專利名稱：一種基于mRNA質核比變化的miRNA靶基因鑒定方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基于mRNA質核比變化的miRNA靶基因快速、準確鑒定方法；涉及 該方法在生物醫學領域中的應用。
背景技術：
microRNA簡稱miRNA，是一種21-25個堿基的非編碼小分子RNA，它廣泛存在于真 核生物中。miRNA基因的初級轉錄產物(pri-miRNA)在細胞核中被RNaseIII Drosha切割 成為前體11^1 ^(口儀-1^1 ^)4儀-1^1 ^在轉運蛋白5(61口01^1115)的作用下由核內轉到胞 質中，然后由另一種RNaseIII Dicer進一步切割產生成熟的miRNA。這些成熟的miRNA與 其他蛋白質一起組成RISC (RNA-induced silencing complex)復合體，從而引起靶mRNA的 降解或者翻譯抑制。大量研究表明，miRNA參與了包括細胞分裂增殖、分化與發育以及代謝 等許多重要的生物學過程。但是已經鑒定2的數百條miRNA生物學功能仍然不十分清楚， 最主要的原因是這些miRNA的真正靶基因不清楚。預測超過1/3的人類基因都是保守的 miRNA靶基因，如何快速、準確定特定miRNA的靶標mRNA是目前有關miRNA研究的瓶頸。加 上哺乳動物miRNA與靶標mRNA之間的序列不完全互補性，使得靶標mRNA的確定更加困難。隨著生物信息學的不斷發展，一些重要的規則、模式及算法不斷應用于miRNA的 靶標預測。從2003年第一個靶基因預測軟件miRanda到現在，短短的幾年時間，已涌現出 10余個靶基因預測軟件。利用生物信息學的方法預測miRMA的靶標，無疑能夠很大程度上 避免mRNA靶標尋找的盲目性。但是，生物信息學預測結果往往顯示一個特定miRNA的潛在 靶標可以是數個、甚至數百個。與此同時，也有不同的研究小組用實驗方法來尋找miRNA的 靶標，如將特定miRNA在細胞中過表達或者抑制miRNA之后，利用基因芯片分析mRNA的變 化，以此找出相應miRNA的靶基因。最近人們利用AGO蛋白家族既能結合miRNA又能結合 mRNA的特性，結合免疫共沉淀的方法來分析與AGO結合的mRNA，作為潛在的miRNA靶標。也 有學者通過在培養基種添加同位素標記的氨基酸從蛋白質組學角度來尋求miRNA對應靶 標。實驗結果都表明這些實驗方法的引入發展都是對生物信息學靶標預測的有力補充。但 是，很不幸到目前為止沒有一種實驗方法能夠快速、有效、準確的發現miRNA的靶標。越來越多的實驗證據表明，miRNA靶基因不但可以很多，而且在不同的細胞或相同 細胞的不同狀態之間都可能發生變化，即某一 miRNA的功能性靶基因是動態可變的。如何 確定某一細胞在特定狀態下的功能性靶標對詮釋miRNA的功能具有重要意義。我們通過實驗發現，細胞內mRNA質核比變化與miRNA靶標之間有密切相關性。本 發明是結合生物信息學預測和細胞內潛在miRNA靶標mRNA質核比變化分析以及Western blot驗證，建立了一種快速、準確鑒定miRNA靶基因的方法，該發明可以在miRNA靶基因鑒 定方面具有廣泛應用。
發明內容
本發明目的在于建立一種快速、準確miRNA靶基因鑒定方法，該發明可以在醫藥
3學中得到廣泛應用。本發明通過以下技術方案實現首先通過現有的miRNA靶標預測生物信息學軟件 如Targetscan預測某一 miRNA的可能靶基因，然后利用生物芯片或實時定量PCR測定細胞 內可能靶基因mRNA質核比變化，尋找mRNA質核比值大于1的可能靶基因，最后經Western blot在蛋白質水平進一步確證即可。本發明中應用miRNA靶標預測生物信息學軟件可以是目前任何常用軟件，本發明 針對的miRNA是絕大多數目前已知的人類miRNA和其他哺乳動物細胞miRNA。本發明優點本發明明建立的miRNA靶基因鑒定技術，具有簡單、快速、準確的優
點ο
圖1 利用生物芯片測定獲得的miR-200b在HeLa細胞中預測靶基因的質核比值。圖2 =Western blot在蛋白質水平確證miR_200b在HeLa細胞中的功能靶基因。
具體實施例方式下畫通過具體的應用本發明技術方法鑒定miR_200b在HeLa細胞中的功能靶基因 來進一步描述本發明。1.生物信息學預測綜合運用 TargetScan、miRanda> DIANAmicroT、PicTar、RNAHybricU miRGen++> MiTarget, TarBase等生物信息學軟件預測miR_200b的潛在靶基因，隨機選擇積分靠前的 基因為目標(圖1)。2. HeLa細胞質和細胞核RNA提取利用細胞質/細胞核RNA提取試劑盒(Norgen)提取HeLa細胞RNA，主要步驟如 下1)收集3xl06細胞，用冰預冷的PBS清洗一次，加入200 μ 1冰預冷的裂解液，混勻 15秒。2)待裂解完全，室溫，16，OOOrpm離心3分鐘，轉移含有細胞質RNA的上清至新的 離心管，同時保留含有細胞核RNA的沉淀。3)細胞質管中加入200 μ 1結合緩沖液，細胞核管中加入400 μ 1結合緩沖液，混勻 10秒。4)管中繼續加入200 μ 1無水乙醇，混勻10秒。分別轉移混合液至兩個結合柱中， 12，OOOrpm離心1分鐘。5)分別加入400 μ 1洗滌緩沖液漂洗，12，OOOrpm離心1分鐘。重復漂洗1次。6)兩個結合柱中分別加入50洗脫緩沖液，2，OOOrpm離心2分鐘，接種14，OOOrpm 離心1分鐘。收集洗脫液，-70°C保存。3.生物芯片測定獲得的miR_200b在HeLa細胞中預測靶基因的質核比值及結果分 析1)利用華聯人類全基因體生物芯片(PhalanxBiotech Group, Taiwan)分析HeLa 細胞質和細胞核RNA。
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2)根據芯片結果，分析生物信息學預測的miR_200b的潛在靶基因mRNA的質核比， 確定miR-200b的功能靶基因。4. Western blot在蛋白質水平進一步確證miR_200b在HeLa細胞中的功能靶基 因。1)細胞培養將生長在DMEM中狀態良好的HeLa細胞用胰酶消化后重新種植于24孔板中，每孔 細胞數為IX IO5個，500 μ 1體積。37°C，5% CO2條件下培養24小時。2)miR-200b mimics 的轉染miR-200b mimics 是運用化學方法合成的 miR_200b 模擬物(Ger^pharma)， 同時使用NC(Negative control)mimics作為陰性對照，用量均為30pmol/孔，脂質體 lipofectamine 2000 (invitrogen)用量為 2 μ 1/ 孔。將需轉染核酸用 50 μ 1 無血清 DMEM 稀釋混勻，同時也將2 μ 1脂質體用50 μ 1無血清DMEM稀釋，再將兩者合并混勻，室溫靜置 20分鐘后，加入24孔板中。細胞繼續培養6小時后，更換新鮮DMEM(10% FBS)培養基。3)細胞裂解及 Western-blota.經轉染處理48小時的細胞，消化收集，用PBS清洗二次，于2倍細胞體積冰冷 的細胞裂解液(50mM Tris-HCl ；pH 7. 4 ；1% NP-40 ；0. 25% sodium deoxycholate ； 150mM NaCl ；ImMeach EDTA, PMSF, Na3VO4, and NaF,1 μ g/ml each aprotinin, leupeptin, and ρ印statin)中0°C裂解20分鐘。b. 10，000Xg，4°C離心20分鐘，收集上清，蛋白定量。c. 50 Ug總蛋白10% SDS-PAGE,電泳時采用預染蛋白標準以便于檢測轉移效率。d.剪取大小合適的超厚濾紙和硝酸纖維素(NC)膜，分別浸泡于轉移緩沖液和蒸 餾水中。e.于半干轉移儀上按濾紙、NC膜、SDS-PAGE后的凝膠、濾紙的順序鋪放整齊，排除 氣泡，20V以下恒壓轉移30分鐘。f.轉移后的NC膜于封閉液中室溫封閉1-2小時。g.倒出封閉液，一抗1 500稀釋于含有2% BSA的TBST中，室溫與膜孵育3小 時；h. TBST清洗3次，每次15分鐘。i. 二抗1 5000稀釋于2% BSA的TBST中，室溫孵育1小時；TBST清洗3次，最 后用TBS清洗1次，每次15min。i.顯色ECL試劑顯色，按ECL試劑盒說明書進行。實驗結果生物芯片結果顯示生物信息學預測的miR_200b潛在靶基因mRNA具有不同核質比 (圖 1)。分析生物芯片結果，確立靶基因mRNA質核比標準，質核比大于1，為miR_200b在 HeLa細胞中的功能靶標，質核比小于1，則不是miR_200b在HeLa細胞中的功能靶標(圖 1)。Western blot驗證結果與芯片分析結果完全一致(圖2)。
權利要求
一種miRNA靶基因的快速鑒定方法，其特征在該技術方法包括通過生物信息學預測、預測靶基因細胞內mRNA質核比測定和分析、Westernblot在蛋白質水平確證三個步驟，其中最關鍵的步驟是預測靶基因細胞內mRNA質核比測定和分析。
2.根據權利要求1中所述方法，其中生物信息學預測所用軟件可以是文獻所用任何有 效的miRNA靶基因預測軟件。
3.根據權利要求1中所述方法，其中細胞內預測靶基因mRNA質核比值可以通過生物芯 片或實時定量PCR完成。
4.根據權利要求1中所述方法，其中miRNA是指絕大多數目前已知的人類miRNA和其 他哺乳動物細胞miRNA。
5.權利要求1所述結構的技術方法miRNA靶基因鑒定及其醫藥研究領域中的應用。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，涉及一種基于mRNA質核比變化的miRNA靶基因快速、準確鑒定方法；涉及該方法在生物醫學領域中的應用。本發明通過以下技術方案實現首先通過現有的miRNA靶標預測生物信息學軟件，如Targetscan，預測某一miRNA的可能靶基因，然后利用生物芯片或實時定量PCR，測定細胞內可能靶基因mRNA質核比變化，尋找mRNA質核比值大于1的可能靶基因，最后經Western blot在蛋白質水平進一步確證即可。
文檔編號C12Q1/68GK101962673SQ20101013182
公開日2011年2月2日 申請日期2010年3月25日 優先權日2010年3月25日
發明者丁紅梅, 夏偉, 李少華, 李潔, 王芳, 蘇雪婷, 邵寧生, 陳留存, 黃寶春 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所