一種提取基因組脫氧核糖核酸的方法

文檔序號：582610閱讀：511來源：國知局

專利名稱：一種提取基因組脫氧核糖核酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種提取基因組脫氧核糖核酸的方法，屬于生物中核酸應用技術領域。
背景技術：
在傳統的基因分型、轉基因檢測、品系檢測實驗中，人們比較慣用的方法是，采用手工抽提或者是購買一般的基因組脫氧核糖核酸(以下簡稱DNA)提取試劑盒進行。但是，不管是采用手工抽提還是購買試劑盒進行提取，整個提取過程都要取一定量的材料，經過液氮研磨一裂解液裂解一孵育一離心一有機抽提(或者過柱)一漂洗數次一晾干一溶解 (或者洗脫)這樣的流程，最終得到DNA。而往往這些DNA僅僅是用作基因鑒定的聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,以下簡稱PCR)模板，用過一次后DNA便扔了，當然，同時那些陰性的小老鼠們和那些陰性的擬南芥們，也扔了。也許這種操作得到的DNA純度和得率都是高的，但是即使不考慮使用液氮研磨時可能凍傷操作者的風險，整個提取過程由于步驟繁瑣，使用的儀器眾多，等待時間很長。

發明內容
本發明的目的是提出一種提取基因組脫氧核糖核酸的方法，采用了特殊的技術，旨在建立成熟穩定的、一步法直接從各種材料中提取DNA，用于各種基因的PCR檢測體系。
本發明提出的提取基因組脫氧核糖核酸的方法，包括以下步驟
(1-1)將裂解緩沖液加入到植物組織、動物組織或細菌中的任何一種材料中，將材料研碎，并渦旋混勻，得到第一混濁液，加入的質量體積比為植物材料、動物材料或細菌中
的任何一種裂解緩沖液=io毫克200微升； (1-2)在上述第一混濁液中加入質量體積比濃度為10-20毫克/毫升的蛋白酶K，加入的體積為5-20微升，混勻，55-65。C下孵育5_30分鐘，80-95。C加熱3_10分鐘，得到第二混濁液； (1-3)對上述第二混濁液進行離心分離，離心轉速為8000-13000轉/分鐘，離心時間為3-5分鐘，得到離心分離的上清液，上清液中含有脫氧核糖核酸。上述方法中，裂解緩沖液的組成為pH值為8. 0、摩爾濃度為20-50毫摩爾/升的三羥甲基氨基甲烷.鹽酸，摩爾濃度為2. 0-4. 0毫摩爾/升的乙二胺四乙酸以及摩爾濃度為20-50毫摩爾/升的氯化鈉。本發明提出的提取基因組脫氧核糖核酸的方法，其優點是 1、基因檢測的首要條件是獲得足夠的DNA，所謂足夠的DNA對其數量和質量的要求并不需要太高，只要滿足PCR條件即可。本發明方法提出了一步法直接提取DNA用于PCR 擴增，顧名思義采用一步法裂解材料，收獲DNA，用于PCR擴增，操作簡單快速，結果準確重復性好。本方法的好處在于一步法提取DNA，即不用液氮研磨，不需要酶解和長時間孵育，一次性裂解材料，材料范圍廣，植物組織、動物組織、細菌都適用，操作時間短，直接應用于基因檢測等，具有快速簡便、靈敏度高、特異性強、穩定性好等優點，可最大限度的減少人為誤差。 2、直接PCR適用于對DNA的純度和得率要求不是極高的實驗，如基因檢測等，操作者只需一步將材料與裂解液混合，必要時將材料破碎，離心得到DNA，取1微升作為模板用于20微升的PCR反應體系，便可確定目的基因的有無。比如在轉基因篩選中，采用直接PCR 的方法，可瞬時得到DNA模板用于PCR鑒定，快速確定是否為轉基因個體，不用花精力照顧陰性的幼苗或幼體，節省了大量資源。此外，本發明方法還適用于品系檢測、種子純度檢測和分子標記等實驗。本發明提出了一步法、快速的DNA提取方法，用于PCR檢測，快速、便捷、安全，效率高、穩定性好，適合包括植物組織、種子、細菌和動物組織的PCR檢測。

圖1是對本發明實施例1獲得的DNA進行泛素基因PCR擴增的檢測結果。
圖2是對本發明實施例2獲得DNA進行凝集素基因PCR擴增的檢測結果。
圖3是對本發明實施例3獲得DNA進行內參基因PCR擴增的檢測結果。
圖4是對本發明實施例4獲得DNA進行通用引物PCR擴增的檢測結果。
圖5是對本發明實施例5獲得DNA進行內參基因PCR擴增的檢測結果。
具體實施例方式本發明提出的提取基因組脫氧核糖核酸的方法，包括以下步驟 (1-1)將裂解緩沖液加入到植物組織、動物組織或細菌中的任何一種材料中，將材料研碎，并渦旋混勻，得到第一混濁液，加入的質量體積比為植物材料、動物材料或細菌中
的任何一種裂解緩沖液=io毫克200微升； (1-2)在上述第一混濁液中加入質量體積比濃度為10-20毫克/毫升的蛋白酶K，加入的體積為5-20微升，混勻，55-65。C下孵育5_30分鐘，80-95。C加熱3_10分鐘，得到第二混濁液； (1-3)對上述第二混濁液進行離心分離，離心轉速為8000-13000轉/分鐘，離心時間為3-5分鐘，得到離心分離的上清液，上清液中含有脫氧核糖核酸。上述方法中，裂解緩沖液的組成為pH值為8. 0、摩爾濃度為20-50毫摩爾/升的三羥甲基氨基甲烷.鹽酸，摩爾濃度為2. 0-4. 0毫摩爾/升的乙二胺四乙酸以及摩爾濃度為20-50毫摩爾/升的氯化鈉。
以下是本發明方法的實施例在實施例中所采用的一些試劑來源天根生化科技(北京)有限公司生產的2x PCRReagent、蛋白酶K，和滅菌水。
實施例1 : 1 、將200 iU裂解緩沖液加入到10mg擬南芥葉片中，將材料研碎，并渦旋混勻，得到第一混濁液； 2、在上述第一混濁液中加入濃度為20mg/ml的蛋白酶K，加入的體積為10 y 1，混勻，55t:下孵育10分鐘，85t:加熱5分鐘，得到第二混濁液；
3、對上述第二混濁液進行離心分離，離心轉速為13000轉/分鐘，離心時間為3分
鐘，得到離心分離的上清液，上清液中含有脫氧核糖核酸。實施例2 : 1 、將200 ill裂解緩沖液加入到10mg大豆葉片中，將材料研碎，并渦旋混勻，得到第一混濁液； 2、在上述第一混濁液中加入濃度為20mg/ml的蛋白酶K，加入的體積為10iU，混勻，55t:下孵育10分鐘，85t:加熱5分鐘，得到第二混濁液； 3、對上述第二混濁液進行離心分離，離心轉速為13000轉/分鐘，離心時間為3分
鐘，得到離心分離的上清液，上清液中含有脫氧核糖核酸。實施例3 : 1 、將200 iil裂解緩沖液加入到lOmg水稻葉片中，將材料研碎，并渦旋混勻，得到第一混濁液； 2、在上述第一混濁液中加入質量體積比濃度為20mg/ml的蛋白酶K，加入的體積
為10iil，混勻，55t:下孵育10分鐘，85t:加熱5分鐘，得到第二混濁液； 3、對上述第二混濁液進行離心分離，離心轉速為13000轉/分鐘，離心時間為3分
鐘，得到離心分離的上清液，上清液中含有脫氧核糖核酸。實施例4 : 1 、將200 iU裂解緩沖液加入到800 y 1菌液收集的菌體中中，并渦旋混勻，得到第一混濁液； 2、在上述第一混濁液中加入質量體積比濃度為20mg/ml的蛋白酶K，加入的體積
為10iil，混勻，55t:下孵育10分鐘，85t:加熱5分鐘，得到第二混濁液； 3、對上述第二混濁液進行離心分離，離心轉速為13000轉/分鐘，離心時間為3分
鐘，得到離心分離的上清液，上清液中含有脫氧核糖核酸。實施例5: 1 、將200 iil裂解緩沖液加入到lOmg小鼠組織中，將材料研碎，并渦旋混勻，得到第一混濁液； 2、在上述第一混濁液中加入質量體積比濃度為20mg/ml的蛋白酶K，加入的體積
為10iil，混勻，55t:下孵育30分鐘，85t:加熱5分鐘，得到第二混濁液； 3、對上述第二混濁液進行離心分離，離心轉速為13000轉/分鐘，離心時間為3分
鐘，得到離心分離的上清液，上清液中含有脫氧核糖核酸。以下是對用本發明方法提取的DNA進行檢測的實例檢測實例1 :對實施例1得到的DNA進行檢測以實施例1中得到的DNA為模板，擬南芥UBQ基因特異引物
,l-F 5 'CAGGACAAAGAGGGAATACC 3'，R 5' GTTGAACAGGAGGGATACC 3'，
圃2-F 5' ATGTTTTTCGATGGATACCA 3'，R 5' GATTGCGTTAGCAGGCTTTG 3'，圃3-F
5， ATGTTTTTCGATGGATACCA 3，， R 5， TCAACCCCTCAATGAATAC 3，進行258bp片段、1160bp片
段和1610bp片段的PCR擴增，PCR反應系為 2x PCR Reagent 10 ii 1 正向引物(10微摩爾每升，簡稱iiM) 0.5iU
5
反向引物(IO微摩爾每升，簡稱iiM) 0.5iU
模板DNA liil
滅菌水補至20 ii 1 試劑全部加好后，瞬時離心，將所有試劑收集到管底。
PCR反應循環的設置
94°C 3min， 1循環 94°C 30秒(second,以下簡稱sec) ， 55°C 30sec， 72°C lmin 35循環;
72。C5min，l循環結果檢測反應結束后取8 1反應產物，瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳條件為用 0. 5XTBE電泳緩沖液配制2% (W/V)的瓊脂糖凝膠，凝膠融化后加入含量為0. 5/ml的溴化乙啶。按比例將8iU的PCR反應產物與上樣緩沖液均勻混合，然后加入到凝膠孔中，以5V/ cm的電壓進行電泳，電泳時間為40-60分鐘。電泳結束后將凝膠置于凝膠成像儀上觀察并照相。結果見圖1 :點樣順序為1. DNA marker ;2、3. 258bp片段；4、5. 1160bp片段；6、 7. 1610bp片段。由圖1可見，采用本發明方法提取的擬南芥葉片DNA，進行特異引物的PCR 擴增，得到的擴增片段與預期的擴增片段大小一致，所以用本方法提取的DNA完全能夠滿足基因檢測的要求。
檢測實例2 :對實施例2得到的DNA進行檢測以實施例2中得到的DNA為模板，大豆lectin基因特異引物lectin-F : 5， GCCCTCTACTCCACCCCCATCC 3，，R :5' GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG 3，， lectin_F5， ATGGCCA CCTCCAACTTCTCTA 3'，R 5'AGTTCACGTCAATGCCGAT 3'，進行118bp片段和6Q0bp片段的PCR
擴增，PCR反應系為 2x PCR Reagent 10 ii 1 正向引物(10iiM) 0.5 ill 反向引物(10iiM) 0.5 ill 模板DNA 1 ii 1 滅菌水補至20 ii 1 試劑全部加好后，瞬時離心，將所有試劑收集到管底。
PCR反應循環的設置
94°C 3min， 1循環94°C 30秒(second,以下簡稱sec) ， 55°C 30sec， 72°C lmin 35循環;
72。C5min，l循環結果檢測反應結束后取8 1反應產物，瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳條件為用 0. 5XTBE電泳緩沖液配制2% (W/V)的瓊脂糖凝膠，凝膠融化后加入含量為0. 5/ml的溴化乙啶。按比例將8iU的PCR反應產物與上樣緩沖液均勻混合，然后加入到凝膠孔中，以5V/ cm的電壓進行電泳，電泳時間為40-60分鐘。電泳結束后將凝膠置于凝膠成像儀上觀察并照相。結果見圖2，點樣順序為1. DNA Marker ;2、3. 118bp片段；4.陽性對照；5、 6.600bp片段；7.陽性對照。由圖2可見，采用本發明方法提取的大豆葉片DNA，進行特異引物的PCR擴增，得到的擴增片段與陽性對照的擴增片段大小一致，所以用本方法提取的DNA 完全能夠滿足基因檢測的要求。檢測實例3 :對實施例3得到的DNA進行檢測以實施例3中得到的DNA為模板，水稻內源基因引物F 5 'CGATGTCAAGCGTTACTCTA 3'，R 5 'AGGTGGTGGTGGCTCAATAT 3'禾口F 5 'CGATGTCAAGCGTTACTCTA 3，，R 5 'CAGACATTATCAGCTGGTAC 3，，進行272bp片段和694bp 片段的PCR擴增，PCR反應系為2x PCR Reagent10 ii 1正向引物(10iiM)0. 5ii 1反向引物(lOiiM)0. 5ii 1模板DNA1 ii 1滅菌水補至20 ii 1試劑全部加好后，瞬時離心，將所有試劑收集到管底。
PCR反應循環的設置94°C 3min， 1循環94°C 30秒(second,以下簡稱sec) ，55°C 30sec，72。C lmin 35循環;
72 °C 5min， 1循環結果檢測反應結束后取8il1反應產物，瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳條件為用
0. 5XTBE電泳緩沖液配制2% (W/V)的瓊脂糖凝膠，凝膠融化后加入含量為0. 5/ml的溴化乙啶。按比例將8iU的PCR反應產物與上樣緩沖液均勻混合，然后加入到凝膠孔中，以5V/ cm的電壓進行電泳，電泳時間為40-60分鐘。電泳結束后將凝膠置于凝膠成像儀上觀察并照相。結果見圖3，點樣順序為l.DNA Marker ;2、3.葉片DNA272bp片段；4、5.大米 DNA272bp片段；6.陽性對照；7、8.葉片DNA694bp片段；9、 10.大米DNA694bp片段；11.陽性對照。由圖3可見，采用本發明方法提取的水稻葉片DNA，進行特異引物的PCR擴增，得到的擴增片段與陽性對照的擴增片段大小一致，所以用本方法提取的DNA完全能夠滿足基因檢測的要求。
檢測實例4 :對實施例4得到的DNA進行檢測以實施例4中得到的DNA為模板，細菌通用引物16srDNA-F 5 'TAGCTGGTCTGAGAGGATGA 3'，R 5 'CTTGCCAGTATCAGATGCAGT，3進行297bp片段的PCR擴
增，PCR反應系為 2x PCR Reagent 10 ii 1 正向引物(IO微摩爾每升，簡稱iiM) 0.5iU
反向引物(IO微摩爾每升，簡稱iiM) 0.5iU
模板DNA 1 ii 1 滅菌水補至20 ii 1 試劑全部加好后，瞬時離心，將所有試劑收集到管底。 PCR反應循環的設置 94°C 3min， 1循環 94°C 30秒(second,以下簡稱sec) ， 55°C 30sec， 72°C lmin 35循環;
72。C5min，l循環結果檢測反應結束后取8 1反應產物，瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳條件為用 0. 5XTBE電泳緩沖液配制2% (W/V)的瓊脂糖凝膠，凝膠融化后加入含量為0. 5/ml的溴化乙啶。按比例將8iU的PCR反應產物與上樣緩沖液均勻混合，然后加入到凝膠孔中，以5V/ cm的電壓進行電泳，電泳時間為40-60分鐘。電泳結束后將凝膠置于凝膠成像儀上觀察并照相。結果見圖4，點樣順序為1.DNA Marker ;2-5.陰性菌DNA擴增；6-9.陽性菌DNA 擴增。由圖4可見，采用本發明方法提取的細菌DNA，進行特異引物的PCR擴增，得到的擴增片段與預期的擴增片段大小一致，所以用本方法提取的DNA完全能夠滿足基因檢測的要求。檢測實例5 :對實施例5得到的DNA進行檢測以實施例5中得到的DNA為模板，小鼠MILGFMAR2基因特異引物MILGFMAR2-F5， ATCCTCCTTCTATAGTCTGTCCAAGAGTAG3，， R5' CCTCCAGAAAAAGCTAGATACTAACCTT 3'進行332bp片段的PCR擴增，PCR反應系為
2x PCR Reagent 10 ii 1 正向引物(IO微摩爾每升，簡稱iiM) 0.5iU
反向引物(IO微摩爾每升，簡稱iiM) 0.5iU
模板DNA 滅菌水補至20iU
試劑全部加好后，瞬時離心，將所有試劑收集到管底。
PCR反應循環的設置
94。C3min，l循環94°C 30秒(second,以下簡稱sec) ，55°C 30sec，72。C lmin 35循環;
72。C5min，l循環結果檢測反應結束后取8iU反應產物，瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳條件為用
0. 5XTBE電泳緩沖液配制2% (W/V)的瓊脂糖凝膠，凝膠融化后加入含量為0. 5/ml的溴化乙啶。按比例將8iU的PCR反應產物與上樣緩沖液均勻混合，然后加入到凝膠孔中，以5V/ cm的電壓進行電泳，電泳時間為40-60分鐘。電泳結束后將凝膠置于凝膠成像儀上觀察并照相。結果見圖5，點樣順序為1.DNA Marker ;2.陰性對照；3.陽性對照；4、5.小鼠肝臟DNA擴增；6、7.小鼠心臟DNA擴增。由圖5可見，采用本發明方法提取的小鼠組織DNA，進行特異引物的PCR擴增，得到的擴增片段與陽性對照的擴增片段大小一致，而陰性對照并無擴增，所以用本方法提取的DNA完全能夠滿足基因檢測的要求。
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權利要求
一種提取基因組脫氧核糖核酸的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1-1)將裂解緩沖液加入到植物組織、動物組織或細菌中的任何一種材料中，將材料研碎，并渦旋混勻，得到第一混濁液，加入的質量體積比為植物材料、動物材料或細菌中的任何一種∶裂解緩沖液＝10毫克∶200微升；(1-2)在上述第一混濁液中加入質量體積比濃度為10-20毫克/毫升的蛋白酶K，加入的體積為5-20微升，混勻，55-65℃下孵育5-30分鐘，80-95℃加熱3-10分鐘，得到第二混濁液；(1-3)對上述第二混濁液進行離心分離，離心轉速為8000-13000轉/分鐘，離心時間為3-5分鐘，得到離心分離的上清液，上清液中含有脫氧核糖核酸。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的裂解緩沖液的組成為pH值為 8. 0、摩爾濃度為20-50毫摩爾/升的三羥甲基氨基甲烷.鹽酸，摩爾濃度為2. 0-4. 0毫摩爾/升的乙二胺四乙酸以及摩爾濃度為20-50毫摩爾/升的氯化鈉。
全文摘要
本發明涉及一種提取基因組脫氧核糖核酸的方法，屬于生物中核酸應用技術領域。將裂解緩沖液加入到植物組織、動物組織或細菌中的任何一種材料中，將材料研碎，并渦旋混勻，得到第一混濁液，在其中加入蛋白酶K，混勻，孵育得到第二混濁液；對第二混濁液進行離心分離，得到離心分離的上清液，上清液中含有脫氧核糖核酸。本方法即不用液氮研磨，不需要酶解和長時間孵育，一次性裂解材料，材料范圍廣，植物組織、動物組織、細菌都適用，操作時間短，直接應用于基因檢測等，具有快速簡便、靈敏度高、特異性強、穩定性好等優點，可最大限度的減少人為誤差。
文檔編號C12N15/10GK101792756SQ201010129818
公開日2010年8月4日申請日期2010年3月19日優先權日2010年3月19日
發明者俞萍, 孫克非, 李曉晨, 柯海燕申請人:天根生化科技(北京)有限公司

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