方法，所述方法包括，利用特異性檢測引物和探針，以所述標準分子為模板進行實時熒光PCR反應， 并且所述探針5'端和3'端分別標記有熒光報告基團和熒光淬滅基團。所述特異性檢測引物分別含有Seq ID No. 7和Seq ID No. 8所示的序列，探針含有Seq ID No. 9所示的序列Seq ID No. 7:5' -AGCCATCACTGGAGTTGTCATG-3‘ Seq ID No. 8:5' -CCCAGCAAGGTCACCTTTGA-3‘ Seq ID No. 9:5' -CCGACCGTATCGGTCT-3‘。
全文摘要
本發明公開了一種小麥印度腥黑穗病菌檢測標準分子，為能夠進行復制的質粒，所述質粒中含有序列A和B中至少一種，A(Seq ID No.1)與小麥印度腥黑穗病菌線粒體DNA上一段2.3kb的核酸序列(AF218059)同源性為99.56％，B(Seq ID No.2)與小麥印度腥黑穗病菌核糖體內轉錄間隔區的DNA序列(AF399888)同源性為99.85％。本發明還公開了上述標準分子的制備和檢測方法。本發明構建的標準分子可以代替小麥印度腥黑穗病菌DNA作為小麥印度腥黑穗病菌分子檢測的陽性對照，適用于對小麥印度腥黑穗病菌的定性PCR和定量PCR檢測，適合于口岸檢驗檢疫、農業生產、植物保護等。
文檔編號C12N15/11GK102212518SQ20101014898
公開日2011年10月12日 申請日期2010年4月6日 優先權日2010年4月6日
發明者向才玉, 李小焦, 王穎, 程穎慧, 章桂明, 陳枝楠 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心, 深圳市檢驗檢疫科學研究院