專利名稱：：油菜莖基潰瘍病菌的實時熒光pcr檢測方法及檢測用引物和探針的制作方法
技術領域：
：本發明涉及農業和植物檢疫
技術領域：
，具體涉及一種油菜莖基潰瘍病菌的檢測方法，尤其涉及一種油菜莖基潰瘍病菌的實時熒光PCR檢測方法。此外，本發明還涉及檢測油菜莖基潰瘍病菌的引物和探針。
背景技術：
：油菜黑脛病(Phomastemcanker)又稱為“油菜黑腿病”，是世界范圍內油菜最嚴重的真菌病害之一，其病原菌為小球腔菌屬，主要包括兩個種油菜黑脛病菌Leptosphaeriabiglobosa禾口油菜蓮基饋蕩病菌Leptosphaeriamaculans,這兩禾中病原菌的形態特征相近，但引起油菜莖部感染和基部潰瘍的能力不同。前者致病力較弱，一般引起莖中上部為害，造成的損失小，包括中國在內的一些油菜生產國均有分布。后者致病力強，弓丨起莖基部發病，是導致油菜黒脛病嚴重流行和油菜產量損失的主要因素，在澳大利亞、加拿大、美國、歐洲等油菜主產國有分布，而在我國未見報道。我國油菜產區氣候與歐、美、澳三大洲相似，且中國目前的油菜主要栽培品種高度感病。另一方面，隨著貿易全球化，病菌傳入的風險加劇。2009年8月以來，上海口岸已經從澳大利亞、烏克蘭和加拿大等國進境油菜籽樣品中多次截獲油菜莖基潰瘍病菌Lmaculans。油菜莖基潰瘍病菌正在一步步逼近我國，嚴重威脅著我國油菜產業的生產安全。為防止該有害生物的傳入，如何高效快速檢測成為預防油菜莖基潰瘍病傳入國內的技術關鍵。目前，國內針對油菜莖基潰瘍病菌的檢測方法研究較少，采用的檢測手段主要是濾紙培養法和PCR方法，PCR檢測方法以其快速、準確和靈敏的特點受到廣泛應用。但尚未見利用MGB探針來檢測油菜莖基潰瘍病菌的實時熒光PCR檢測方法的報道。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種油菜莖基潰瘍病菌的實時熒光PCR檢測方法；為此，本發明還提供用于上述方法的檢測引物和探針。在本發明的一方面，提供一種油菜莖基潰瘍病菌的實時熒光PCR檢測方法，包括如下步驟(1)設計引物和探針；該引物的序列為Lmb3:5，-caccaattggatccccta-3，(SEQIDNO.1)或其互補鏈；R2:5，-ggcgcaaaatgtgctgcgct-3，(SEQIDNO.2)或其互補鏈；該探針的序列為Probe-M5'_FAM-cacttgggactcgccttg-MGB_3，(SEQIDNO.3)或其互補鏈；(2)對油菜籽樣品進行過篩處理，然后收集菌絲并提取DNA；(3)采用步驟⑴設計的引物和探針進行實時熒光PCR檢測。步驟(2)中，所述對油菜籽樣品進行過篩處理具體為用孔徑2.5mm和1.5mm的網篩過篩，取篩上物和篩下物，液氮研磨后取樣。步驟(2)中，所述收集菌絲并提取DNA具體為菌株用PDA培養基繁殖后收集菌絲，液氮研磨后取菌絲粉，用植物基因組提取試劑盒提取DNA。步驟(3)中，所述實時熒光PCR檢測的反應體系為25yL，包括12.5μL2XPremixExTaq,5μM步驟(1)設計的引物和探針各1μL、1μL模板DNA、0.5μL50XROXReferenceDyeII、力口無菌7_K補至25μL。步驟(3)中，所述實時熒光PCR檢測的反應程序為95°C預變性10s，然后以95°C變性15s，60°C延伸Imin進行40個循環的擴增。在本發明的另一方面，提供一種用于檢測油菜莖基潰瘍病菌的引物，其序列為上游引物Lmb3:5，-caccaattggatccccta-3，(SEQIDNO.1)或其互補鏈；下游引物R2:5，-ggcgcaaaatgtgctgcgct-3，(SEQIDNO.2)或其互補鏈。在本發明的另一方面，提供一種用于檢測油菜莖基潰瘍病菌的探針，其序列為Probe-M5'-FAM-cacttgggactcgccttg-MGB-3，(SEQIDNO.3)或其互補鏈。上述實時熒光PCR檢測方法采用MGB(全稱為MinorGrooveBinder)探針。MGB探針一是在探針的3’端標記了自身不發光的淬滅熒光分子，以取代常規可發光的TAMRA熒光標記；二是探針的3’端另結合了Minorgroovebinder結合物，使探針的Tm值提高，大大增加了探針的雜交穩定性。該方法具有如下優點1、更容易設計；2、探針更短3、提高配對與司E配對模板間的Tm值差異；4、實驗結果更精確、分辯率更高；5、雜交的穩定性提高；6、低背景；7、重復性更強。該方法適合病原體的檢測、SNP和突變體檢測，既可以進行基因定量分析，又可以進行基因突變分析。與現有技術相比，本發明的有益效果在于本發明根據油菜莖基潰瘍病菌Leptosphaeriamaculans與其近似種ITS序列的差異，設計了檢測L.maculans的引物Lmb3/R2和探針Probe-M，建立了L.maculans的實時熒光PCR檢測方法。試驗結果表明，來自加拿大、澳大利亞和烏克蘭等國的22株L.maculans菌株都能得到陽性擴增，而供試的30株L.biglobosa菌株和6株其他菌株以及空白對照沒有熒光信號的增加。該檢測方法的靈敏度達到4pg菌絲DNA，整個檢測過程控制在4小時內，其快速、特異和靈敏的特點可以滿足進境油菜籽樣品的快速初檢以及病菌分離物的快速鑒定。圖1是供試L.maculans菌株DNA的實時熒光PCR擴增結果示意圖；圖2是供試biglobosa菌株和相關種菌株DNA的實時熒光PCR擴增結果示意圖；圖3是實時熒光PCR的檢測靈敏度結果示意圖；圖4是油菜樣品及分離物的實時熒光PCR擴增結果示意圖。圖1-圖4中，ARn是第η次循環時的熒光增加值。具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork=ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述條件，或按制造廠商所建議的條件。實施例1本實施例根據油菜莖基潰瘍病菌L印tosphaeriamaculans與其近似種ITS(internaltranscribedspacer，核糖體基因的轉錄間隔區)序列的特異性位點差異(G/A)設計特異引物和Taqman-MGB探針將實時熒光PCR技術應用于油菜莖基潰瘍病菌L.maculans的檢測，實驗步驟如下1材料方法1.1供試菌株試驗用油菜莖基潰瘍病菌L.maculans和油菜黑脛病菌L.biglobosa部分菌株由本實驗室(上海出入境檢驗檢疫局)從加拿大、澳大利亞和烏克蘭等國進境油菜籽樣品中分離純化后得到，部分菌株由深圳、江蘇和寧波出入境檢驗檢疫局技術中心提供，國內油菜黑脛病菌L.biglobosa菌株由安徽農科院李強生老師提供，菌株編號和來源見表1。表1試驗菌株Wm分離時間"”~IsolateCodeOriginYearL.maculans8129-5澳大利亞Australia20098129-17澳大利亞Australia20098129-25澳大利亞Australia20096382-1澳大利亞Australia20096382-2澳大利亞Australia20096382-3澳大利亞Australia20098080-1烏克蘭Ukraine2009333-13烏克蘭Ukraine2009333-15烏克蘭Ukraine2009420-3烏克蘭Ukraine2009434-1烏克蘭Ukraine2009<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表1中，a江蘇出入境檢驗檢疫局吳翠萍提供；b深圳出入境檢驗檢疫局程穎慧提供；C寧波出入境檢驗檢疫局張建成提供；d安徽農科院李強生提供。1·2供試引物及探針根據油菜莖基潰瘍病菌L印tosphaeriamaculans與其近似種ITS(internaltranscribedspacer，核糖體基因的轉錄間隔區)序列的特異性位點差異(G/A)設計特異引物和Taqman-MGB探針，供試引物Lmb3(5，-caccaattggatccccta-3，(SEQIDNO.1))/R2(5‘-ggcgcaaaatgtgctgcgct-3‘(SEQIDNO.2))禾口探針Probe-M(5，-FAM_cacttgggactcgccttg-MGB-3，(SEQIDNO.3))均來源于GenBank中L.maculans的核糖體ITS序列。引物和探針由上海基康公司合成。1.3菌絲收集及DNA提取供試菌株用PDA培養基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，每升培養基含有馬鈴薯200g，蔗糖20g和瓊脂17g)繁殖后收集菌絲，液氮研磨后取0.Ig菌絲粉，用植物基因組提取試劑盒(TIANGENBIOTECH公司，DP305-02)提取DNA。1.4樣品和分離物DNA提取進境加拿大油菜籽樣品(樣品編號3，進境時間為2009年)混勻后取Ikg用作試驗樣品，用孔徑2.5mm和1.5mm的網篩過篩，取篩上物和篩下物各l_2g，液氮研磨后各取樣0.1-0.2g，分別按1.3方法提取DNA。油菜籽樣品中分離物3_6和3_21(本實驗室(上海出入境檢驗檢疫局)從加拿大進境油菜籽中分離的疑似菌株，進境時間為2009年)的菌絲液氮研磨后各取樣0.1-0.2g按1.3方法提取DNA。1.5實時熒光PCR檢測PCR試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)。反應體系為25μL，包12.5μL2XPremixExTaq、上下游引物(5μM)和探針(5μΜ)各1μL、1μL模板DNA、0.5μL50XROXReferenceDyeII、力口無菌7_K補至25μL。實時熒光PCR檢測使用儀器為AppliedBiosystems(美國應用生物系統公司)的7500FastReal-timePCRSystem(7500快速實時熒光PCR系統)，反應程序為95°C預變性10s，然后以95°C15s，60°CImin進行40個循環。2結果2.1特異性檢測22個供試L.maculans菌株的菌絲DNA經實時熒光PCR檢測，探針Probe-M對供試的22個L.maculans菌株都有熒光信號的增加，表現為陽性擴增(見圖1)。圖1中，1_21包括以下編號的22個L.maculan菌株(8129-5，8129-17，8129-25，6382-1，6382-2，6382-3，8080-1，333-13，333-15，420-3，434-1，895-1，3-4，3-9，3-20，15-2,15-3,15-5,17-2,17-3,J-4，J-1)；22表示編號6382-53的油菜黑脛病菌L.biglobosa菌株；23表示無DNA模板。供試的30個L.biglobosa菌株、5株Alternariaspp.菌株、1株Phomasp.菌株和空白對照都沒有檢測到熒光信號的增加，表現為陰性(見圖2)。圖2中，1-36表示以下編號的30個L.biglobosa菌株、5株Alternariaspp.菌株禾口1株Phomasp.菌株(6382—53，6382-54，7873-1，7873-2，6555-1，6555-2，1602-1，1602-2，333-10，333-14，337-2，337-3，420-1，17-1，17-4，17-11，15-4,15-16，3-2，3-12，895-3，895-4，9268-39，9268-46，726-2，Gs5-5,Gj2-2,Ah9-4,Ah12-2,Ahl9_3，8129-84，3-3，333-3，333-11，333-18，8129-92)；37表示編號為8129-5的L.maculan菌株；38表示無DNA模板。試驗結果表明，引物Lmb3/R2和探針Probe-Μ可以特異性檢測L.maculans。2.2靈敏度檢測L.macu1ans菌株8129-5的菌絲DNA測定DNA濃度后系列稀釋為不同濃度，分別取4ng、400pg、40pg、4pg、400fg和40fg的菌絲DNA用于實時熒光PCR檢測，PCR擴增后4ng、400pg、40pg和4pg的菌絲DNA都檢測到熒光信號的增加，表現為陽性擴增，400fg和40fg的菌絲DNA無擴增(見圖3)，圖3中，16分別表示編號8129-5的L.maculans菌株的4ng，400pg，40pg，4pg，400fg，40fg的菌絲DNA。試驗結果表明引物Lmb3/R2和探針Probe-M的檢測靈敏度為4pg的菌絲DNA。2.3樣品和分離物DNA的檢測進境油菜樣品3的篩上物和篩下物DNA以及樣品中分離物3_6和3_21的DNA分別進行實時熒光PCR檢測，篩上物DNA、篩下物DNA、分離物3_21的DNA和陽性對照都出現熒光信號的增加，分離物3-6的DNA、陰性對照和空白對照表現為陰性擴增(見圖4)，圖4中，1表示進境油菜樣品3的篩上物DNA(采用孔徑d=2.5mm的網篩過篩)；2表示進境油菜樣品3的篩下物DNA(采用孔徑d=1.5mm的網篩過篩)；3表示分離物3_21的DNA；4表示分離物3-6的DNA；5表示編號為8129-5的L.maculans菌株；6表示編號為6382-53的L.biglobosa菌株；7表示無DNA模板。試驗結果表明，引物Lmb3/R2和探針Probe-M可以特異性檢測油菜樣品中的L.maculans,也可用于病菌分離物的鑒定。3討論目前認為油菜莖基潰瘍病菌L.maculans種下包括兩個亞種或組，包括L.maculanssubsp.brassicae禾口L.maculanssubsp.Iepidii,前者寄主為栽培蕓薹屬Brassicaspp.,后者寄主為獨行菜屬L印idiumspp.。試驗所用Lmaculans菌株均從加拿大、烏克蘭和澳大利亞等國進境油菜籽樣品中分離，經形態特征和序列分析，其ITS序列和L.maculanssubsp.brassicae的序列相似性大于或等于99.8%。因此，供試L.maculans菌株均為L.maculanssubsp.brassicae。試驗所用弓I物禾口探針是針對L.maculanssubsp.brassicae的序列設計，理論上僅對L.maculanssubsp.brassicae菌株表現為陽性擴增，試驗中缺少L.maculanssubsp.1印idii菌株進行驗證。試驗中所用L.biglobosa菌株包含L.biglobosasubsp.brassicae、L.biglobosasubsp.canadensis禾口L.biglobosasubsp.australiensis等二個亞禾中。試驗中沒有收集至丨JL.biglobosasubsp.thlaspii、L.biglobosasubsp.erysimii禾口L.biglobosasubsp.occiaustralensis等三個亞禾中菌株進行驗證。試驗中實時熒光PCR的檢測靈敏度達到了4pg菌絲DNA，比常規PCR的檢測靈敏度提高了10-100倍。在檢測靈敏度提高的同時，檢測時間縮短至1.5小時。從樣品前處理、DNA提取到實時熒光PCR擴增，整個檢測時間控制在4小時以內。油菜籽中油菜莖基潰瘍病菌的感染率很少高于1_2%，籽粒的帶菌量處于比較低的水平，而用于DNA提取的油菜籽樣品僅為0.1-0.2g，約為50-100粒，PCR直接檢測油菜籽種子樣品的陽性率很低，試驗中常規PCR檢測30余個加拿大進境油菜籽樣品，陽性率僅為10%左右。試驗中通過樣品的前處理，對油菜籽樣品進行過篩處理，檢測樣品篩上物和篩下物，陽性率超過60%，因此通過樣品前處理大大提高了陽性檢出率，達到了快速檢測以滿足口岸快驗放行的目的。同時，實時熒光PCR檢測還可以進行定量分析，在今后的油菜莖基潰瘍病菌監測和防控中具有十分廣泛的應用前景。權利要求一種油菜莖基潰瘍病菌的實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，包括如下步驟(1)設計引物和探針；該引物的序列為Lmb35’-caccaattggatccccta-3’(SEQIDNO.1)或其互補鏈；R25’-ggcgcaaaatgtgctgcgct-3’(SEQIDNO.2)或其互補鏈；該探針的序列為Probe-M5’-FAM-cacttgggactcgccttg-MGB-3’(SEQIDNO.3)或其互補鏈；(2)對油菜籽樣品進行過篩處理，然后收集菌絲并提取DNA；(3)采用步驟(1)設計的引物和探針進行實時熒光PCR檢測。2.如權利要求1所述的油菜莖基潰瘍病菌的實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，步驟(2)中，所述對油菜籽樣品進行過篩處理具體為用孔徑2.5mm和1.5mm的網篩過篩，取篩上物和篩下物，液氮研磨后取樣。3.如權利要求1或2所述的油菜莖基潰瘍病菌的實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，步驟(2)中，所述收集菌絲并提取DNA具體為菌株用PDA培養基繁殖后收集菌絲，液氮研磨后取菌絲粉，用植物基因組提取試劑盒提取DNA。4.如權利要求1所述的油菜莖基潰瘍病菌的實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，步驟(3)中，所述實時熒光PCR檢測的反應體系為25μL，包括12.5μL2XPremixExTaq、5yM步驟(1)設計的引物和探針各1“1^、1“14莫板0嫩、0.5口1^50XROXReferenceDyeII、加無菌水補至25μL。5.如權利要求1或4所述的油菜莖基潰瘍病菌的實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，步驟(3)中，所述實時熒光PCR檢測的反應程序為95°C預變性10s，然后以95°C15s,60°CImin進行40個循環。6.一種用于檢測油菜莖基潰瘍病菌的引物，其特征在于，其序列為Lmb3:5，-caccaattggatccccta-3，(SEQIDNO.1)或其互補鏈；R25'-ggcgcaaaatgtgctgcgct-3‘(SEQIDNO.2)或其互補鏈。7.一種用于檢測油菜莖基潰瘍病菌的探針，其特征在于，其序列為=Probe-M:5’-FAM-cacttgggactcgccttg-MGB-3，(SEQIDNO.3)或其互補鏈。全文摘要本發明公開了一種油菜莖基潰瘍病菌的實時熒光PCR檢測方法及檢測用引物和探針，根據油菜莖基潰瘍病菌L.maculans與其近似種ITS序列的差異，設計了檢測L.maculans的引物Lmb3(5’-caccaattggatccccta-3’)/R2(5’-ggcgcaaaatgtgctgcgct-3’)和探針Probe-M(5’-FAM-cacttgggactcgccttg-MGB-3’)，建立了L.maculans的實時熒光PCR檢測方法。該檢測方法的靈敏度達到4pg菌絲DNA，整個檢測過程控制在4小時內，其快速、特異和靈敏的特點可以滿足進境油菜籽樣品的快速初檢以及病菌分離物的快速鑒定。文檔編號C12Q1/68GK101805794SQ201010142449公開日2010年8月18日申請日期2010年4月8日優先權日2010年4月8日發明者周國梁,尚琳琳,易建平申請人:中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局