專利名稱：小麥抗氧化相關基因及其編碼蛋白與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程領域。具體地，本發明涉及與小麥抗光抑制和光氧化相關的硫氧化還原因子蛋白及其編碼序列，包括該基因的克隆、表達模式及應用。
背景技術：
生物體內存在著大量的活性氧類物質，這類物質有兩種重要的作用。第一低含量的活性氧可以作為信號分子調控細胞分裂、細胞分化等重要生理過程1 ；第二 大量的活性氧可以造成蛋白、DNA以及膜脂的損害進而造成細胞的死亡2。生物在生命過程中往往很容易產生大量的活性氧，因此，清除過量的活性氧對生物體而言十分重要。Peroxiredoxin (PRX,過氧化物還原因子)作為一類廣泛存在的過氧化物酶可以參與各類活性氧的清除。在哺乳動物中，根據PRX中保守半胱氨酸的數目和位置可以把PRX 分為 lCys-PRX，2Cys-PRX 和非典型 2Cys-PRX3 ；植物中則分為 ICys-PRX，2Cys_PRX，PRX Q和 II類PRX4。2Cys_PRX的C端Cys殘基參與清除活性氧的過程中可以依次被氧化成次磺酸形式、亞磺酸形式和磺酸形式。當2Cys_PRX的C端Cys殘基成為亞磺酸形式的時候，需要 Sulfired0Xin(SRX，硫氧化還原因子)在鎂離子和ATP參與下幫助其恢復還原活性5，并且 SRX這種還原作用只特異地對2Cys-PRX進行6’7。目前在動物細胞中已經分離結晶到人類的SRX與2Cys-PRX的復合體，它們形成四聚體之后又進一步聚合成為十聚體形式存在8，并且SRX、2Cys-PRX、二價鎂離子、ATP形成一個四聚體幫助ATP攻擊2Cys_PRX的亞磺酸形式的C端Cys殘基開始第一步催化反應9。植物中對SRX和2Cys_PRX的研究在擬南芥中進行地較為深入7’1Q。擬南芥中 At2Cys-PRXA和At2Cys-PRX B兩個蛋白都存在于葉綠體當中，SRX成熟蛋白也定位在葉綠體當中，并且二者之間在存在特異的互相作用。植物的葉綠體是植物體內最主要的活性氧產生源頭之一，葉綠體內活性氧的積累可以造成光抑制和光漂白“。在擬南芥atsrx 缺失突變體中，葉綠體光合系統發生光抑制的程度大大增加，同時抗光漂白能力也很大程度的下降。體外的實驗證實AtSRX在二價鎂離子和ATP的參與下可以還原亞磺酸形式的 At2Cys-PRXA/B ；同時在各種引起活性氧爆發的脅迫條件下AtSRX的表達量都明顯增加。因此SRX在葉綠體的光合系統保護方面起著重要的作用12。六倍體普通小麥(小麥，亞基因組組分為AABBDD)是世界上最重要的糧食作物之一，由小麥面粉所制備的各類產品(如面包、饅頭、面條等)是廣大民眾的日常食品。隨著世界人口的大幅度增加和面食的廣泛推廣，小麥的需求量與日俱增。增加小麥的產量中核心的問題是改良小麥的光合作用，即培養高光效的、耐光脅迫性強的、抗逆性強的小麥品種 13O我們研究普通小麥小偃54 (XY54)中TaSRX及其編碼基因正是基于這個目的，深入揭示小麥耐光脅迫機制，通過轉基因獲得耐光脅迫性強和抗逆性強的高光效高產小麥。這對于普通小麥的遺傳改良有著極其重要的理論和實際意義
發明內容
本發明人通過比對擬南芥和水稻等的SRX基因的EST序列，用同源克隆的方式從六倍體普通小麥小偃54(XY54)的基因組DNA中克隆到三個全長的TaSRX的部分同源基因， 分別命名為TaSRX-A、TaSRX-B、TaSRX-D，并且克隆到了這三個基因的cDNA全長序列。它們的全基因序列分別為1866bp、1972bp、2101bp ；全長編碼框都是465bp ；都編碼154個氨基酸的蛋白。三個蛋白都含有植物中SRX特異的FSGCHR酶活中心氨基酸序列；都定位于葉綠體當中，都可以和At2CPRXA/B相互作用。本發明旨在探索SRX同源基因在小麥中的功能，闡明TaSRX是否參與小麥葉綠體光合系統的保護，是否參與小麥抗光抑制和光氧化的過程， 是否在小麥中有功能分化，以及在不同遺傳背景下功能是否有強弱之分。首先，我們研究了 TaSRX基因在小麥不同器官中的轉錄水平表達模式，并認真分析了每個拷貝特異的表達模式，發現它們主要表達在幼葉和旗葉；利用病毒介導的小麥內源基因沉默技術研究對比六倍體普通小麥小偃54(XY54)和京411(J411)葉片光合系統在 SRX基因部分的情況下發生光抑制程度的變化，分析基因功能的同時比較基因功能在不同遺傳背景下的變化；利用病毒介導外源基因過表達技術在煙草葉片中分別過表達三個拷貝，分析三個拷貝的抗氧化功能強弱分化以及對煙草生物量有無影響。我們建立起一套獨特的分析小麥重要基因功能分析的辦法首先是先得到基因， 可以明確而有針對性地對該基因開展研究；其次是利用病毒介導的轉錄后沉默和過表達技術分析基因功能和分化，而無需進行圖位克隆。本發明揭示了小麥TaSRX基因的抗氧化功能，保護光合系統免除光抑制和光氧化的功能及其分化；證實了該基因在不同的遺傳背景下發揮作用的程度不同；同時該基因的表達可以增加植物的生物量。這些表明TaSRX基因可被用于培養高光效耐逆小麥的分子改良，前景廣闊。具體內容如下1. 一種小麥抗氧化相關基因TaSRX-A，其包含下列核苷酸序列之一序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；序列表中SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列；編碼序列表中SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和與SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列具有90%以上同一性且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列。2. 一種小麥抗氧化相關基因TaSRX-B，其包含下列核苷酸序列之一序列表中SEQ ID N0. 2所示的核苷酸序列；序列表中SEQ ID N0. 8所示的核苷酸序列；編碼序列表中SEQ ID N0. 5所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和與SEQ ID N0. 2或SEQ ID N0. 8所示的核苷酸序列具有90%以上同一性且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列。3. 一種小麥抗氧化相關基因TaSRX-D，其包含下列核苷酸序列之一序列表中SEQ ID N0. 3所示的核苷酸序列；序列表中SEQ ID N0. 9所示的核苷酸序列；編碼序列表中SEQ ID N0. 6所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和與SEQ ID N0. 3或SEQ ID N0. 9所示的核苷酸序列具有90%以上同一性且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列。4.小麥抗氧化相關蛋白TaSRX-A，其選自以上1中的小麥抗氧化相關基因TaSRX-A所編碼的蛋白質；或在SEQ ID NO. 4的氨基酸序列經過取代、缺少或添加一個或多個氨基酸且具有與 SEQ ID NO. 4的氨基酸序列相同功能的由SEQ ID NO. 4衍生的氨基酸序列。5.小麥抗氧化相關蛋白TaSRX-B，其選自以上2中的小麥抗氧化相關基因TaSRX-B所編碼的蛋白質；或在SEQ ID NO. 5的氨基酸序列經過取代、缺少或添加一個或多個氨基酸且具有與 SEQ ID NO. 5的氨基酸序列相同功能的由SEQ ID N0. 5衍生的氨基酸序列。6.小麥抗氧化相關蛋白TaSRX-D，其選自以上3中的小麥抗氧化相關基因TaSRX-D所編碼的蛋白質；或在SEQ ID N0. 6的氨基酸序列經過取代、缺少或添加一個或多個氨基酸且具有與 SEQ ID N0. 6的氨基酸序列相同功能的由SEQ ID N0. 6衍生的氨基酸序列。7.含有以上1-3中任一項所述基因的表達載體。8.以上7中所述的表達載體，其中所述載體是雙元農桿菌載體。9.含有以上7或8中所述的表達載體的細胞系。10.以上1-3中任一項所述的基因在調節植物抗氧化功能或在保護光合系統免除光抑制和光氧化功能中的應用。11.以上10中所述的應用，其中所述植物是小麥，優選是六倍體普通小麥，如小偃 54 (XY54)、京411 (J411)、Langdon、烏拉爾圖小麥和山羊草。12. 一種分析小麥基因功能的方法，包括得到所述基因；和利用病毒介導的內源基因沉默系統或外源基因過表達系統分析基因功能和分化。13.以上12中所述的方法，其中所述小麥是六倍體普通小麥，如小偃54 (XY54)、京 411 (J411)、Langdon、烏拉爾圖小麥和山羊草。14.以上12或13中所述的方法，其中所述病毒介導的內源基因沉默系統是大麥條紋花葉病毒(Barly Stripe Mosaic Virus, BSMV)介導的小麥內源基因沉默系統。15.以上12或13中所述的方法，其中所述病毒介導的外源基因過表達系統是豌豆早褐病毒(PEBV)介導的外源基因過表達系統。
圖1 :TaSRX_A、TaSRX-B, TaSRX-D全長基因序列和擬南芥AtSRX、水稻OsSRX的結構比對。箭頭所指的第2個內含子是物種之間長度相對變化最大的內含子。圖2 =TaSRX-A(圖中以A表示)、TaSRX-B(圖中以B表示)、TaSRX-D(圖中以D表示)完整編碼框cDNA的比對。箭頭所指的是cDNA第178位的堿基，TaSRX-A中為A，TaSRX-D 中為T。圖3 =DNAstar軟件預測的TaSRX-A、TaSRX-B, TaSRX-D蛋白氨基酸序列與其它物種SRX蛋白全序列的比對。方框和箭頭指示所有SRX蛋白都含有的酶活中心“FSGCHR”。圖4 六倍體小麥中TaSRX基因的拷貝數鑒定。用帶有熒光標記的跨第二個內含子的保守引物擴增六倍體小麥及其亞基因組供體材料基因組DNA，對PCR產物進行毛細電泳分析。圖5 :TaSRX-A/B/D-GFP融合蛋白的亞細胞定位。圖5_1是轉基因載體示意圖；圖 5-2是對表達TaSRX-A/B/D-GFP融合蛋白的轉基因擬南芥(互補atsrx突變體7的株系) 的葉片進行Confocal活體觀察的結果，第1列是GFP熒光，第2列是葉綠素熒光，第3列是前兩列熒光的疊加。從上到下依次是野生型擬南芥(Columbia，WT)、GFP互補atsrx擬南芥株系和TaSRX-A/B/D-GFP互補atsrx擬南芥株系的結果。圖6 六倍體普通小麥小偃54不同器官中TaSRX-A、TaSRX-B, TaSRX-D的轉錄表達模式。用實時PCR技術檢測，分別是用跨第二個內含子的保守引物和TaSRX-A、TaSRX-B、 TaSRX-D的特異引物進行擴增。圖7 六倍體普通小麥小偃54(XY54)和京411 (J411)中病毒介導的TaSRX基因沉默效果以及光合生理指標，圖中WT代表未接種病毒的小麥，GFP代表接種了帶有GFP標簽病毒的小麥，Srx代表接種了帶有SRX基因片段病毒的小麥。圖7-1 實時PCR分析小偃54 和京411中BSMV介導的TaSRX基因沉默效果，同樣分別用圖6中的4對引物進行擴增；圖 7-2 小偃54和京411葉片在強光和強光低溫脅迫條件下Fv/Fm的變化，Fv/Fm是指植物葉片光合系統II的最大光化學效率；圖7-3 小偃54和京411葉片在強光和強光低溫脅迫條件下NPQ的變化(非光化學耗散)；圖7-4 小偃54和京411強光低溫脅迫條件下凈光合速率(Pn)的變化。圖8 煙草中病毒介導的TaSRX基因過表達實驗。圖8-1 煙草中PEBV介導的TaSRX 基因過表達狀況；圖8-2 煙草地上部分生物量的測量；圖8-3 煙草葉片對Paraquat造成的光氧化的耐受程度；圖8-4 =Paraquat處理前后煙草葉片的葉綠素相對含量；圖8_5 Paraquat處理前后煙草葉片的過氧化氫的相對含量；圖8_6 煙草葉片在強光和強光低溫脅迫條件下Fv/Fm的變化；圖8-7 煙草葉片在強光和強光低溫脅迫條件下NPQ的變化。圖9 載體結構示意圖，其中9-1是pJIT163-TaSRX_GFP中間載體結構示意圖；圖 9-2是pCAMBIA-1300載體結構示意圖。序列說明SEQ ID NO. 1SEQ ID NO. 2SEQ ID NO. 3SEQ ID NO. 4SEQ ID NO. 5SEQ ID NO. 6SEQ ID NO. 7SEQ ID NO. 8SEQ ID NO. 9
具體實施例方式下面通過實施例詳細描述本發明。本領域的普通技術人員可以理解，下述實施例僅是用于舉例說明的目的，并非限制本發明。本發明的保護范圍由后附的權利要求所界定。實施例1 =TaSRX基因的同源克隆以及基因結構分析
= TaSRX-A基因的全長序列； = TaSRX-B基因的全長序列； = TaSRX-D基因的全長序列； = TaSRX-A的蛋白序列； = TaSRX-B的蛋白序列； = TaSRX-D的蛋白序列； = TaSRX-A基因的編碼序列； = TaSRX-B基因的編碼序列；和 = TaSRX-D基因的編碼序列。
通過NCBI-Blastn搜索到SRX基因所有的EST序列，通過比對拼接得到三類在六倍體小麥(亞基因組組分為AABBDD)中發現的SRX基因全長EST序列。在ATG和TGA處設計保守引物同時克隆這3個拷貝，依次進行PCR擴增，回收目的片段，T-A連接，轉化細菌感受態，37°C培養，菌落PCR鑒定得到陽性克隆，陽性質粒提取，最后進行質粒酶切鑒定和測序得到三個拷貝的基因組全長序列。它們與擬南芥和水稻SRX基因(即AtSRX和OsSRX) 比對如附圖1所示。具體步驟如下所述所用引物為5，-ACGAATGGCGTCGACCTCGAGCTT-3，和 5，-CATCGCTAACCACCAATTCATCG CATAT-3，。PCR擴增反應條件95°C預變性5min ;94°C 40s,68°C 2. 5min，兩步法33個循環； 68°C 7min。反應體系 50 μ 1 :10XPCR 反應緩沖液 5 μ l，LA_Taq 酶(Takara 公司)0. 5 μ 1， IOOng小偃54(ΧΥ54)基因組DNA(XY54種子來自中國科學院遺傳發育所李振聲院士實驗室14)，DNA來自幼苗期的葉片，提取方法如下段描述)，2. 5mmol dNTP 4μ1，5μπι01引物各Ιμ ，加滅菌雙蒸水至50μ1。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠提取試劑盒(Gel Extraction KIT，購自鼎國公司)從瓊脂糖凝膠上純化目標TaSRXDNA片段(方法參照試劑盒說明書)，用Eppendorf公司BioPhotometer測定濃度后用于酶切、連接或存_20°C 備用。純化的TaSRX DNA片段與pGEM-T Easy載體(Promega公司，氨芐霉素抗性)連接 (T4-DNAligase, Promega公司，按照試劑盒說明書操作)，熱激轉化(42°C 90S)入大腸桿菌 DHlOB(Invitrogen公司)。從得到的克隆轉化子中用菌落PCR(引物為上述擴增引物)鑒定陽性克隆，提取陽性克隆質粒(小提質粒試劑盒，北京博大泰克公司，方法參照試劑盒說明書進行)。小麥基因組DNA提取方法將新鮮的小麥幼苗經液氮冷凍后充分研磨， 取IOOmg粉末于滅菌2mL Eppendorf管中；加入ImL CTAB提取緩沖液{1. 3 % CTAB (HexadecylTrimethyl Ammonium Bromide,十六烷基三甲基溴化銨，購自 Amresco 公司)，133mmol/LTris-HCl ρΗ8· 0(Tris 購自 Amresco 公司，HCl 購自北京化工廠)，13mmol/ LEDTA(購自 Amresco 公司)，0.93mol/L NaCl (購自北京化工廠)，0. 66% PVP 3600 (購自 Amresco公司)，0. 18mol/L β -巰基乙醇(購自北京鼎國生物技術有限責任公司)}，混勻； 65°C溫浴1. 5h，其間不時混合樣品，以充分提取；待樣品冷卻至室溫，加入ImL氯仿/異戊醇(24 1，均購自北京化工廠)進行抽提，輕輕顛倒混勻Ihr ；4°C，12000rpm離心15min ； 將上清液轉移至一新的離心管中，重復氯仿/異戊醇抽提一次；吸取上清液至一新的離心管中，加入3yL RNase A(10mg/ml，購自Sigma公司)，室溫下在搖床上消化45min ；緩慢加入420 μ L異丙醇(購自北京化工廠)，輕輕上下搖晃，直到出現白色DNA沉淀；用槍頭挑出 DNA，用ImL Wash I溶液(76%乙醇-購自北京化工廠，200mM NaAc-購自北京化工廠)浸泡洗滌15min。輕柔離心，棄上清；吸干殘余液體，DNA沉淀室溫吹干至透明，加入100 μ L TE溶液 (Tris-EDTA溶液，ρΗ8. 0)；待DNA充分溶解后，測定DNA濃度和質量；經適當稀釋后直接用于PCR反應或儲存于_70°C冰箱備用。如附圖1所示該基因結構在不同物種相當保守，包含了 5個外顯子和4個內含子，其中第二個內含子在各個物種之間長度變化幅度很大。實施例2 =TaSRX基因cDNA序列的克隆及蛋白序列預測和比對
用實施例1中相同的引物克隆XY54TaSRX的cDNA。PCR擴增反應條件95°C預變性 5min;94°C 40s, 68°C lmin，兩步法 33 個循環；68°C 7min。反應體系 50 μ 1 :10XPCR 反應緩沖液 5 μ 1，LA-Taq 酶(Takara 公司)0. 5 μ 1，IOOng 小偃 54cDNA, 2. 5mmoIdNTP 4 μ 1， 5 μ mo 1引物各1 μ 1，加滅菌雙蒸水至50 μ 1。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，純化目標TaSRX cDNA片段，Eppendorf公司BioPhotometer測定濃度后用于酶切、連接或存_20°C備用。純化的TaSRX cDNA片段與pGEM_T Easy載體連接，熱激轉化入大腸桿菌DH10B。菌落PCR(引物為上述擴增引物)鑒定陽性克隆，提取陽性克隆質粒。具體的分子克隆技術說明如實施例1中所示。其中，小偃54RNA提取如下實驗所用材料的總RNA提取采用RNAeasy PlantMini Kit(Qiagen，Valencia, CA)試劑盒或 TRIZOL (Invitrogen 公司)提取。模板 cDNA 第一鏈合成在滅菌的Eppendorf管中按順序加入6yg上述總RNA和3μ 1 oligo(dT) ；70°C水浴 10分鐘后，迅速置于冰上冷卻；按以下順序加入以下溶液5X逆轉錄緩沖液5μ1DTT6 μ 1dNTPs6 μ 1RNasin1 μ 1加水補足58 μ 137°C溫育2分鐘；加入2 μ 1 M-MLV逆轉錄酶，混勻，37°C反應1_2小時；反應結束后，將Eppendorf管取出，70°C處理15分鐘滅活逆轉錄酶；反應合成的cDNA第一鏈可用作 PCR反應的模板。其中使用的試劑如下M-MLV 逆轉錄酶和0. IM DTT (Gibco) ；dNTPs (IOmM each)和 oligo(dT)18(500 y g/ml) (Sangon) ;RNasin(40U/ml，Takara) ；5X 逆轉錄緩沖液 (Takara )。如附圖2和3中所示TaSRX-A、TaSRX-B、TaSRX-D的cDNA (序列分別表示為SEQ ID N0. 1、SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 3)和蛋白(序列分別表示為 SEQ ID N0. 4、SEQ ID NO. 5 和SEQ ID NO. 6)序列(DNAstar軟件預測)的比對結果顯示它們之間有98%的相似性，長度都是465bp，編碼154個氨基酸的蛋白。三個拷貝蛋白序列的物種分析比對結果表明它們具有典型的“FSGCHR”的酶活中心；TaSRX-A、TaSRX-D除了信號肽的微小差別之外，成熟蛋白區域只有1個氨基酸的差異(第60位，TaSRX-A為Serine，TaSRX-D為Cystine)，而這個氨基酸的差異是由二者的 cDNA 第 178 位的一個 SNP (Single Nucleotide Polymorphysim, 單核苷酸多態性)A-T造成。實施例3 =TaSRX基因拷貝數的確定-熒光標記的DNA片段分析技術采用熒光標記的跨第2個內含子的保守引物(僅在上游引物的5’端標記D4 熒光標記，Takara)擴增小偃54(亞基因組組分為AABBDD)、京411 (亞基因組組分為 AABBDD,種子來自中國科學院遺傳發育所李振聲院士實驗室14，DNA來自幼苗期的葉片)、 Langdon (亞基因組組分為AABB，種子購自美國的Graingene)、烏拉爾圖小麥(亞基因組組分為AA，種子購自中國農科院作物科學研究所)、山羊草(亞基因組組分為DD，種子購自中國農科院作物科學研究所)基因組DNA(提取方法參考實施例1)，得到的PCR片段經瓊脂糖凝膠電泳檢測證實目標帶存在之后進行變性(95°C，10min)，用CEQ TM 8000 GeXP System—Genetics Analysis System(美國貝克曼公司)進行毛細電泳，分辨率為lbp。電泳條件為4. 8千伏，變性時間120秒，注射時間15秒，分離時間50分鐘。所用保守引物為 5，-CTCATGGACAGCATCCGTGT-3，(帶有 5，熒光標記)，5，-GGTTGATTCTGGGATATGGCA-3，；產物大小為TaSRX-A-403bp、TaSRX_B_508bp、TaSRX_D_643bp ；PCR 擴增反應條件95°C預變性 5min ；94°C 35s, 56°C 35s，72°C 40s，33 個循環；72°C IOmin ；反應體系 50 μ 1 :10XPCR 反應緩沖液 5 μ l(Takara 公司)，LA-Taq 酶(Takara 公司)0. 5 μ 1，IOOng 基因組 DNA，2. 5mmol dNTP4y l，5ymol引物各1 μ 1，加滅菌雙蒸水至50 μ 1。如附圖4所示片段分析的結果對應于引物擴增的每個條帶只有一個峰，表明沒有其它的拷貝存在。因此證實六倍體普通小麥中只有TaSRX-A、TaSRX-B, TaSRX-D這三個拷貝。山羊草中存在兩種類型的D拷貝類型，其中第一種類型與六倍體中TaSRX-D —致，而第二種則比TaSRX-D少了一段內含子，這段內含子正是TaSRX-D較TaSRX-B多出的內含子。現已證實這段內含子是來自葉綠體基因組的一段序列實施例4 =TaSRX-A, TaSRX-B, TaSRX-D的成熟蛋白定位于葉綠體為了得到最確切的TaSRX蛋白亞細胞定位結果，我們用TaSRX_A、TaSRX-B, TaSRX-D轉擬南芥atsrx的突變體植株7 (來自SALK Institute)，得到純合的擬南芥轉基因互補株系。轉基因載體如附圖5-1所示，GFP連接在TaSRX的C端。用這些轉基因植株的葉片觀察到TaSRX-A、TaSRX-B, TaSRX-D和GFP融合蛋白的熒光與葉綠素的熒光重疊，表明它們都定位在葉綠體當中，結果如附圖5-2所示。具體方法如下所述我們采用PJIT163-GFP (氨芐霉素抗性，本實驗室構建15)和pCAMBIA_1300 (卡那霉素抗性)載體(購自國際農業分子生物學應用中心)構建轉化擬南芥的雙元載體。先構建 pJIT163-TaSRX-GFP 中間載體引物是 5，-AC AAGCTTATGGCGTCGACGTCGAGCTTGGATT-3，( 帶有 Hind III 接頭)和 5，-AC GGATCCTCGCATATGGTGCCGCAGTG-3，(帶有 BamH I 接頭)； PCR擴增實施例2中TaSRX的全長cDNA質粒，產物回收純化，使用Hind III和BamH I進行酶切再純化，連接同樣由Hind III和BamH I酶切之后回收純化的pJIT163_GFP載體，熱激轉化細菌(大腸桿菌DH10B，Irwitrogen公司)，經菌落PCR鑒定陽性克隆，提質粒得到 pJIT163-TaSRX A/B/D-GFP中間載體，測序無誤之后進行下一步。再構建1300_TaSRX_GFP 雙元載體作為擬南芥轉化的載體用Kpn I和Xho I酶切pJIT163-TaSRX A/B/D-GFP中間載體，Kpn I和Sal I酶切pCAMBIA_1300載體，回收純化相應的片段(分別包含35S Promotor-TaSRX-GFP 和 pCAMBIA-1300 的酶切片段)，連接構建 1300-TaSRX A/B/D-GFP, 熱激轉化細菌(大腸桿菌DH10B)，菌落PCR鑒定陽性克隆，提質粒得到1300-TaSRX Α/Β/ D-GFP載體。具體的分子克隆技術如實施例1中所示。pJIT163-TaSRX-GFP中間載體和 pCAMBIA-1300的結構示意圖分別如圖9_1和9_2所示。農桿菌感受態制備挑取農桿菌(Agrobacterium tumefaciens GV3101(利福平 Rif 抗性，50mg/L)GV3101凍存菌(菌株購自英國John Innes Center)，在LB (含50 μ g/ml利福平) 平皿劃線28°C培養1-2天，將生長良好的單菌落接種于3-5ml LB (含50 μ g/ml利福平， Sigma)液體培養基中，28°C振蕩培養過夜；吸出Iml菌液接種于IOOml LB (含50 μ g/ml禾Ij 福平)液體培養基，28°C振蕩培養6-8小時至0D_為0. 5左右，將菌液轉移至50ml離心管， 放置冰上30分鐘，然后離心收集菌體(5，OOOrpm, 10分鐘，4°C )；棄去上清，加入Iml冰冷的0. 15M氯化鈉溶液輕輕懸浮菌體，再加入約10ml，使菌體分散均勻，冰上放置30分鐘，離心收集菌體(5，OOOrpm, 10分鐘，4°C )；棄去上清，加入Iml冰冷的20mM氯化鈉溶液懸浮菌體，將制好的感受態細胞以0. 2ml/管分裝，在液氮中速凍1分鐘后保存在_70°C備用。質粒轉化農桿菌將1 μ g以上制備的質粒，即1300-TaSRX A/B/D-GFP載體加入含0. 2ml的農桿菌感受態的Eppendorf管中，冰上放置30分鐘；將含有該質粒和農桿菌感受態的Eppendorf管放入液氮速凍1分鐘，然后再37°C溫育3分鐘；加入Iml LB液體培養基，28°C震蕩培養3-5小時；5, OOOrpm離心1分鐘，棄去上清，加入200 μ 1 LB液體培 養基， 重懸沉淀；取200 μ 1重懸液(即轉化產物)均勻地涂于含50 μ g/ml利福平和50 μ g/ml卡那霉素的LB平板上，28°C培養2-3天；挑取適量的轉化菌斑PCR鑒定無誤后搖菌轉化擬南芥植株。農桿菌轉化擬南芥將鑒定無誤的農桿菌接種于5ml LB液體培養基中(含50μ g/ ml利福平和50 μ g/ml卡那霉素，卡那霉素購自Sigma)，28°C震蕩培養過夜；次日以1 100 的比例轉移至400ml LB液體培養基中(含50 μ g/ml利福平和50 μ g/ml卡那霉素)，28°C 震蕩培養至OD6tltl為0. 8左右；離心收集菌體，用400ml轉化緩沖液{0. 5 XMS鹽(Murashige & Shoog Medium，購自Duchefa Biochemia)，5%蔗糖(購自北京化工廠)，調節pH 5. 7后加入 0·44μΜ benzylamine purine (苯胺嘌呤，購自 Sigma)，0· 02% Silwet (表面活性劑， 購自Ameresco)}懸浮該農桿菌；抽真空轉化擬南芥植株，即將剪枝后4-6天的植株倒置于含其中懸浮有以上農桿菌的轉化緩沖液的玻璃瓶中，抽真空，維持40秒；取下植株，避光保濕側放24小時，然后將種植盆直立，按正常的方法培育植株至結實，收獲成熟種子。擬南芥轉基因純合株系的篩選將干燥一周后的種子播種于含50μ g/ml潮霉素(hygromycin,購自Sigma)和50 μ g/ml頭孢霉素(購自Sigma)的0. 5XMS培養基上， 每皿500粒左右；4°C春化2-3天，23°C培養，只有含外源片段的轉基因植株才能在選擇培養基上生長；長出的植株生長到6片真葉時，移至種植盆中生長，待成熟后分單株收獲種子(Tl代)；收取的Tl代種子分單株在含50μ g/ml潮霉素的選擇培養基上撒播，將發生 3 1分離的單株系的存活苗移栽至種植盆中生長，再分單株收獲種子(T2代)；收取的 T2代種子分單株在含50 μ g/ml潮霉素的選擇培養基上撒播，不發生任何分離的株系可以分單株收取種子(T3代)。T3代種子即為純合單拷貝轉基因株系，可以進行繁種擴增以便進行亞細胞定位和后期的生物學實驗。擬南芥正常培養條件23°C ；光照強度100 μ mol photons · m_2 · s—1 (單位面積單位時間內通過的光量子摩爾數)；16小時光照，8小時黑暗。實施例5 =TaSRX多表達在小麥的葉片中采集小偃54的各類器官幼葉、旗葉、根、莖、幼穗、花、種子，并提取它們的總RNA，反轉錄成為cDNA (方法參看實施例2)。實時PCR16分析TaSRX總的表達模式和TaSRX A/B/D拷貝特異的表達模式。如附圖6中所示=TaSRX多表達在幼葉和旗葉中，TaSRX A多表達在旗葉中，TaSRX B多表達在幼葉和種子中，TaSRX D多表達在旗葉中。分析TaSRX所用引物為實施例3中的保守引物；分析TaSRX A所用特異引物17是 5，-GCTTGGATTTGGGAAAGATCAGT-3，和 5，-TCCGAGTCACTCAATGCGTAG-3，(PCR 擴增反應條件 95°C預變性 3min ;94°C 20s, 58. 5°C 20s, 72°C 20s，40 個循環.)；分析 TaSRX B 所用特異引物是5，-ACCTCGAGCTTGGAGTTGAGG-3，和 5，-TTCTTCTCCGAGTCACTCAGAGG-3’(PCR 擴增反應條件95°C預變性 3min ;94°C 20s, 56°C 20s, 72°C 20s，40 個循環.)；分析 TaSRX D 所用特異引物是5，-TCGAGCTTGGATTTGGGAAAGATCGTG-3，和 5，-CCTAAGCGCTGGTGAGCCTCACAT-3， (PCR擴增反應條件95°C預變性 3min ;94°C 20s, 66°C 20s, 72°C 20s，40 個循環.)。PCR 反應體系 50 μ 1 10 X PCR 反應緩沖液 5 μ 1 (Takara 公司)，LA-Taq 酶(Takara 公司)0. 5 μ 1， IOOng基因組DNA，2. 5讓ol dNTP4 μ l,5ymol引物各1μ 1，加滅菌雙蒸水至50 μ L· 實施例6 六倍體小麥中TaSRX保護葉綠體光合系統的功能為了研究小麥中TaSRX基因的功能，我們利用BSMV (Barly Stripe Mosaic Virus) 介導的小麥內源基因沉默系統18’19’2°下調了小偃54和京411中TaSRX的表達。研究了在 TaSRX基因部分沉默的情況下，小偃54和京411在正常生長條件和脅迫條件下的光合系統效率變化。如附圖7所示沉默該基因造成小偃54和京411在脅迫條件下的光合系統效率 (Fv/Fm)大大下降、光抑制程度加強、非光化學耗散(NPQ)增多和凈光合速率(Pn)的下降。 這表明TaSRX在六倍體小麥種發揮了抗氧化和保護光合系統免受光抑制的作用，同時這種作用和小麥葉綠體內部的非光化學耗散也是緊密相關的。京411缺失該基因表現出比小偃 54更加敏感的表型，表明TaSRX基因已經在不同的遺傳背景下發揮了不同程度的功能。具體方法如下所述構建BSMV γ -TaSRX 載體所用引物為 5，-ATA GCTAGCATGGCGTCGACCTCGAGCT-3， 禾口 5，-ATT GCTAGCGGCCTTTCTTCTCCGAGTCA-3，(2 條引物都包含 Nhe I 酶切接頭)；以實施例2中cDNA質粒為模版擴增，回收純化PCR產物，使用Nhe I酶切PCR回收片段和BSMV Y，回收目的片段并連接，轉化細菌(DH10B，Invitrogen公司)，菌落PCR鑒定陽性克隆，提質粒得到目的載體并測序。具體的分子克隆技術如實施例1中所示。載體圖譜和病毒介導的小麥內源基因沉默(VIGS，Virus Induced Gene Silencing)操作流程詳見參考文獻18。病毒載體接種小麥葉片后10天提取小麥第3片葉子的RNA并進行cDNA合成(方法如實施例2中所示)，實時PCR16分析TaSRX總的沉默效果(相對于未接種的小麥對照和接種帶有GFP的病毒的小麥)和TaSRX A/B/D拷貝特異的沉默效果(所用引物和方法與實施例5中一致)。我們發現接種含TaSRX病毒的小麥TaSRX-RNA被沉默到對照TaSRX-RNA 的5-40%之間，符合功能試驗的要求。Fv/Fm和NPQ的檢測方法參見文獻16和21 ；凈光合速率的檢測21按照生產商的說明，使用美國LI-COR公司的Li-6400便攜式光合測定儀。強光處理條件1200μπιΟ1 photons ·πΓ2 · s—1，25 °C，2h ；強光低溫處理條件 1200 μ mol photons · m2 · s-1，6°C, 2h。實施例7 : TaSRX-A、TaSRX-B, TaSRX-D 的功能分化在六倍體普通小麥當中驗證TaSRX基因具有保護光合系統的功能，但是由于小麥的遺傳背景的復雜性以及TaSRX基因A、B、D拷貝之間的高度保守性(目前還不可能在小麥中單獨沉默單個SRX拷貝)，在小麥中研究該基因的功能分化遇到了瓶頸，因此我們又進一步在煙草中分別研究TaSRX-A、TaSRX-B, TaSRX-D的抗氧化功能和分化。如附圖8所示，煙草中PEBV(豌豆早褐病毒)介導的外源基因過表達20實驗表明抗氧化和保護光合系統功能TaSRX-A > TaSRX-B > TaSRX_D。附圖8_1表明這個病毒介導的過表達系統是有效的，TaSRX-GFP的免疫印跡檢測表明蛋白不但表達了，而且表達水平比較一致，所用一抗為抗-GFP，所用二抗為抗-小鼠-AP酶標。附圖8-2 過表達TaSRX-A的煙草表現出生物量增加。附圖8-3、8-4和8-5表明過表達TaSRX-A的煙草葉片在正常生長條件下葉綠素增加；在paraquat光漂白耐受實驗中，過表達TaSRX-A的煙草葉片抗光氧化漂白能力最強(維持了最大的葉綠素含量)，同時過氧化氫含量最低。如附圖8-6和8-7所示在引發光抑制的脅迫實驗中，過表達TaSRX-A的煙草葉片維持了最大的光合系統效率， 同時具有最小程度的非光化學耗散；過表達TaSRX-B的煙草葉片次之；過表達TaSRX-D的煙草葉片發生光抑制的程度接近GFP對照，光合效率遠遠低于表達TaSRX-A的葉片，同時非光化學耗散最大。TaSRX A和D的cDNA 178bp處的SNP (附圖2)互相突變之后產生TaSRX Am和 TaSRX Dm,TaSRX Dm 即為 TaSRX A,TaSRX Am 即為 TaSRX D。如附圖 8 中所示TaSRX_Am 的功能接近TaSRX-D，TaSRX-Dm的功能接近TaSRX_A。TaSRX-A和TaSRX-D功能差異源于蛋白第60位的一個氨基酸，TaSRX-A中為絲氨酸(Ser)，TaSRX-D中為半胱氨酸(Cys)，而交互突變之后發生了功能的互變，這充分說明了這個SNP對于TaSRX-A強大的抗氧化功能的重要性。煙草中PEBV(豌豆早褐病毒)介導的外源基因過表達體系如下1、載體構建PEBV-pCACE2-TaSRX_GFP (具體的載體圖譜酶切位點參考文獻22)。所用引物為5，-AT CCATGG CGTCGACCTCGAGCTT-3，，5，-TACCATGG CTCGCATATGGTGCCGCAGT-3，(2條引物都帶有Nco I酶切位點)；PCR擴增反應條件95°C 預變性 5min;94°C 35s, 58 °C 35s, 72 °C 30s，30 個循環；72 °C IOmin ；反應體系 50 μ 1 10 X PCR反應緩沖液5 μ 1，LA-Taq酶(Takara公司)0. 5 μ 1，1 μ 1實施例2中的cDNA質粒， 2. 5mmol dNTP 4 μ 1，5 μ mol引物各1 μ 1，加滅菌雙蒸水至50 μ 1。PCR產物目的條帶回收純化，Nco I酶切基因片段和載體PEBV-pCACE2-GFP載體(載體來自丹麥農業科學院)，回收連接基因和載體，轉化大腸桿菌DH10B，鑒定克隆陽性克隆，提質粒。具體的分子克隆技術如實施例1中所示。2、經Nco I酶切測序驗證的質粒轉化農桿菌GV3101(菌株購自英國John Innes Center)，同時分別用pCAPEl和pCAPE2-GFP、pCAPE2_PDS (載體均購自丹麥農業科學院)轉化GV3101 (轉化方法參見實施例4)。3、煙草準備25°C培養間內，16小時光照，8小時黑暗，蛭石中生長的本氏煙草苗 (煙草種子購自中國農業大學)，長到5-6片展開葉時用于農桿菌注射。4、煙草注射DpCAPEl及pCAPE2_GFP、pCAPE2_PDS轉GV3101后鑒定無誤，挑取轉化成功的克隆劃線 28 °C 培養過夜(LB 培養基，50 μ g/ml Rif(Sigma)，50 μ g/ml Kana(Sigma)；2)挑取上述過夜菌接種到5ml LB (50 μ g/ml Rif，50 μ g/ml Kana)中28°C培養過夜；3)將上述過夜的菌液轉接到50ml LB (IOmM MES (Ameresco)+20 μ M乙酰丁香酮 (Sigma) +50 μ g/ml Kana)中，28°C培養過夜；4)離心收集上述菌液，然后重懸在LB(10mM MgC12+10mM MES+200 μ M乙酰丁香酮)中，調0D600 = 2. 0，在室溫下靜置3小時；5)按pCAPEl pCAPE2 = 1 1注射煙草，注射時要注射近軸端的嫩葉；6)兩周后觀察表型，進行蛋白檢測，之后進行各種生理實驗。
參考t獻
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權利要求
1.一種小麥抗氧化相關基因TaSRX-A，其包含下列核苷酸序列之一 序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；序列表中SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列； 編碼序列表中SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和與SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列具有90%以上同一性且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列。
2.一種小麥抗氧化相關基因TaSRX-B，其包含下列核苷酸序列之一 序列表中SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列；序列表中SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列； 編碼序列表中SEQ ID NO. 5所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和與SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列具有90%以上同一性且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列。
3.一種小麥抗氧化相關基因TaSRX-D，其包含下列核苷酸序列之一 序列表中SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；序列表中SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列； 編碼序列表中SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和與SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列具有90%以上同一性且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列。
4.小麥抗氧化相關蛋白TaSRX-A，其選自權利要求1中的小麥抗氧化相關基因TaSRX-A所編碼的蛋白質；或在SEQ ID N0. 4的氨基酸序列經過取代、缺少或添加一個或多個氨基酸且具有與SEQ ID N0. 4的氨基酸序列相同功能的由SEQ ID N0. 4衍生的氨基酸序列。
5.小麥抗氧化相關蛋白TaSRX-B，其選自權利要求2中的小麥抗氧化相關基因TaSRX-B所編碼的蛋白質；或在SEQ ID N0. 5的氨基酸序列經過取代、缺少或添加一個或多個氨基酸且具有與SEQ ID N0. 5的氨基酸序列相同功能的由SEQ ID N0. 5衍生的氨基酸序列。
6.小麥抗氧化相關蛋白TaSRX-D，其選自權利要求3中的小麥抗氧化相關基因TaSRX-D所編碼的蛋白質；或在SEQ ID N0. 6的氨基酸序列經過取代、缺少或添加一個或多個氨基酸且具有與SEQ ID N0. 6的氨基酸序列相同功能的由SEQ ID N0. 6衍生的氨基酸序列。
7.含有權利要求1-3中任一項所述基因的表達載體。
8.權利要求7中所述的表達載體，其中所述載體是雙元農桿菌載體。
9.含有權利要求7或8中所述的表達載體的細胞系。
10.權利要求1-3中任一項所述的基因在調節植物抗氧化功能或在保護光合系統免除光抑制和光氧化功能中的應用。
11.權利要求10中所述的應用，其中所述植物是小麥，優選是六倍體普通小麥，如小偃 54 (XY54)、京411 (J411)、Langdon、烏拉爾圖小麥和山羊草。
12.—種分析小麥基因功能的方法，包括得到所述基因；和利用病毒介導的內源基因沉默系統或外源基因過表達系統分析基因功能和分化。
13.權利要求12中所述的方法，其中所述小麥是六倍體普通小麥，如小偃54(XY54)、京 411 (J411)、Langdon、烏拉爾圖小麥和山羊草。
14.權利要求12或13中所述的方法，其中所述病毒介導的內源基因沉默系統是大麥條紋花葉病毒(Barly Stripe Mosaic Virus, BSMV)介導的小麥內源基因沉默系
15.權利要求12或13中所述的方法，其中所述病毒介導的外源基因過表達系統是豌豆早褐病毒(Pea Early Browning Virus, PEBV)介導的外源基因過表達系統。
全文摘要
本發明公開了小麥抗氧化相關基因TaSRX-A、TaSRX-B和TaSRX-D及其編碼蛋白與應用。本發明還公開了所述基因及其編碼蛋白在調節植物抗氧化功能或在保護光合系統免除光抑制和光氧化功能中的應用。該基因在光脅迫條件下能起到清除活性氧、保護光合系統，使植物的抗光抑制和抗光氧化能力增強，進而提高植物的生物量。本發明的基因及其編碼蛋白對于普通小麥耐光脅迫機制的研究具有重要的理論意義，對于提高普通小麥和其它重要農作物的產量具有重要的理論以及實際意義，應用前景廣闊。
文檔編號C12N15/82GK102220346SQ20101014760
公開日2011年10月19日 申請日期2010年4月14日 優先權日2010年4月14日
發明者劉昕, 張坤普, 王燃, 王道文, 秦煥菊 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所