一種大腸桿菌和使用該大腸桿菌制備l-半胱氨酸的方法

專利名稱：：一種大腸桿菌和使用該大腸桿菌制備l-半胱氨酸的方法
技術領域：
：本發明涉及一種大腸桿菌，以及利用大腸桿菌進行發酵制備L-半胱氨酸的方法。
背景技術：
：L-半胱氨酸廣泛地應用于醫藥、食品、化妝品及飼料等行業。目前L-半胱氨酸的生產主要有天然產物提取法、化學合成法、微生物轉化法和微生物發酵法。天然產物提取法采用人或動物毛發作為原料，經酸水解或堿水解法提取L-胱氨酸，再經電解還原制得L-半胱氨酸。化學合成法是利用氯代烷類化合物經過氧化反應——加成反應——還原反應——取代反應，最后得到半胱氨酸。微生物轉化法是利用DL-2-氨基-Δ2-噻唑林-4-羧酸作為前體經微生物酶轉化得到半胱氨酸。這幾種方法不僅產率低，能耗大，而且在生產過程中要用到大量的化學試劑，對環境有相當大的危害。細菌中L-半胱氨酸的合成途徑已經被研究清楚了，L-絲氨酸在絲氨酸乙酰轉移酶(E.C2.3.1.30)催化下，與乙酰輔酶A反應生成0-乙酰基絲氨酸，然后在0-乙酰基絲氨酸巰羥基裂解酶(E.C2.5.1.47)催化下，形成L-半胱氨酸。野生型大腸桿菌中，L-半胱氨酸對絲氨酸乙酰轉移酶(SAT)有很強烈的反饋抑制作用(IC5tl=0.8μM)。有文獻報道SAT的第95位點的纈氨酸殘基被精氨酸替代，第96位點的天冬氨酸被脯氨酸替代后，L-半胱氨酸對其的反饋抑制作用會大幅度減弱(IC5tl=1100μΜ)。(IC5tl表示SAT活性降低到50%的L-半胱氨酸的含量)。除了對SAT的反饋抑制作用，細菌體內L-半胱氨酸的含量還受半胱氨酸脫巰基酶的調控。在大腸桿菌中目前已報導的半胱氨酸脫巰基酶有(Ε.C4.1.99.1和Ε.C:4.4.1.8)，它們的編碼基因分別是tnaA和metC。但這兩個酶的脫巰基作用只在體外實驗中得到證明，L-半胱氨酸在細胞內代謝途徑中的作用尚不明確。盡管已經有通過利用L-半胱氨酸對其反饋抑制作用被減弱的SAT的編碼基因以及敲除半胱氨酸脫巰基酶的表達基因的方法來制備L-半胱氨酸的技術。甚至還有人通過過量表達一種氨基酸胞外運輸蛋白編碼基因，提高L-半胱氨酸胞外運輸能力來制備L-半胱氨酸。但是目前這些生產L-半胱氨酸的技術的產量及轉化率都無法滿足工業化的需求，需要有一個更完善的L-半胱氨酸制備技術及一種更高產高效的L-半胱氨酸生產菌種。
發明內容本發明所要解決的技術問題是要提供一種大腸桿菌和使用該大腸桿菌制備L-半胱氨酸的方法，可使底物的轉化率及L-半胱氨酸的產量得到提高。發明人經過長期和深入的研究，發現抑制谷氨酸半胱氨酸連接酶和磷酸泛酸半胱氨酸連接酶能提高大腸桿菌的L-半胱氨酸的含量，這兩個酶的編碼基因分別是gshA和dfp。并以大腸桿菌BL21(DE3)為初始菌種，通過基因工程手段對其產L-半胱氨酸能力進行定向改造，得到一種能夠生產L-半胱氨酸的菌種以及利用該菌種制備L-半胱氨酸的方法。通過增加絲氨酸乙酰轉移酶活性，降低半胱氨酸脫巰基酶活性并提高氨基酸胞外運輸能力，使大腸桿菌BL21(DE3)制備L-半胱氨酸的能力得到大幅度提高。通過對培養基的碳源、氮源、礦物鹽及維生素、發酵時間、溫度、氫離子濃度指數等指標的研究，確定了利用上文所述菌種制備L-半胱氨酸的最佳發酵條件。具體地說，本發明解決其技術問題所采取的技術方案是本發明的大腸桿菌的基因組以大腸桿菌BL21(DE3)為模板，具有如SEQIDNO.1所示序列的絲氨酸乙酰轉移酶，缺失基因metC、基因tnaA、基因gshA和基因dfp。進一步地，本發明所述大腸桿菌具有通過載體pET22b表達的基因bcr。本發明使用大腸桿菌制備L-半胱氨酸的方法是將大腸桿菌先放入種子培養基中培養，后再放入發酵培養基中得到L-半胱氨酸；所述大腸桿菌的基因組以大腸桿菌BL21(DE3)為模板，具有如SEQIDNO.1所示序列的絲氨酸乙酰轉移酶，缺失基因metC、基因tnaA、基因gshA和基因dfp。進一步地，本發明所述大腸桿菌具有通過載體pET22b表達的基因bcr。進一步地，本發明所述種子培養基中含有葡萄糖、蛋白胨、酵母浸出物和氯化鈉，所述發酵培養基中含有葡萄糖、玉米粉、牛肉膏、乳糖、氯化鈉、硫酸銨、硫酸鎂、檸檬酸鈉和硫代硫酸鈉，所述種子培養基和發酵培養基的PH值均為7。進一步地，本發明所述大腸桿菌在種子培養基中進行培養時的溫度為3540°C，培養時間為2030小時；在發酵培養基中進行培養時的溫度為3540°C，培養時間為3660小時。與現有技術相比，本發明的有益效果是用基因工程手段改造大腸桿菌代謝途徑，提高L-半胱氨酸在培養基中的積累。通過基因定點突變提高絲氨酸乙酰轉移酶的活性，同時用基因敲除的手段抑制L-半胱氨酸在細菌體內的代謝，并提高半胱氨酸的胞外運輸能力達到高產L-半胱氨酸的目的，滿足了工業化需求。利用本發明大腸桿菌發酵制備L-半胱氨酸，其底物的轉化率和L-半胱氨酸的產量得到很大提高，底物的轉化率可達到30%，比現有技術提高50%以上；L-半胱氨酸的產量相對于現有技術可提高20%以上。圖1是原始菌種和改造后菌種發酵制備L-半胱氨酸糖轉化率的比較圖。圖2是原始菌種和改造后的菌種發酵產L-半胱氨酸產量的比較圖。圖3是L-半胱氨酸產量與發酵溫度的關系圖。圖4是L-半胱氨酸產量與發酵時間的關系圖。圖5是導入pET22b_bcr前后L-半胱氨酸產量的比較圖。具體實施例方式下面通過實施例進一步說明本發明，且僅僅是為了說明的目的，而非限制本發明的范圍。本發明所得到的大腸桿菌是以大腸桿菌BL21(DE3)為初始菌種，使大腸桿菌BL21(DE3)的cysE基因編碼的絲氨酸乙酰轉移酶第95位的纈氨酸被精氨酸所替代，第96位的天冬氨酸被脯氨酸所替代，從而絲氨酸乙酰轉移酶具有如SEQIDN0.1所示的序列，使L-半胱氨酸脫巰基酶活性被抑制。接著，敲除胱硫醚β裂解酶表達基因metC，敲除半胱氨酸脫巰基酶表達基因tnaA，敲除谷氨酸半胱氨酸連接酶表達基因gshA，敲除磷酸泛酸半胱氨酸連接酶表達基因dfp。進一步地，通過載體pET22b表達氨基酸流出系統蛋白表達基因bcr，本發明獲得的大腸桿菌可增加氨基酸胞外釋放能力。一、以下舉例說明本發明大腸桿菌的獲得方法。(一)大腸桿菌BL21(DE3)絲氨酸乙酰轉移酶(SAT)的改造應用基因組定點突變技術，通過改變SAT表達基因cysE的第95、96位氨基序列減少L-半胱氨酸對SAT的反饋抑制，從而提高SAT的活性。具體步驟如下首先，根據基因cysE設計引物如下，弓I物1:agctgagtcgacatgtcgtgtgaagaactggaa弓I物2:agctgatctagaatagatgattacatcgcatcc弓丨物3:acccgcgacccggcaagacccaaatactcaacc弓I物4cggggttgagtatttKggtcttgccgggtcgcg以上引物中下劃線標注處為突變位點。其中，引物1和引物2是根據大腸桿菌cysE基因序列設計，以用作cysE基因克隆；引物3和引物4是根據大腸桿菌cysE基因序列設計，以用作cysE定點突變。通過三輪PCR基因擴增得到突變的cysE核酸片段。反應體系如下表1所示。表1第一輪第二輪第三輪ddH2035μ135μ135μ110XPCR緩ΤΦ夜5μ15μ15μ1MaCl2(25mM)3μ13μ13μ1dNTP(2.5mM)2μ12μ12μ1引物1和引引物2和引物4引物引物1和引物2各2μ1物3各1各2μ1Taq酶1μ11μ11μ1第一輪第二輪產物各1DNA模板基因組Ιμ基因組Iulμ1總反應體系50μ150μ150μ1上述三輪PCR都是按照以下反應條件進行的將50μ1PCR反應液混勻后放入PCR儀，95°C孵育5分鐘活化Taq酶，94°C熱擊30秒使DNA雙鏈打開，55°C退火30秒使引物結合到DNA片段上，72°C延伸90秒。重復熱擊、退火和延伸這個循環35次，然后72°C孵育10分鐘后，在4°C保存。得到的DNA片度轉入事先轉入了質粒PKD46的BL21(DE3)大腸桿菌中，通過同源重組整合到大腸桿菌的基因組上，達到基因改造的目的，獲得具有如SEQIDNO1所示序列的絲氨酸乙酰轉移酶。質粒pKD46表達λ噬菌體的DNA重組酶，能夠提高細菌內基因組重組的水平。(二)大腸桿菌的L-半胱氨酸脫巰基酶的抑制用卡那霉素抗性基因作為篩選標記，利用如SEQIDNo.6-13所示的引物5-12在卡那霉素抗性基因的兩端加上目的基因兩側的同源臂，轉入帶有質粒PKD46的Β121(DE3)大腸桿菌中，通過同源重組整合到大腸桿菌的基因組上，將目的基因敲除掉。其中，引物5和引物6根據大腸桿菌tnaA基因序列設計，以用作tnaA的敲除；引物7和引物8根據大腸桿菌metC基因序列設計，以用作metC的敲除；引物9和引物10根據大腸桿菌gshA基因序列設計，以用作gshA的敲除；引物11和引物12根據大腸桿菌dfp基因序列設計，以用作dfp的敲除。本發明利用這個方法分別敲除了絲氨酸乙酰轉移酶(SAT)被改造后的大腸桿菌BL21(DE3)中的tnaA、metC、gshA和dfp基因。如前所述，其中，引物5和引物6用于敲除tnaA基因，引物7和引物8用于敲除metC基因，引物9和引物10用于敲除gshA基因，引物11和引物12用于敲除dfp基因。對此時大腸桿菌BL21(DE3)中的L-半胱氨酸的含量進行檢測，可發現敲除其中任意一個基因都能使大腸桿菌BL21(DE3)中L-半胱氨酸的含量得到提高。上述四個基因被敲除后即得到本發明的大腸桿菌BL21(DE3)cysE*ΔtnaAΔmetCΔgshAΔdfp0該大腸桿菌的基因組以大腸桿菌BL21(DE3)為模板，具有如SEQIDNO.1所示序列的絲氨酸乙酰轉移酶，缺失基因metC、基因tnaA、基因gshA、基因dfp。(三)大腸桿菌BL21(DE3)cysE*ΔtnaAΔmetCΔgShAΔdfp氨基酸排出功能的提聞。通過PCR得到bcr基因片段，bcr基因片段和質粒pET22b用BamHI和NcoI雙酶切后進行連接，得到pET22b-bcr。然后將pET22b_bcr轉入BL21(DE3)cysE*ΔtnaAΔmetCΔgshAΔdfp中，使該大腸桿菌的氨基酸排出功能得到提高。上述bcr基因片段和質粒pET22b的連接體系如下IOXbuffer1μ1PEG40001μ1Τ4連接酶1μ1pET22b酶切產物1μ1bcr酶切產物6μ1_總體積10μ1二、利用本發明的大腸桿菌BL21(DE3)cysE*ΔtnaAAmetCAgshAΔdfp制備L-半胱氨酸。實施例1分別挑取基因改造后得到的大腸桿菌BL21(DE3)cysE*ΔtnaAΔmetCΔgshAΔdfp和未改造的大腸桿菌BL21(DE3)單菌落到5ml種子培養基，在37°C溫度條件下以250rpm的轉速培養24小時；后從中取2ml加入裝有200ml發酵培養液的IOOOml搖瓶中，在37°C溫度條件下以200rpm的轉速發酵培養48小時。利用柱層析法，將發酵后的發酵培養液依次通過陰離子柱和陽離子柱得到L-半胱氨酸。本實施例中，種子培養基含有葡萄糖、蛋白胨、酵母浸出物和化鈉，發酵培養基中含有葡萄糖、玉米粉、牛肉膏、乳糖、氯化鈉、硫酸銨、硫酸鎂、檸檬酸鈉和硫代硫酸鈉，且種子培養基和發酵培養基的PH值均為7。以下對本發明制備L-半胱氨酸方法的效果進行檢測。取發酵前和發酵后的發酵培養液，分別用3，5-二硝基水楊酸比色法測定其總糖含量，然后根據測得的數值計算出基因改造前的大腸桿菌BL21(DE3)和基因改造后的本發明大腸桿菌BL21(DE3)cysE*ΔtnaAΔmetCΔgShAΔdfp的糖轉化率，結果如圖1所示。由圖1可知，基因改造前的原始大腸桿菌BL21(DE3)的糖轉化率幾乎為0，而本發明大腸桿菌BL21(DE3)cysE*ΔtnaAΔmetCΔgshAΔdfp的糖轉化率則達到50%。用ellman法檢測發酵液中L-半胱氨酸的產量。具體如下取Iml發酵后的發酵培養液，在IOOOOXg的離心力下離心1分鐘，從中取100μ1上清液加入3mlH20,800μ1ρΗ為8的Tris·HCl禾口100μ120mM的DNTB，再用分光光度計測出其在412納米波長下的吸光值(0D412)，根據L-半胱氨酸標準曲線計算出發酵后的發酵培養液中L-半胱氨酸的產量，結果如圖2所示。由圖2可知，基因改造前的大腸桿菌BL21(DE3)的L-半胱氨酸產量幾乎為0，而本發明大腸桿菌BL21(DE3)cysE*ΔtnaAΔmetCΔgshAΔdfp的L-半胱氨酸產量則達到1000mg/l，相對于大腸桿菌BL2KDE3)中的L-半胱氨酸產量提高了很多。實施例2-實施例10挑取BL21(DE3)cysE*ΔtnaAΔmetCΔgshAΔdfp大腸桿菌單菌落到5mlLB培養基，在37°C溫度條件下以250rpm的轉速在種子培養基中培養至對數生長期。取2ml加入裝有200ml的發酵培養基的IOOOml搖瓶中分別在表2所示的發酵條件下進行發酵培養。利用柱層析法，將發酵后的發酵培養液依次通過陰離子柱和陽離子柱得到L-半胱氨酸。利用實施例1所記載的ellman法檢測L-半胱氨酸的產量，結果如圖3、圖4和表2所示。其中，種子培養基和發酵培養液的成分與實施例1相同。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例11分別挑取本發明構建的帶pE／22b—bcr的BL2l(DE3)CYSE*△tnaA△metC△gShA△dfp和不帶pE／22b—bCr的BL2l(DE3)cysE*AtnaAΔmetCAgshAAdfp大腸桿菌菌種，以實施例1的種子培養液和發酵培養液進行發酵培養，在37°C的溫度條件下以200rpm轉速培養48小時，然后用實施例1所記載的ellman法測定發酵液中L-半胱氨酸的產量。結果如圖5所示，在大腸桿菌BL21(DE3)cysE*ΔtnaAΔmetCΔgshAΔdfp導入pET22b_bcr，使L-半胱氨酸的產量提高了200毫克/升，約20%。由以上各實施例可以看到，使用本發明改造后的大腸桿菌BL21(DE3)cysE*AtnaAAmetCAgshAAdfp發酵制備L-半胱氨酸的能力與改造前的大腸桿菌BL21(DE3)相比有了巨大的提高，另外再導入連接氨基酸流出系統蛋白表達基因bcr的表達載體pET22b后，L-半胱氨酸的產量有了更進一步的提高。權利要求一種大腸桿菌，其特征是該大腸桿菌的基因組以大腸桿菌BL21(DE3)為模板，具有如SEQIDNO.1所示序列的絲氨酸乙酰轉移酶，缺失基因metC、基因tnaA、基因gshA和基因dfp。2.根據權利要求1所述的大腸桿菌，其特征是所述大腸桿菌具有通過載體pET22b表達的基因bcr。3.一種使用大腸桿菌制備L-半胱氨酸的方法，其特征是將大腸桿菌先放入種子培養基中培養，后再放入發酵培養基中，發酵得到L-半胱氨酸；所述大腸桿菌的基因組以大腸桿菌BL21(DE3)為模板，具有如SEQIDNO.1所示序列的絲氨酸乙酰轉移酶，缺失基因metC、基因tnaA、基因gshA和基因dfp。4.根據權利要求3所述的制備L-半胱氨酸的方法，其特征是所述大腸桿菌具有通過載體pET22b表達的基因bcr。5.根據權利要求3或4所述的制備L-半胱氨酸的方法，其特征是所述種子培養基中含有葡萄糖、蛋白胨、酵母浸出物和氯化鈉，所述發酵培養基中含有葡萄糖、玉米粉、牛肉膏、乳糖、氯化鈉、硫酸銨、硫酸鎂、檸檬酸鈉和硫代硫酸鈉，所述種子培養基和發酵培養基的pH值均為7。6.根據權利要求3或4所述的制備L-半胱氨酸的方法，其特征是所述大腸桿菌在種子培養基中進行培養時的溫度為3540°C，培養時間為2030小時；在發酵培養基中進行培養時的溫度為3540°C，培養時間為3660小時。全文摘要本發明公開了一種大腸桿菌和使用該大腸桿菌制備L-半胱氨酸的方法。該大腸桿菌的基因組以大腸桿菌BL21(DE3)為模板，具有如SEQIDNO.1所示序列的絲氨酸乙酰轉移酶，缺失基因metC、基因tnaA、基因gshA、基因dfp。將上述大腸桿菌先放入種子培養基中培養，后再放入發酵培養基中，發酵得到L-半胱氨酸。本發明的有益效果是利用本發明大腸桿菌發酵制備L-半胱氨酸，其底物的轉化率和L-半胱氨酸的產量得到很大提高，底物的轉化率可達到30％，比現有技術提高50％以上；L-半胱氨酸的產量相對于現有技術可提高20％以上。文檔編號C12R1/19GK101831397SQ20101013636公開日2010年9月15日申請日期2010年3月30日優先權日2010年3月30日發明者張建國,謝志鵬,陳聰申請人:杭州寶晶生物化工有限公司