專利名稱：?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特菌熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種食品安全技術(shù)領(lǐng)域的試劑盒及檢測(cè)方法，具體是一種單核細(xì)胞增 生李斯特菌(Listeria monocytogenes)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
李斯特菌是革蘭氏陽性無芽孢桿菌，該屬內(nèi)共有7種菌(單核細(xì)胞增生李斯特菌 (Listeriamonocytogenes)、綿羊李其jf特菌(L. ivanovii)、墨氏李其jf特菌(L. murrayi)、西 爾李斯特菌(L. seeligeri)、格氏李斯特菌(L. grayi)、威爾氏李斯特菌(L. welshimeri)、 英諾克李斯特菌(L. irmocua))，其中僅單核細(xì)胞增生李斯特菌對(duì)人有致病性，是一種人畜 共患病的病原菌，中毒癥狀嚴(yán)重，除了常見的嘔吐、腹瀉等胃腸道表現(xiàn)外，還可以侵蝕人體 中樞神經(jīng)系統(tǒng)(主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)等疾病)，對(duì)機(jī)體造成極大的傷害。人類李 斯特菌病的大多數(shù)病例分為零散性發(fā)生，爆發(fā)性發(fā)生或二者兼而有之。其發(fā)病率雖不高，但 致死率可高達(dá)20% 30%。孕婦、新生兒、老年人和免疫缺陷者是易感人群。它在自然界 廣泛分布，蔬菜、乳制品、海產(chǎn)品、肉類和禽類等食品中都已證實(shí)是李斯特菌的傳播載體，它 可在4°C的環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。近年發(fā)展起來的熒光定量PCR (Fluorescence Quantitative，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)以其靈 敏度高、速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在基因表達(dá)水平分析(如Walker CG，Meier S，Mitchell MD等在《BMC Molecular Biology》(BMC分子生物學(xué))2009年第10卷第100頁發(fā)表的題 為((Evaluationof real-time PCR endogenous control genes for analysis of gene expression in bovineendometrium》(實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析牛子宮內(nèi)膜內(nèi)源控制基 因的表達(dá))一文中所述的)和病原體的定性定量檢測(cè)(如Zago M，Bonvini B, Carminati D等在《Systematic and AppliedMicrobiology))(系統(tǒng)與應(yīng)用微生物學(xué))2009第32卷第 514 521 頁發(fā)表白勺題為((Detection andquantification of Enterococcus gilvus in cheese by real-time PCR》(熒光定量PCR法定性定量檢測(cè)奶酪中的腸球菌)一文中所述 的)等方面得到廣泛應(yīng)用。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，陳慧燕等發(fā)表于《中國熱帶醫(yī)學(xué)》2006年第6卷第 770 772頁的題為《食品中李斯特菌檢測(cè)方法探討及藥敏結(jié)果分析》的文章。該技術(shù)通過 對(duì)8類食品45件樣品的檢測(cè)，其采用的國標(biāo)法以及改良方法需要制備培養(yǎng)基、計(jì)算菌落數(shù) 量和鑒定菌落的生化特性等，耗時(shí)較長(zhǎng)，操作繁瑣；其采用的Mini VIDAS法檢出率較低，檢 測(cè)靈敏度不高。因此該現(xiàn)有技術(shù)并不適合當(dāng)前食品快速檢測(cè)的需求。目前常規(guī)鑒定單核細(xì)胞增生李斯特菌的方法以常規(guī)培養(yǎng)方法為主(可見標(biāo)準(zhǔn)GB/ T4789. 30-2003)，根據(jù)生化特性、致病力及協(xié)同溶血試驗(yàn)等進(jìn)行鑒定，鑒定周期需要5 10 天。免疫學(xué)方法較快，但單克隆抗體制備困難，易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，特異性差。常規(guī)PCR方法 雖然具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏的優(yōu)勢(shì)，但是有不能精確定量和PCR后處理產(chǎn)生污染導(dǎo)致的假陽 性等問題，因此亟待開發(fā)精確、靈敏、快速、無污染的快速檢測(cè)方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種單核細(xì)胞增生李斯特菌熒光定量 PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。本發(fā)明的試劑盒可用于單核細(xì)胞增生李斯特菌的定性和定量 檢測(cè)；本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)特異性高，檢測(cè)靈敏度高，定量準(zhǔn)確，檢測(cè)速度快。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明涉及一種單核細(xì)胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，包括熒光定 量PCR反應(yīng)液、熒光探針、熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；所述的熒光定量PCR反應(yīng)液具體為10XPCR buffer、Mg2+、dNTPs、正向引物、反向 引物；其中正向引物的堿基序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物的堿基序列如SEQ ID No. 2 所示；所述的熒光探針的堿基序列如SEQ ID NO :3所示，其中，熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，熒 光淬滅基團(tuán)為ELIPCE ；所述的標(biāo)準(zhǔn)陽性模板為重組質(zhì)粒的DNA，該重組質(zhì)粒的質(zhì)粒為pMD18-T，整合的基 因的堿基序列如SEQ ID No. 4所示；所述的陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為沙門氏菌、副溶血弧菌或金黃色葡萄球菌DNA等。優(yōu)選地，所述的熒光定量PCR反應(yīng)液的組分為按體積比，2體積的10XPCR buffer, 1體積的5 u mol/L的正向引物，1體積的5 u mol/L的反向引物，1. 5體積的25mM的 MgCl2,1. 5 體積的 25mM dNTPs。本發(fā)明涉及上述單核細(xì)胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，包 括以下步驟①采用常規(guī)方法提取待測(cè)樣品DNA為模板，②用單核細(xì)胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得反應(yīng)產(chǎn)物，③將反應(yīng)產(chǎn)物置于定量PCR儀中進(jìn)行熒光檢測(cè)，④對(duì)樣品中單核細(xì)胞增生李斯特菌進(jìn)行定性檢測(cè)或定量檢測(cè)。所述的定性檢測(cè)具體為選擇熒光檢測(cè)模式為FAM熒光，基線調(diào)整取3 15個(gè)循 環(huán)的熒光信號(hào)，設(shè)定閾值線，若待測(cè)樣品熒光增長(zhǎng)曲線超過閾值線，并呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，則判斷 為陽性，即樣品中存在單核細(xì)胞增生李斯特菌，否則則樣品中不存在單核細(xì)胞增生李斯特 菌；所述的定量檢測(cè)具體為設(shè)定梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)陽性模板，采用與步驟二的PCR擴(kuò) 增相同的反應(yīng)體系和參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐 標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品測(cè)得的Ct值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到樣品單核細(xì)胞增生李斯特菌 的含量。 所述的PCR擴(kuò)增中，20 ill的PCR反應(yīng)體系組成如下模板DNA 2u l,5U/u 1的熱 啟動(dòng)TaqDNA聚合酶0.2 iil，5 ii mol/L熒光探針0. 4 yl，熒光定量PCR反應(yīng)液10iU，陰性 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品7.4iU。所述的PCR反應(yīng)的參數(shù)為95°C 15S，95°C 5S，65°C 34S ；45個(gè)循環(huán)。本發(fā)明的單核細(xì)胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒中有一條兩端標(biāo)記有 熒光基團(tuán)的特異性熒光探針，在探針完整時(shí)，兩基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上距離相互靠近，5'端報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光因?yàn)闊晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移(FRET)而被3'端淬滅基團(tuán)淬滅，故體系中沒有 熒光信號(hào)變化。在PCR退火和延伸過程中，探針和模板特異性結(jié)合，隨著引物的延伸，熱啟 動(dòng)Taq DNA聚合酶利用其5' -3'外切活性對(duì)探針進(jìn)行切割釋放出報(bào)告基團(tuán)，這樣破壞了 兩基團(tuán)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，報(bào)告基團(tuán)所釋放的熒光可以被內(nèi)置在定量檢測(cè)儀 內(nèi)的熒光計(jì)檢測(cè)，熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈比例關(guān)系。對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特 菌的定量可通過與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值相比較得出。Ct值是PCR過程中，熒光量的積累超過 基底熒光量的循環(huán)個(gè)數(shù)，Ct值與起始模數(shù)呈一定比例關(guān)系，Ct值越小，起始模板數(shù)越多，相 反，Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用陽性梯度標(biāo)準(zhǔn)模板的Ct值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待 測(cè)樣品的Ct值可準(zhǔn)確測(cè)出該樣品的起始拷貝數(shù)。本發(fā)明的試劑盒可用于單核細(xì)胞增生李斯特菌的定性和定量檢測(cè)；本發(fā)明的試劑 盒檢測(cè)特異性高，降低了常規(guī)PCR方法的假陽性率；檢測(cè)靈敏度高，定量準(zhǔn)確；利用本發(fā)明 的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，速度快，僅需1小時(shí)，加上樣品DNA的提取制備時(shí)間，總體檢測(cè)時(shí)間可控 制在3小時(shí)以內(nèi)。
圖1是實(shí)施例中試劑盒檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株特異性結(jié)果圖；圖2是實(shí)施例中試劑盒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA模板等比例稀釋結(jié)果；圖3是實(shí)施例中試劑盒的熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。實(shí)施例本實(shí)施例涉及的單核細(xì)胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的組分為(均購自寶生物工程(大連)有限公司)熒光定量PCR反應(yīng)液，熒光探針(51^，1111)，熱啟動(dòng)！~叫0嫩聚合酶(5U/iU， 0. 2ul)，標(biāo)準(zhǔn)陽性模板，陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；所述的熒光定量PCR 反應(yīng)液具體為10XPCR buffer 2ul、25mM MgCl2l. 5ul、 2. 5mM dNTPsl. 5ul、正向引物(5 y M，lul)、反向引物(5 u M, lul)；其中正向引物的堿基序 列如SEQIDNo. 1所示，反向引物的堿基序列如SEQID No. 2所示；所述的熒光探針的堿基序列如SEQID NO :3所示，其中，熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，熒光 淬滅基團(tuán)為ELIPCE ；所述的標(biāo)準(zhǔn)陽性模板為重組質(zhì)粒的DNA，該重組質(zhì)粒的質(zhì)粒為pMD18T，整合的基 因的堿基序列如SEQ ID No. 4所示；(濃度為109拷貝/ yl標(biāo)準(zhǔn)陽性模板pM-Lm)所述的陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品沙門氏菌、副溶血弧菌或金黃色葡萄球菌DNA等。利用所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，包括如下步驟步驟一，DNA模板的制備參考菌株培養(yǎng)及制備
李斯特菌參考菌株單核細(xì)胞增生李斯特菌Listeria monocytogenes (ATCC BAA-751、ATCC13313、ATCC13932、ATCC 7644、ATCC 27708、CMCC54002、CMCC54003、CCTCC AB97021)；綿羊李斯 特菌 L. ivanovii(CCTCC AB97016)；西爾李斯特菌 L. seeligeri (CCTCC AB97018)、格氏李 斯特菌 L. grayi (CCTCCAB97017、CCTCC AB97019)、威爾氏李斯特菌 L. welshimeri (CCTCC AB97020)和英諾克李斯特菌 L. innocua (CCTCC AB97022)；非李斯特菌屬菌株金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus (ATCC13565)、沙門氏 菌 Salmonella(ATCC10708)、弧菌 Vibrio(ATCC27562)、變形桿菌 Bacillus proteus(ATCC12453)、痢疾志賀氏菌 Shigella dysenteriae (CMCC51335)、藤黃八疊 球菌 Sarcina lutea (ATCC9341)、陰溝腸桿菌 Enterobacter cloacae (ATCC700323)、 糞腸球菌 Enterococcus faecalis (ATCC49452)、月市炎鏈球菌 Sti^ptococcus pneumoniae (ATCC27336)、大腸桿菌 Escherichiacoli 0157 :H7 (ATCC43889)、枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis (ATCC6633)、弗氏檸檬酸桿菌 Citrobacter freundii (ATCC8090)和沙 雷氏菌 Serratia liquefaciens (ATCC27592)。(注ATCC 美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所；CMCC 中 國醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心；CCTCC 中國典型培養(yǎng)物保藏中心)DNA的提取取菌懸液1ml，充分震蕩搖勻，轉(zhuǎn)至1. 5ml離心管中，10，OOOg離心 5min,重復(fù)洗滌1次，再次離心后采用試劑盒(上海奧潤(rùn)微納新材料科技有限公司)提取 DNA,取2ul做PCR反應(yīng)，提取的DNA模板在_20°C貯存?zhèn)溆?。步驟二，熒光定量PCR反應(yīng)反應(yīng)體系如下成分加樣量(μ )模板 DNA2熱啟動(dòng)TaqDNA 聚合酶(5U/ μ 1)0. 2熒光探針(5ymol/L)0.4熒光定量PCR反應(yīng)液10陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品7. 4總體積20PCR 反應(yīng)參數(shù)如下95°C 15S，95°C 5S，65°C 34S ；45 個(gè)循環(huán)。儀器ABI7500熒光定量PCR儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。步驟三，定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將標(biāo)準(zhǔn)陽性模板10倍倍比稀釋成IO9 IO1拷貝/ μ 1的濃度梯度，在上述反應(yīng) 條件下每個(gè)濃度平行加入3個(gè)反應(yīng)管同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后采用ABI 7500Software v2. 0. 1軟件分析。如圖3所示，起始模板在IO7-IO1拷貝/ μ 1線性良好，得到線性回歸方 程:y = -3. 914X+41. 718，R2 = 0. 999。步驟四，敏感性及特異性測(cè)定取單核細(xì)胞增生李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株儲(chǔ)備液提取基因組DNA后，按照10倍比例稀 釋，用熒光定量PCR分析，以確定最低下限。取綿羊李斯特菌、墨氏李斯特菌、西爾李斯 特菌、格氏李斯特菌、威爾氏李斯特菌、英諾克李斯特菌以及金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等非李斯特菌株儲(chǔ)備液提取DNA后分析檢測(cè)。結(jié)果如圖2所示，其中1 6分別為濃度 為 5. 4 X 106CFU/ml，5. 4 X 105CFU/ml，5. 4 X 104CFU/ml，5. 4 X 103CFU/ml，5. 4 X 102CFU/ml， 5. 4 X IO1CFUAiI的標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA，7是陰性對(duì)照。由圖2可知，標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA等 比例稀釋，Q-PCR結(jié)果呈現(xiàn)規(guī)律的Ct值變化，說明儀器參數(shù)穩(wěn)定，最低檢測(cè)下限達(dá)到67CFU/ ml。單核細(xì)胞增生李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株呈陽性擴(kuò)增，綿羊李斯特菌等及金黃色葡萄球菌等非 李斯特菌的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，與預(yù)期結(jié)果完全相同，無非特異性擴(kuò)增。步驟五，重復(fù)性測(cè)定將標(biāo)準(zhǔn)陽性模板10倍系列稀釋，在上述反應(yīng)條件下進(jìn)行擴(kuò)增。循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)用 儀器自帶軟件，讀取待檢樣品拷貝數(shù)。結(jié)果為單核細(xì)胞增生李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)陽性模板IO7拷 貝/μ1、106拷貝/μ1、105拷貝/μ1、104拷貝/μ1、103拷貝/μ 的Ct值分別為13.12， 16. 96，20. 97，25. 00，28. 88 ；陰性對(duì)照為0。反復(fù)重復(fù)試驗(yàn)3次，得到Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 Ρ>0. 05，數(shù)據(jù)差異無顯著意義，說明其不同批次之間的檢測(cè)結(jié)果具有可比性，具有良好的 重復(fù)性。由本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可證實(shí)，利用本實(shí)施例的試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR方法定 量重復(fù)性好，定量準(zhǔn)確，而且熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品的檢測(cè)僅需2小時(shí)就可完成， 傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法全過程需要4 7天，使用本實(shí)施例的試劑盒可大大縮短檢測(cè)時(shí)間，且操作 過程僅需1人即可。
權(quán)利要求
一種單核細(xì)胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，包括熒光定量PCR反應(yīng)液、熒光探針、熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于所述的熒光定量PCR反應(yīng)液具體為10×PCR buffer、Mg2+、dNTPs、正向引物、反向引物；其中正向引物的堿基序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的堿基序列如SEQ ID No.2所示；所述的熒光探針的堿基序列如SEQ ID NO3所示，其中，熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，熒光淬滅基團(tuán)為ELIPCE；所述的標(biāo)準(zhǔn)陽性模板為重組質(zhì)粒的DNA，該重組質(zhì)粒的質(zhì)粒為pMD18-T，整合的基因的堿基序列如SEQ ID No.4所示；所述的陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為沙門氏菌、副溶血弧菌或金黃色葡萄球菌DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單核細(xì)胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征 是，所述的熒光定量PCR反應(yīng)液的組分為按體積比，2體積的10XPCR buffer，1體積的 5 u mol/L的正向引物，1體積的5 u mol/L的反向引物，1. 5體積的25mM的MgCl2，1. 5體積 的 25mM dNTPs。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的單核細(xì)胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的檢測(cè) 方法，其特征在于，包括以下步驟①采用常規(guī)方法提取待測(cè)樣品DNA為模板，②用單核細(xì)胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得反應(yīng)產(chǎn)物，③將反應(yīng)產(chǎn)物置于定量PCR儀中進(jìn)行熒光檢測(cè)，④對(duì)樣品中單核細(xì)胞增生李斯特菌進(jìn)行定性檢測(cè)或定量檢測(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單核細(xì)胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方 法，其特征是，所述的PCR擴(kuò)增中，20iU的PCR反應(yīng)體系組成如下模板DNA 2u l,5U/u 1 的熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶0.2 iil，5 ii mol/L熒光探針0. 4 yl，熒光定量PCR反應(yīng)液10 yl， 陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品7.4 yl。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單核細(xì)胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方 法，其特征是，所述的PCR反應(yīng)的參數(shù)為95°C 15S，95°C 5S，65°C 34S;45個(gè)循環(huán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單核細(xì)胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方 法，其特征是，所述的定性檢測(cè)為選擇熒光檢測(cè)模式為FAM熒光，基線調(diào)整取3 15個(gè)循 環(huán)的熒光信號(hào)，設(shè)定閾值線，若待測(cè)樣品熒光增長(zhǎng)曲線超過閾值線，并呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，則判斷 為陽性，即樣品中存在單核細(xì)胞增生李斯特菌，否則則樣品中不存在單核細(xì)胞增生李斯特 菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單核細(xì)胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方 法，其特征是，所述的定量檢測(cè)為設(shè)定梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)陽性模板，采用與PCR擴(kuò)增相同的 反應(yīng)體系和參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo) 準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品測(cè)得的Ct值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到樣品單核細(xì)胞增生李斯特菌的含量。
全文摘要
一種食品安全技術(shù)領(lǐng)域的增生李斯特菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，其中的試劑盒包括熒光定量PCR反應(yīng)液、熒光探針、熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；本發(fā)明通過采用常規(guī)方法提取待測(cè)樣品DNA，并以所得DNA為模板，利用單核細(xì)胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得反應(yīng)產(chǎn)物，之后將反應(yīng)產(chǎn)物置于定量PCR儀中進(jìn)行熒光檢測(cè)，對(duì)樣品中單核細(xì)胞增生李斯特菌進(jìn)行定性檢測(cè)或定量檢測(cè)。本發(fā)明的試劑盒可用于單核細(xì)胞增生李斯特菌的定性和定量檢測(cè)；本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)特異性高，檢測(cè)靈敏度高，定量準(zhǔn)確，檢測(cè)速度快。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101805799SQ201010148950
公開日2010年8月18日 申請(qǐng)日期2010年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月17日
發(fā)明者史賢明, 張丹丹, 施春雷, 王大鵬, 龍飛 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)