專利名稱：逆轉腎纖維化的新型融合蛋白的制備方法以及活性檢測的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫藥生物技術領域，具體涉及基因克隆、外源基因在原核細胞中的表 達、目的蛋白質的制備方法以及活性檢測，特別是逆轉腎纖維化的新型融合蛋白的制備方 法以及活性檢測。
背景技術：
(1)逆轉腎纖維化治療相關研究及存在的問題腎臟纖維化是不同病因(包括炎癥、損傷、藥物、糖尿病和遺傳因素、衰老等)所導 致慢性腎臟疾病的最終共同結局。各種進展性腎臟疾病，無論其原發病如何，最終都將導致 腎臟纖維化，進展為終末期腎功能衰竭，并必須依靠透析或腎移植維持生命。因此，研究腎 臟纖維化的發病機制、探索能夠緩解腎臟纖維化進程或逆轉腎臟纖維化的有效治療手段、 延緩終末期腎衰的發生是腎臟疾病研究領域亟待解決的重要臨床問題。隨著對腎臟纖維化發生的分子機制逐漸深入，發現轉化生長因子 3 1 (Transforminggrowth factor-^ 1，TGF-3 1)禾口骨形態發生蛋白(bone morphorgenic protein, BMP)及其下游的smad信號轉導通路在腎臟纖維化發生發展中起著決定性作用。 因此，通過阻斷TGF-0 1信號轉導通路和(或)增強BMP7信號來逆轉或延緩腎臟纖維化 成為當前研究的熱點，并已在大量的體外及動物實驗中得以證實。然而，目前阻斷TGF-3 1 信號轉導通路多借助于基因治療，因其需要載體介導，可控性差，轉導效率有限，安全性低 等問題以及可能加重腎臟炎癥反應而難以被臨床所接受。而激活BMP7信號轉導通路要求 BMP7使用劑量非常高，且重組BMP7價格昂貴，使得應用重組BMP7治療腎臟纖維化也難以在 臨床廣泛使用。因此，開發一種新的能有效阻斷TGF-0 1信號轉導通路，且安全性高，毒副 作用小的蛋白藥物，將為臨床防治腎臟纖維化帶來新的希望。(2)腎臟纖維化治療的研究進展目前尚未有能夠應用于臨床的腎臟纖維化有效治療手段。在臨床前研究中阻斷 TGF-0 1信號轉導通路和激活BMP7信號轉導通路卻都能有效緩解腎臟纖維化并加速轉歸。①阻斷TGF- 3 1信號轉導通路緩解腎臟纖維化使用TGF-3 1 反義核酸、TGF-3 1 特異性小干擾 RNA(small interference RNA, siRNA)、II型TGF-0受體特異性siRNA和II型TGF-0受體胞外區均可在單側輸尿管梗 阻等模型動物抑制腎臟進行性間質纖維化。使用反義核酸封閉TGF-0 1下游產物CTGF表 達也可明顯緩解腎臟纖維化。使用TGF-0 1受體ALK5抑制劑IN-1130治療大鼠單側輸尿管梗阻腎臟纖維化模 型可顯著降低TGF-0 lmRNA.I型膠原蛋白mRNA和磷酸化smad2蛋白水平、羥脯氨酸含量和 腎臟膠原蛋白總含量，并可下調a平滑肌肌動蛋白(a-smooth muscle actin, a-SMA)和 纖維連接蛋白表達，從而抑制腎臟纖維化進程。以上資料表明阻斷TGF-3 1信號轉導通路可以達到治療、緩解腎臟纖維化的目 的。
然而反義核酸和siRNA在體內穩定性較差；可溶性受體胞外區空間結構復雜，必 須采用基因治療手段給藥；ALK5抑制劑IN-1130僅能抑制smad3磷酸化，不能高效阻斷 TGF-0 1信號轉導通路。還有研究顯示TGF-0 1是個雙刃箭，它另有較強的抗炎癥和免疫調 節作用。使用TGF-0 1轉基因小鼠制備梗阻性腎病和糖尿病性腎病模型發現腎臟炎癥顯著 減輕，其機制為TGF- 0 1通過上調smad7誘導I k B a表達并進一步阻斷NF k B激活。深入 研究發現，過度表達smad7可抑制smad2/3激活，從而可以阻止TGF-0 1、血管緊張素II等 誘發膠原蛋白產生，并可在多種動物模型，包括梗阻性腎病和糖尿病性腎病顯著緩解和抑 制腎臟纖維化的發生發展。根據這些研究結果我們不難看出目前已經建立的阻斷TGF-3 1 信號轉導通路的策略在抑制腎臟纖維化的同時也對機體對抗腎臟炎癥的作用通路產生了 抑制作用，因此難于在臨床推廣應用。②BMP7在治療腎臟纖維化中的應用1997年Vukicevic等人報道使用劑量250ug/kg的BMP7可顯著減輕缺血再灌注誘 發的大鼠急性腎小管壞死并加速腎小管再生。2000年Hruska等發現使用劑量300ug/kg的 BMP7治療單側尿道完全梗阻所致梗阻性腎病大鼠模型，可明顯抑制腎小管萎縮和間質纖維 化。2003年Zeisberg等發現使用劑量300ug/kg的BMP7治療MRLlpr/lpr狼瘡性腎炎小鼠 和C0L4A3-/-奧爾波特綜合征小鼠也可顯著抑制腎小管萎縮和間質纖維化，此后又發現相 同劑量的BMP7可顯著加速急性腎小球腎炎小鼠模型腎小管間質性損傷回歸。盡管BMP7在治療急性和慢性腎臟疾病中都顯示出良好的效果，然而BMP7的活性 形式為二聚體，含有6個分子內二硫鍵和一個分子間二硫鍵，使用基因工程技術制備時蛋 白復性成本過高，不能被廣大患者接受。③SARA研究現狀SARA最初是作為Smad2結合蛋白被發現，該蛋白通過兩個FYVE鋅指作用域定位于 早期內漿膜。SARA可與I型TGF- 0受體結合并可募集Smad2或Smad3至I型TGF- ^受體 進行磷酸化。Smad2和Smad3磷酸化后則被SARA釋放，與Smad4裝配形成Smad2/Smad4復合 物和Smad3/Smad4復合物，是腎臟纖維化的基礎。進一步研究發現，位于SARA羧基末端的第 665-750aa 的 Smad 結合作用域(Smad-bindingdomain，SBD)在體外就能與 Smad2 和 Smad3 結合，并且SBD可與Smad2的MH2作用域共晶體化。SARA SBD中存在3個結構基序與Smad MH2的疏水溝結合，其選擇性與單體形式的Smad結合并可在體外阻止Smad3/Smad4形成復 合物。最近研究證實，以大腸桿菌氧化還原蛋白A為支架，根據SBD序列構建的SARA肽適 體(p印tideaptamer)真核表達載體可顯著抑制小鼠乳腺上皮細胞向間質細胞轉分化。從 已有的研究結果來看，SARA是纖維化形成過程中TGF-0信號轉導的負性調節分子。從以 上資料可以看出SARA肽適體是一個很有前景的腎臟纖維化預防和治療藥物。(3)蛋白轉導功能域(protein transduction domain, PTD)研究現狀蛋白轉導技術是指利用蛋白轉導功能域將與之共價結合的化合物、肽、核酸或與 之融合表達的全長蛋白質通過非受體依賴、非轉運蛋白依賴、非能量依賴方式運送至細胞 內的一種技術。蛋白轉導作用不是通過全長蛋白發生的，而是依賴于長約10 16個氨基 酸殘基、富含堿性氨基酸殘基、在生理PH值條件下帶凈正電荷的氨基酸序列，該序列即被 稱為蛋白轉導功能域。現已發現多種蛋白或多肽含有PTD，如HIV-1TAT、HSV-1 VP22以及果 蠅觸角足同源蛋白(Drosophila Antennapedia homeoprotein, pANTP)等。最近研究表明PTD可顯著提高藥物進入細胞的效率，并已發展成為一種高效的細胞內藥物轉運技術。盡管 在臨床前研究中阻斷TGF-0 1信號轉導通路和激活BMP7信號轉導通路都能有效緩解腎臟 纖維化并加速轉歸，使用TGF-0 1信號轉導通路阻斷劑調節TGF-0 1和BMP7信號轉導通路 之間的平衡成為治療腎臟纖維化的重要手段。但目前阻斷TGF-0 1信號轉導通路的化學藥 物或基因治療方法，因安全性問題和加重腎臟炎癥反應的可能性難以被臨床所接受。而激 活BMP7信號轉導通路要求BMP7使用劑量非常高，且價格昂貴，使得應用重組BMP7治療腎 臟纖維化難以在臨床廣泛使用。目前尚未見有直接使用重組SARA肽適體預防和治療腎臟纖維化的研究報道，所 以我們通過制備重組SARA肽適體并研究其對腎臟纖維化的治療作用，探索能夠替代BMP7 并能有效治療、緩解腎臟纖維化的蛋白藥物。該蛋白藥物僅阻斷TGF-0 1誘發的smad2/3 磷酸化，但對smad7的誘導作用沒有影響，也就是說其能在不影響機體自身抑制腎臟炎癥、 纖維化能力的同時阻斷能夠誘發腎臟纖維化的上游信號轉導通路，因此在理論上用于治療 腎臟纖維化時其臨床療效應顯著高于目前已經建立的其它策略。鑒于SARA和smad2/smad3 間的相互作用發生于細胞內，SARA肽適體發揮其生物學活性的前提條件是高效進入細胞， 我們采用蛋白轉導功能域與SARA肽適體融合表達，從而使融合蛋白PTD-SARA獲得高效進 入細胞的能力。因此，通過建立融合蛋白PTD-SARA的基礎上，并在細胞和大體動物實驗證 明了融合蛋白PTD-SARA治療腎臟纖維化的策略可行。
發明內容
本發明的目的之一在于應用TGF-3 1通路抑制蛋白SARA，將其與穿膜蛋白結構 域(PTD)融合在大腸桿菌中獲得高效表達，提供一種逆轉腎纖維化的新型融合蛋白的制備 方法以及活性檢測，使其既具有新型TGF-0 1通路抑制SARA高效低毒的優點，又能有效的 穿過細胞膜和核膜，從而降低TGF-0 1通路抑制的臨床用藥量，提高量效比，增強其在逆轉 腎臟纖維化治療中的作用。本發明的目的之二 在于抑制TGF-3 1通路而逆轉腎纖維化的新型穿膜融合蛋白 在抑制各種進展性腎臟疾病及腎功能衰竭治療中的應用。本發明的技術方案是提供個一種逆轉腎纖維化的新型融合蛋白的制備方法以及 活性檢測，其特征在于它包括1)合成含酶切位點編碼PTD-SARA的基因序列；2) PTD-SARA融合蛋白基因的克隆及構建；3)重組蛋白的誘導表達；4)重組蛋白的純化；5)重組蛋白的體外穿膜活性檢測；即重組PTD-SARA穿過HKC細胞胞膜和核膜的 能力；加入不同劑量的重組PTD-SARA，SARA和空白對照，檢測其在細胞內胞漿和胞核中的
表達量；6)重組蛋白的體外生物學活性檢測即重組PTD-SARA抑制TGF- ^ 1對人腎小管 上皮細胞HKC轉分化的影響；加入不同劑量的重組PTD-SARA，再用TGF- ^ 1刺激HKC細胞， 觀察細胞形態和表皮細胞標志物E-cadherin的表達以及間皮細胞標志物a -SMA表達量；7)重組蛋白的體內生物學活性檢測按建立單側輸尿管結扎梗阻模型，以
6PTD-SARA為受試藥物，SARA、注射用生理鹽水為對照藥物，以實驗結束時腎臟纖維化為檢 測指標，確定受試藥物的逆轉纖維化效果；以實驗前后大鼠腎臟功能為檢測指標，計算血液 BUN、SCr的含量及尿蛋白定量，確定受試藥物的逆轉腎臟功能的效果。
所述的重組蛋白的體外穿膜活性檢測分別加入5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml劑量 的重組PTD-SARA，SARA和空白對照，免疫印跡檢測細胞漿和胞核內PTD-SARA的表達量；濃 度為5ng/ml時，相對于內參PTD-SARA組、SARA組以及空白組細胞內SARA的表達分別為 0. 25，0. 17，0. 08 ；濃度為10ng/ml時，相對于內參PTD-SARA組、SARA組以及空白組細胞內 SARA的表達分別為0. 37，0. 23，0. 07 ；濃度為20ng/ml時，相對于內參PTD-SARA組、SARA組 以及空白組細胞內SARA的表達分別為0. 34，0. 25，0. 08 ；PTD-SARA組的穿膜效果顯著高于 SARA組，10ng/ml是PTD-SARA作用的最佳濃度。 所述的分別加入5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml劑量的重組PTD-SARA，再用10ng/ ml的TGF-0 1刺激HKC細胞，此時觀察表皮細胞標志物E-cadherin以及間皮細胞標志物 a -SMA ；空白對照組、SARA組和PTD-SARA組為5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml ；相對于內參表 皮細胞標志物E-cadherin的表達量分別為0. 08，0. 26，0. 45，0. 56，0. 54 ；間皮細胞標志物 a -SMA 的表達量分別為 0. 4,0. 31，0. 13，0. 08，0. 10。所述的重組蛋白的體內生物學活性檢測，按建立單側輸尿管結扎梗阻模型，以 PTD-SARA為受試藥物，SARA、注射用生理鹽水為對照藥物，以實驗結束時腎臟纖維化為檢 測指標，確定受試藥物的逆轉纖維化效果；以實驗前后大鼠腎臟功能為檢測指標，計算血液 BUN、SCr的含量及尿蛋白定量，確定受試藥物的逆轉腎臟功能的效果。所述的重組蛋白的純化，按lg菌體加7ml裂菌緩沖液的比例將菌體重懸，4°C攪 拌均勻后，用0. 2mg/ml溶菌酶裂解菌體，12000rpm，離心20min，收集上清，加固體硫酸銨至 45%飽和度，4°C靜置lh，12000rpm，離心15min，收集上清；再加固體硫酸銨至65%飽和度， 4°C靜置 lh，12000rpm，離心 15min，收集沉淀；用 60倍體積的 A液20mM PB pH6. 5，ImM EDTA 透析15小時，中間換液四次；透析后的上清用A液充分平衡的Q-S印harose Fast Flow層 析純化，洗脫B液為0. 2麗aCl，20mM PB pH6. 5，ImM EDTA,連續梯度洗脫10個柱床體積，收 集各個洗脫峰，測定活性；取活性峰對50倍體積的C液20mM Tris CITris CI pH8. 5透 析過夜，中間換液三到四次；透析后上清用C液充分平衡的SP-s印harose Fast Flow層析 純化，洗脫D液為20mM Tris -CI pH8. 5，1M NaCl，連續梯度洗脫4_5個柱床體積，收集洗脫 峰，進行活性測定和電泳檢測。所述的新型穿膜融合蛋白，將TGF-0 1通路阻滯劑SARA與新型蛋白穿膜結構域 融合在大腸桿菌中獲得高效表達，其基因的序列如下GGATCCTAT GCT CGT GCC GCA GCG CGG CAA GCT CGT GCT GGT CGG AAGTGG TGG CGG AAG TGG TGG CGG AAG TAT GAG CGC GGC CAG AGC CCG AACCCG AAC AAC CCG GCG GAA TAT TGC AGC ACC ATT CCG CCG CTG CAG CAGGCG CAG GCG AGC GGC GCG CTG AGC AGC CCG CCG CCG ACC GTG ATG GTGCCG GTG GGC GTG CTG AAA CAT CCG GGC GCG GAA GTG GCG CAG CCG CGTTAG GTCGAC。所述的將PTD-SARA融合蛋白基因的克隆至pQE30質粒，它的克隆位點是BamH I 和Sail ；將合成的片斷于93°C變性lOmin，退火，再與用BamH I和Sail處理過的pQE30連接。
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所述抑制TGF-0 1通路而逆轉腎纖維化的新型穿膜融合蛋白在抑制各種進展性 腎臟疾病及腎功能衰竭治療中的應用。本發明的特點是由于將TGF-M通路抑制蛋白SARA與穿膜蛋白結構域(PTD)融 合在大腸桿菌中獲得高效表達，利用硫酸銨鹽析和陰陽離子交換的方法對目的蛋白進行純 化，再將得到的目的蛋白進行了活性測試。制備出特異性抑制TGF-0 1通路而逆轉腎纖維 化的新型融合蛋白，其既具有新型TGF-0 1通路抑制SARA高效低毒的優點，又能有效的穿 過細胞膜和核膜，從而降低TGF-0 1通路抑制的臨床用藥量，增強其在逆轉腎臟纖維化治 療中的作用。
圖1是實施例重組蛋白PTD-SARA穿過細胞膜的結果圖；圖2是實施例重組蛋白PTD-SARA體外逆轉TGF- β1誘導的HKC細胞轉分化結果 圖。圖3是實施例重組蛋白PTD-SARA體內逆轉纖維化結果圖。
具體實施例方式以下結合實施例附圖對本發明作進一步的詳細描述。需要說明的是，下述實施例 僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。實施新的抑制TGF-0 1通路而逆轉腎纖維化的新型穿膜融合蛋白的全序列測定， PGE-PTD-SARA測序結果為GGATCC TAT GCT CGT GCC GCA GCG CGG CAA GCT CGT GCT GGT CGG AAGTGG TGG CGG AAG TGG TGG CGG AAG TAT GAG CGC GGC CAG AGC CCG AACCCG AAC AAC CCG GCG GAA TAT TGC AGC ACC ATT CCG CCG CTG CAG CAGGCG CAG GCG AGC GGC GCG CTG AGC AGC CCG CCG CCG ACC GTG ATG GTGCCG GTG GGC GTG CTG AAA CAT CCG GGC GCG GAA GTG GCG CAG CCG CGTTAG GTCGAC制備如上所述的抑制TGF-β1通路而逆轉腎纖維化的新型穿膜融合蛋白的方法 按以下步驟1)合成含有酶切位點的PTD-SARA ；2) PTD-SARA融合蛋白基因的克隆及構建；pGE30質粒由第四軍醫大學生物技術中心獲得，它的克隆位點是Bam|| I和Sal I。按照大腸桿菌慣用密碼子設計并合成了編碼PTD-SARA的核酸片斷5' -GGATCC TAT GCT CGT GCC GCA GCG CGG CAA GCT CGT GCT GGT CGGAAG TGG TGG CGG AAG TGG TGG CGG AAG TAT GAG CGC GGC CAG AGC CCGAAC CCG AAC AAC CCG GCG GAA TAT TGC AGC ACC ATT CCG CCG CTG CAGCAG GCG CAG GCG AGC GGC GCG CTG AGC AGC CCG CCG CCG ACC GTG ATGGTG CCG GTG GGC GTG CTG AAA CAT CCG GGC GCG GAA GTG GCG CAG CCCCGT TAG GTCGAC-3 ‘將合成的片斷于93°C變性lOmin，退火，再與用BamH I和Sal I處理過的pGE30連接。3)重組蛋白的誘導表達將重組好的質粒轉化感受態大腸桿菌DH5 a細胞，隨機挑選克隆，以BamH I和Sail雙酶切鑒定，篩選；正確的克隆于LB中30°C活化振搖培養12小時后，次日以1 100 比例接種LB (含Amp 100 u g/ml)培養基，37°C繼續培養至0D65(lnm = 0. 6時。3000rpm離心 15min收集菌體。經SDS-PAGE分析，發現誘導后在分子量大約10，OOODalton處有一條新生 蛋白帶，用鼠抗人SARA抗體為一抗，酶標兔抗鼠IgG為二抗，進行Western blot分析，證實 了該新生蛋白帶能夠與抗SARA抗體發生特異性結合。4)重組蛋白的純化按lg菌體加7ml裂菌緩沖液的比例將菌體重懸，4°C攪拌均勻后，用溶菌酶 (0. 2mg/ml)裂解菌體，12000rpm，離心20min，收集上清，加固體硫酸銨至45 %飽和度，4°C 靜置lh，12000rpm，離心15min，收集上清；再加固體硫酸銨至65 %飽和度，4°C靜置lh， 12000rpm,離心15min,收集沉淀；用60倍體積的A液:20mMPB pH6. 5，ImM EDTA透析15小 時，中間換液四次；透析后的上清用A液充分平衡的Q-S印harose Fast Flow層析純化，洗 脫B液為0. 2MNaCl,20mM PB pH6. 5，ImMEDTA,連續梯度洗脫10個柱床體積，收集各個洗脫 峰，測定活性。取活性峰對50倍體積的C液20mM Tris CI pH8. 5透析過夜，中間換液三到 四次；透析后上清用C液充分平衡的SP-s印harose Fast Flow層析純化，洗脫D液為20mM Tris -ClpHS. 5，1M NaCl，連續梯度洗脫4_5個柱床體積，收集洗脫峰，進行活性測定和電泳 檢測。SDS-PAGE凝膠電泳檢測并經凝膠成像系統分析，純度大于95%。4)重組蛋白的體外穿膜活性將處于對數生長期的HKC細胞以4000個細胞/孔接種于96孔培養板，貼壁生 長24小時后，棄去原培養液，加入用DMEM培養液配制好的含不同濃度本發明化合物的溶 液200 uL(PTD-SARA濃度分別為5ng/ml，10ng/ml和20ng/ml)，每個濃度設3個復孔，并設 SARA，和生理鹽水對照。24小時后觀察細胞內和細胞核內SARA的表達量。重組PTD-SARA穿膜活性結果顯示分別加入5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml劑量的重 組PTD-SARA，SARA和空白對照，免疫印跡檢測細胞漿和胞核內PTD-SARA的表達量。濃度為 5ng/ml時，PTD-SARA組、SARA組以及空白組細胞內SARA的表達分別為0. 25，0. 17，0. 08 (相 對于內參)。濃度為10ng/ml時，PTD-SARA組、SARA組以及空白組細胞內SARA的表達分別 為0. 37，0. 23，0. 07(相對于內參)。濃度為20ng/ml時，PTD-SARA組、SARA組以及空白組 細胞內SARA的表達分別為0. 34，0. 25，0. 08 (相對于內參)。10ng/ml是PTD-SARA作用的 最佳濃度。(如圖1所示的PTD-SARA穿膜活性的檢測)5)重組蛋白的體外抗纖維化作用重組PTD-SARA逆轉TGF-0 1誘導的腎小管上皮細胞向間質細胞轉分化將處于對 數生長期的HKC細胞以4000個細胞/孔接種于96孔培養板，貼壁生長24小時后，棄去原 培養液，加入用DMEM培養液配制好的含不同濃度本發明化合物的溶液200 y L，每個濃度設 3個復孔，并設SARA，生理鹽水對照。使用lOng/ml的TGF-0 1誘導其向間質細胞轉分化， 不同時間點觀察PTD-SARA、SARA和生理鹽水對上皮細胞向間質細胞轉分化的抑制作用。觀 測指標包括使用Western blot測定E-cadherin和a -SMA,使用HE染色觀察細胞形態學 改變。重組PTD-SARA抑制TGF- ^ 1對人腎小管上皮細胞(HKC)轉分化的結果顯示空白 對照組、SARA 組和 PTD-SARA 組(5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml)表皮細胞標志物 E-cadherin 的 表達量分別為:0.08，0. 26，0.45，0.56，0.54(相對于內參)；間皮細胞標志物a-SMA的表達量分別為0. 4，0. 31，0. 13,0. 08,0. 10。PTD-SARA和SARA7均能在體外逆轉TGF-3 1誘導 的轉分化，PTD-SARA顯著優于SARA的逆轉效果，10ng/ml是PTD-SARA作用的最佳濃度(如 圖2所示的PTD-SARA體外抗轉分化作用(*p < 0. 05 ；< 0. 01))6)重組蛋白PTD-SARA的體內抗纖維化作用圖3是實施例重組蛋白PTD-SARA體內逆轉纖維化結果圖(即PTD-SARA治療對腎 臟纖維化和腎臟功能的影響(*p < 0. 05 ；**p < 0. 01)圖)重組PTD-SARA對單側輸尿管梗阻所致腎臟纖維化模型的治療作用制備小鼠UUO 模型，按300mg/kg體重尾靜脈注射PTD-SARA，觀察PTD-SARA對UUO模型腎臟纖維化的治 療作用。設立假手術組、單純UUO模型組和SARA組作為對照。組織形態學指標觀察計算 機圖象半定量分析腎臟間質膠原面積計算膠原面積比(％)、腎小管間質損傷計算腎小管 間質損傷指數，免疫組化染色定量腎組織FN、I-IV膠原蛋白、層粘連蛋白LN、TGF-0 1蛋白 等。腎臟功能學指標測定各時間點血液BUN、SCr的含量及尿蛋白定量。試驗結果如表1 所示表1PTD-SARA治療對腎臟纖維化和腎臟功能的影響 本發明抑制TGF-0 1通路而逆轉腎纖維化的新型穿膜融合蛋白可作為在抑制各 種進展性腎臟疾病及腎功能衰竭研究和治療中的應用。
權利要求
逆轉腎纖維化的新型融合蛋白的制備方法以及活性檢測，其特征在于它包括1)合成含酶切位點編碼PTD-SARA的基因序列；2)PTD-SARA融合蛋白基因的克隆及構建；3)重組蛋白的誘導表達；4)重組蛋白的純化；5)重組蛋白的體外穿膜活性檢測；即重組PTD-SARA穿過HKC細胞胞膜和核膜的能力；加入不同劑量的重組PTD-SARA，SARA和空白對照，檢測其在細胞內胞漿和胞核中的表達量；6)重組蛋白的體外生物學活性檢測即重組PTD-SARA抑制TGF-β1對人腎小管上皮細胞HKC轉分化的影響；加入不同劑量的重組PTD-SARA，再用TGF-β1刺激HKC細胞，觀察細胞形態和表皮細胞標志物E-cadherin的表達以及間皮細胞標志物α-SMA表達量；7)重組蛋白的體內生物學活性檢測按建立單側輸尿管結扎梗阻模型，以PTD-SARA為受試藥物，SARA、注射用生理鹽水為對照藥物，以實驗結束時腎臟纖維化為檢測指標，確定受試藥物的逆轉纖維化效果；以實驗前后大鼠腎臟功能為檢測指標，計算血液BUN、SCr的含量及尿蛋白定量，確定受試藥物的逆轉腎臟功能的效果。
2.根據權利要求1所述的逆轉腎纖維化的新型融合蛋白的制備方法以及活性檢測，其 特征在于所述的重組蛋白的體外穿膜活性檢測；分別加入5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml劑量 的重組PTD-SARA，SARA和空白對照，免疫印跡檢測細胞漿和胞核內PTD-SARA的表達量；濃 度為5ng/ml時，相對于內參PTD-SARA組、SARA組以及空白組細胞內SARA的表達分別為 0. 25,0. 17,0. 08 ；濃度為10ng/ml時，相對于內參PTD-SARA組、SARA組以及空白組細胞內 SARA的表達分別為0. 37，0. 23，0. 07 ；濃度為20ng/ml時，相對于內參PTD-SARA組、SARA組 以及空白組細胞內SARA的表達分別為0. 34，0. 25，0. 08 ；PTD-SARA組的穿膜效果顯著高于 SARA組，10ng/ml是PTD-SARA作用的最佳濃度。
3.根據權利要求1所述的逆轉腎纖維化的新型融合蛋白的制備方法以及活性檢測， 其特征在于所述的分別加入5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml劑量的重組PTD-SARA，再用10ng/ ml的TGF-0 1刺激HKC細胞，此時觀察表皮細胞標志物E-cadherin以及間皮細胞標志物 a -SMA ；空白對照組、SARA組和PTD-SARA組為5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml ；相對于內參表 皮細胞標志物E-cadherin的表達量分別為0. 08，0. 26，0. 45，0. 56，0. 54 ；間皮細胞標志物 a -SMA 的表達量分別為 0. 4,0. 31，0. 13，0. 08，0. 10。
4.根據權利要求1所述的逆轉腎纖維化的新型融合蛋白的制備方法以及活性檢測， 其特征在于所述的重組蛋白的體內生物學活性檢測，按建立單側輸尿管結扎梗阻模型，以 PTD-SARA為受試藥物，SARA、注射用生理鹽水為對照藥物，以實驗結束時腎臟纖維化為檢 測指標，確定受試藥物的逆轉纖維化效果；以實驗前后大鼠腎臟功能為檢測指標，計算血液 BUN、SCr的含量及尿蛋白定量，確定受試藥物的逆轉腎臟功能的效果。
5.根據權利要求1所述的逆轉腎纖維化的新型融合蛋白的制備方法以及活性檢測，其 特征在于所述的重組蛋白的純化，按lg菌體加7ml裂菌緩沖液的比例將菌體重懸，4°C攪 拌均勻后，用0. 2mg/ml溶菌酶裂解菌體，12000rpm，離心20min，收集上清，加固體硫酸銨至 45%飽和度，4°C靜置lh，12000rpm，離心15min，收集上清；再加固體硫酸銨至65%飽和度， 4°C靜置 lh，12000rpm，離心 15min，收集沉淀；用 60倍體積的 A液20mM PB pH6. 5,lmM EDTA2透析15小時，中間換液四次；透析后的上清用A液充分平衡的Q-S印harose Fast Flow層 析純化，洗脫B液為0. 2麗aCl，20mM PB pH6. 5，ImM EDTA，連續梯度洗脫10個柱床體積，收 集各個洗脫峰，測定活性；取活性峰對50倍體積的C液20mM Tris CITris CI pH8. 5透 析過夜，中間換液三到四次；透析后上清用C液充分平衡的SP-s印harose Fast Flow層析 純化，洗脫D液為20mM Tris CI pH8. 5，1M NaCl，連續梯度洗脫4_5個柱床體積，收集洗 脫峰，進行活性測定和電泳檢測。
6.根據權利要求1所述的逆轉腎纖維化的新型融合蛋白的制備方法以及活性檢測，其 特征在于所述的新型穿膜融合蛋白，將TGF-0 1通路阻滯劑SARA與新型蛋白穿膜結構域 融合在大腸桿菌中獲得高效表達，其基因的序列如下GGATCC TAT GCT CGT GCC GCA GCG CGG CAA GCT CGT GCT GGT CGG AAGTGG TGG CGG AAG TGG TGG CGG AAG TAT GAG CGC GGC CAG AGC CCG AACCCG AAC AAC CCG GCG GAA TAT TGC AGC ACC ATT CCG CCG CTG CAG CAGGCG CAG GCG AGC GGC GCG CTG AGC AGC CCG CCG CCG ACC GTG ATG GTGCCG GTG GGC GTG CTG AAA CAT CCG GGC GCG GAA GTG GCG CAG CCG CGTTAG GTCGAC。
7.根據權利要求1所述的逆轉腎纖維化的新型融合蛋白的制備方法以及活性檢測，其 特征在于所述的將PTD-SARA融合蛋白基因的克隆至PQE30質粒，它的克隆位點是BamH I 和Sail ；將合成的片斷于93°C變性lOmin，退火，再與用BamH I和Sail處理過的pQE30連接。
8.根據權利要求1所述的逆轉腎纖維化的新型融合蛋白的制備方法以及活性檢測，其 特征在于所述抑制TGF-0 1通路而逆轉腎纖維化的新型穿膜融合蛋白在抑制各種進展性 腎臟疾病及腎功能衰竭治療中的應用。
全文摘要
本發明屬于醫藥生物技術領域，具體涉及基因克隆、外源基因在原核細胞中的表達、目的蛋白質的純化、抑制TGF-β1通路而逆轉腎纖維化的新型穿膜融合蛋白，其特征在于應用TGF-β1通路抑制蛋白SARA，將其與穿膜蛋白結構域(PTD)融合在大腸桿菌中獲得高效表達，利用硫酸銨鹽析和陰陽離子交換的方法對目的蛋白進行純化，將得到的目的蛋白進行了活性測試。其既具有新型TGF-β1通路抑制劑SARA高效低毒的優點，又能有效的穿過細胞膜和核膜，從而降低TGF-β1通路抑制劑的臨床用藥量，增強其在逆轉腎臟纖維化治療中的作用，可望獲得臨床治療腎臟纖維化的新型多肽藥。
文檔編號C12Q1/02GK101851635SQ201010129278
公開日2010年10月6日 申請日期2010年2月19日 優先權日2010年2月19日
發明者劉曉渭, 加慧衛, 孫世仁, 宋揚, 張鵬, 朱軍, 李曼, 杜銳, 王漢民, 許國雙, 陳威, 黃晨 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學