專利名稱：一種轉基因水稻品系的外源插入片段的旁側序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物技術領域的基因序列，具體的說，涉及一種轉基因水稻品系浙粳22Bt的外源插入片段的旁側序列。
背景技術：
水稻是我國最重要的糧食作物之一，隨著轉基因技術在水稻中的廣泛研究和應用，已經有多個轉基因水稻品系批準環境釋放，兩個批準進行生產性試驗。對轉基因植物進行轉化事件特異性的檢測是對轉基因植物進行監督管理，保障其健康發展的重要技術基礎。而轉基因植物的外源插入片段的旁側序列是轉基因植物品系最重要的分子特征之一， 因此，外源插入片段的旁側序列是建立轉基因植物轉化事件特異性檢測方法的重要技術資料。目前已經有部分專利和文獻報道了轉基因植物外源插入載體旁側序列，如彭于發等人于2007年利用Genome walking方法分析了轉基因水稻品系科豐6號的外源插入片段的旁側序列，建立了轉基因科豐6號水稻的品系特異性檢測方法。轉基因水稻浙粳22Bt 抗蟲性好，抗蟲蛋白只在葉片中表達，且已申請進行環境釋放試驗，具有較好的發展應用前景。然而，在對現有的專利和文獻的分析中發現，還沒有任何關于轉基因水稻品系浙粳22Bt 的外源插入片段的旁側序列的文章和專利報道。
發明內容
本發明的目的在于針對上述領域中的空白，提供了一種轉基因水稻品系浙粳22Bt 的外源插入片段的旁側序列。本發明的另一目的在于還提供該轉基因品系特異性的PCR檢測方法。本發明采用如下技術方案—種轉基因水稻品系浙粳22Bt的外源插入片段的旁側序列，所述旁側序列為5’ 端旁側序列，5’端旁側序列如SEQ ID NOl所示。一種轉基因水稻品系浙粳22Bt的外源插入片段的旁側序列，所述旁側序列為3’ 端旁側序列，3’端旁側序列如SEQ ID N02所示。所述的旁側序列是通過Tail-PCR和LD-PCR擴增得到。本發明還公開一種轉基因水稻品系浙粳22Bt的外源插入片段的旁側序列的定性 PCR檢測方法，所述PCR反應中的兩條引物組合為權利要求1所述旁側序列的特異性引物 一條引物為依據SEQ ID NOl中1-423位序列設計的正向引物，另一條引物為依據SEQ ID NOl的4M-481位序列設計的反向引物。所述的一種轉基因水稻品系浙粳22Bt的外源插入片段的旁側序列的定性PCR檢測方法，所述正向引物為ZJ22Bt-LB-lF 5-TCCAGTCGGGAAACTTGTCGT-3‘；所述反向引物為 ZJ22Bt-LB-lR :5’ TCTCCTAGAGGCTGACATGTG-3，。一種轉基因水稻品系浙粳22Bt的外源插入片段的旁側序列的定性PCR檢測方法，所述PCR反應中的兩條引物組合為權利要求2所述旁側序列的特異性引物一條引物依據 SEQ ID N02中1-180位序列設計的正向引物，另一條引物依據SEQ ID N02的181-560位序列設計的反向引物。所述正向序列為ZJ22Bt-RB-2F :5，ACAGTTGCGCAGCCTGAATGG-3，；所述反向序列為 ZJ22Bt-RB-2R :5’ CTGTTGCATGCACACGGATGG-3，。基因克隆所用載體為質粒pCAMBIA1300和pPZP201，其中pCAMBIA1300作為表達質粒載體，具有一個潮霉素抗性標記基因hpt，本品系浙粳22Bt潮霉素抗性基因已經從水稻基因組中剔除，具體結構見圖1。本發明采用常規方法，提取植物基因組DNA，利用Tail-PCR 分離法得到5，端旁側序列472bp，其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。通過分析，該5，端旁側序列包括水稻基因組序列，位于水稻11號染色體(GenBank登一記號ACU8642. 3) 的61834-61882，其核苷酸序列與SEQ ID NO. I中從424-472位的核苷酸序列完全相同；； 轉化載體pPZP201-Rub-CrylA(B)部分序列，其核苷酸序列與SEQ ID NO. 1中1-423位的核苷酸序列完全相同；利用LD-PCR分離法得到3’端旁側序列560bp，其核苷酸序列如SEQ ID N02所示。通過分析，該3，端旁側序列包括轉化載體pPZP201-Rub-CrylA(B)部分序列，其核苷酸序列與SEQ ID NO. 2中的1-139位的核苷酸序列完全相同，filler DNA來源于整合過程中的DNA修復序列，其核苷酸序列與SEQ ID NO. 1中140-180位的核苷酸序列完全相同，水稻基因組序列，位于水稻11號染色體(GenBank登記號ACU8642. 3)的61441-61820 位，其核苷酸序列與SEQ ID NO. 2中從181-560位的核苷酸序列完全相同。轉基因水稻品系浙粳22Bt的外源插入片段的旁側序列的定性PCR檢測方法，可以5’端旁側序列和/或3’端旁側序列作為目的DNA擴增片段。根據5’端旁側序列設計特異性引物，其正向引物可根據270-290位的核苷酸序列設計，即是按照轉化載體pPZP201-RUb-CrylA(B)部分序列設計；反向引物可根據似6-446位的核苷酸序列設計即是按照水稻基因組序列設計，位于水稻11號染色體(GenBank登記號ACU8642. 3)的61836-61856，本發明設計的正向引物為 ZJ22Bt-LB-lF :5-TCCAGTCGGGAAACTTGTCGT-3 '，反向引物為 ZJ22Bt_LB_lR 5 ‘ TCTCCTAGAGGCTGACATGTG-3 ‘。根據3 ’端旁側序列設計特異性引物，其正向引物可根據M-74位的核苷酸序列設計，即是按照轉化載體pPZP201-Rub-CrylA(B)部分序列設計，反向引物可根據233-253位的核苷酸序列設計，即是按照水稻基因組序列，位于水稻11號染色體(GenBank登記號ACU8642. 3)的61748-61768位，本發明設計的正向序列為 ZJ22Bt-RB-2F 5 ‘ -ACAGTTGCGCAGCCTGAATGG-3 ‘，反向序列為 ZJ22Bt_RB_2R 5 ‘ -CTGTTGCATGCACACGGATGG-3‘。本發明首次克隆了轉基因水稻品系浙粳22Bt的外源插入片段的旁側序列，并且明確了轉基因水稻品浙粳22Bt的外源插入片段的旁側序列可以用作目的DNA擴增片段建立靈敏、特異性的轉基因水稻品系浙粳22Bt的品系特異性定性、定量PCR檢測。本發明所克隆、分離的外源插入片段的旁側序列可以進一步用于建立轉基因品系特異性PCR檢測方法。
圖1 轉基因水稻品系浙粳22Bt的轉化載體pPZP201-Rub-CrylA(B)的T-DNA區域結構示意圖。
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圖2 轉基因水稻品系浙粳22Bt Genome walking擴增獲得5 ‘端旁側序列M marker DL2000 ；1 第一輪擴增片段；2 第二輪擴增片段；3 第三輪擴增片段。圖3 轉基因水稻品系浙粳22Bt LD-PCR擴增獲得3 ’端旁側序列M :marker DL2000 ；1，2 浙粳22Bt ；3,4 對照浙粳22 ；5,6 空白對照。圖4 轉基因水稻品系浙粳22Bt的5’端旁側序列特異性引物2檢測M marker DL2000 ；1,2 轉基因水稻科豐6號；3，4 轉基水稻浙大克螟稻；5，6 對照水稻品系浙粳22 ； 7,8 轉基因水稻品系浙粳22Bt。圖5 轉基因水稻品系浙粳22Bt的3’端旁側序列特異性引物檢測。M marker DL2000 ；1，2 轉基因水稻科豐6號；3，4 轉基水稻浙大克螟稻；5，6 對照水稻品系浙粳22 ； 7,8 轉基因水稻品系浙粳22Bt。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如 Sambrook 等分子克隆實驗室手冊(New York Co Id SpringHarbor Laboratory Press 2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1轉基因水稻品系浙粳22Bt的外源插入載體的旁側序列的克隆一、實驗材料1、植物材料轉基因水稻轉基因水稻品系浙粳22Bt。常規水稻浙粳22 (受體)。2、酶與試劑分子生物學試劑，如dNTPs. Taq DNA聚合酶、DL2000Marker購自大連寶生物生物工程有限公司。其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。3、實驗儀器PCR Ti^iX :Biometra Tprofessional (Biometra co.)核酸電泳儀DYY III型核酸電泳儀(北京六一儀器廠)DNA 電泳分析系統alpha FluorChem FC2 (REDAlpha co.)其它儀器包括離心機，恒溫加熱板，電子天平，培養箱等。二、實驗方法和過程1、外源插入載體轉基因水稻品系浙粳22Bt由外源插入載體pPZP201-Rub_CrylA(B)轉化而來，由 CrylA(b)基因表達盒組成，見圖1。2、植物基因組DNA提取與檢測2. 1、植物DNA小量提取2. 1. 1、抽提液的配制
權利要求
1.一種轉基因水稻品系浙粳22Bt的外源插入片段的旁側序列，所述旁側序列為5’端旁側序列，其特征在于5’端旁側序列如SEQ ID NOl所示。
2.—種轉基因水稻品系浙粳22Bt的外源插入片段的旁側序列，所述旁側序列為3’端旁側序列，其特征在于3’端旁側序列如SEQ ID N02所示。
3.根據權利要求1或2所述的旁側序列，其特征在于該旁側序列是通過Tail-PCR和 LD-PCR擴增得到。
4.一種轉基因水稻品系浙粳22Bt的外源插入片段的旁側序列的定性PCR檢測方法，其特征在于所述PCR反應中的兩條引物組合為權利要求1所述旁側序列的特異性引物一條引物為依據SEQ ID NOl中1-423位序列設計的正向引物，另一條引物為依據SEQ ID NOl 的424-481位序列設計的反向引物。
5.根據權利要求4所述的一種轉基因水稻品系浙粳22Bt的外源插入片段的旁側序列的定性PCR檢測方法，其特征在于所述正向引物為 ZJ22Bt-LB-lF :5-TCCAGTCGGGAAACTTGTCGT-3，；所述反向引物為 ZJ22Bt_LB_lR 5’ -TCTCCTAGAGGCTGACATGTG-3’。
6.一種轉基因水稻品系浙粳22Bt的外源插入片段的旁側序列的定性PCR檢測方法， 其特征在于所述PCR反應中的兩條引物組合為權利要求2所述旁側序列的特異性引物 一條引物依據SEQ IDN02中1-180位序列設計的正向引物，另一條引物依據SEQ ID N02的 181-560位序列設計的反向引物。
7.根據權利要求6所述的一種轉基因水稻品系浙粳22Bt的外源插入片段的旁側序列的定性PCR檢測方法，其特征在于所述正向序列為 ZJ22Bt-RB-2F :5，-ACAGTTGCGCAGCCTGAATGG-3，；所述反向序列為 ZJ22Bt_RB_2R 5’ -CTGTTGCATGCACACGGATGG-3’。
全文摘要
本發明涉及一種轉基因水稻品系浙粳22Bt的外源插入片段的旁側序列。所述旁側序列為5’端旁側序列及3’端旁側序列。本發明首次克隆了轉基因水稻品系浙粳22Bt的外源插入片段的旁側序列，并且明確了轉基因水稻品浙粳22Bt的外源插入片段的旁側序列可以用作目的DNA擴增片段建立靈敏、特異性的轉基因水稻品系浙粳22Bt的品系特異性定性、定量PCR檢測。本發明所克隆、分離的外源插入片段的旁側序列可以進一步用于建立轉基因品系特異性PCR檢測方法。
文檔編號C12P19/34GK102212528SQ201010137449
公開日2011年10月12日 申請日期2010年4月1日 優先權日2010年4月1日
發明者張小明, 徐俊鋒, 汪小福, 陳笑蕓 申請人:浙江省農業科學院