專利名稱：高血壓易感基因的rs2336384位點的檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和醫學領域。更具體地，涉及人線粒體融合基因2 (Mfn2 gene)的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點 rs2338384 及其 與原發性高血壓相關性的檢測。本發明還涉及檢測這個SNP位點的方法和試劑盒。
背景技術：
原發性高血壓(essential hypertension, EH)是一種多因素、多基因疾病，由環 境與遺傳因素共同致病的常見而多發的心血管病癥，對人類健康造成了極大的影響。隨著 分子醫學的發展，目前已經發現的高血壓相關基因已經有150余種，但是EH的發病機制仍 然不完全清楚，高血壓的早期診斷和預防問題仍然未能完全解決。EH是遺傳因子和環境共 同作用的結果，血壓的變化30%-60%歸因于遺傳。由于環境因素是可以控制和確認的，而 對高血壓遺傳學因素卻是固定不變的。因此，對可變因素的控制，如對高血壓危險因素的 預防，可以在一定程度上延緩和防止高血壓的發病，但是對固定不變的遺傳因素的認識不 足卻在一定程度上嚴重影響著對高血壓發病、診斷和治療。因此對高血壓遺傳學的研究十 分必要(王佐廣，溫紹君，吳兆蘇.高血壓、易感基因與單核苷酸多態性[J].高血壓雜志， 2001,9 259-264)。近二十余年來，有關高血壓治療的研究更多地集中在對血壓的控制和對靶器官的 保護，并已取得突飛猛進的發展。但是，這些手段并不能從根本上控制血壓，目前對人類內 源性抗高血壓基因的研究還很少，因此，研究內源性抗高血壓機制是今后高血壓防治研究 的主要方向之一，具有重要的研究價值和應用前景，如果通過調節內源性抗高血壓機制治 療高血壓病，將會促進我國生物醫療技術的發展，并為我國每年節省巨大的醫療費用。目前所發現的高血壓相關基因，歸結起來可以概括為促高血壓基因和抗高血壓 基因，Mfn2屬于后者。Mfn2的前身是我國學者陳光慧等[Chen GH, Zhang CH, Zhu YQ, et al.Expression of a novel gene related to hypertension[J]. NatlMed J China,1997, 77 =823-828.]于1997年對培養的自發性高血壓大鼠(SHR)和正常Wistar Kyoto (WKY)大 鼠的血管平滑肌細胞進行差異顯示，克隆出一個新基因——增殖抑制基因(hyperplasia suppressor gene, HSG)。它包含有4160bp的堿基對，共編碼661個氨基酸(NM_014874， GeneBank Access U41803)。后經一系列體內、體外實驗發現[Chen KH,Guo ΧΜ,Dalong Ma, et al. Dysregulationof HSG triggers vascular proliferative disorders[J]. Nature Cell Biol，2004，6，872-883. ]，HSG可以明顯地抑制Ras-Raf蛋白_絲裂素活化蛋白激酶 基因表達，并且可以激活抗癌基因的表達，有效地阻遏細胞周期和抑制多種細胞的增殖，且 這種抑制作用是通過細胞凋亡的方式實現的。因此HSG基因是原發性高血壓的候選基因 之一，后經基因功能研究表明，HSG基因參與線粒體融合，因此正式命名為線粒體融合基因 2 (mitofusin 2，Mfn2)但是目前對Mfn2與EH的研究較少，沒有證實rs2336384與EH相關 性的報道。
綜上所述，為了最終實現治療高血壓，本領域迫切需要尋求原發性高血壓易感基 因，并開發檢測原發性高血壓易感基因的方法、試劑盒，以及相關的治療藥物。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測(包括早期診斷)高血壓易感基因的方法及檢測試劑盒。本發明提供了一種高血壓易感性基因的檢測方法，即檢測Mfn2基因rs2338384位 點的基因型，rs2338384帶有G基因型的個體高血壓的發病風險顯著高于普通人群。所述的rs2336384，位于Mfn2的內含子2中(片段重疊群contig :NT_021937. 18 位置6583430T/G)其中，脫氧核糖核酸(DNA)序列編號rs2336384位置基于SEQ ID NO: 1/6 ；引物 1 基于 SEQID NO 2/6 ；引物 2 基于 SEQID NO 3/6 ；探針 1 基于 SEQID NO 4/6 ；探 針2基于SEQ ID NO 5/6 ；擴增產物基于SEQ ID NO :6/6。具體而言，該方法包括步驟(a)抽提樣品的基因組DNA，擴增獲得Mfn2基因內含 子2 ； (b)檢測步驟(a)產物中單核苷酸多態性位點rs2338384的基因型。所述的擴增Mfn2基因內含子2的引物序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。所述的檢測rs2338384的基因型的探針序列如SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示。上述方法中涉及的測序、擴增、抽提基因組DNA等技術均可采用本領域的常規操 作方法。本發明提供了一種檢測高血壓易感基因的試劑盒，它含有與位點rs2338384結合 的探針。在本發明的一個實施例中，與位點rs2338384結合的探針的序列如SEQ IDN0 :4和 SEQ ID NO 5 所示。上述試劑盒還可以包括特異性擴增Mfn2基因內含子2中包含rs2338384位點的 區域的引物。在本發明的一個實施例中，與特異性擴增Mfn2基因內含子2中包含rs2338384位 點的區域的引物的序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示。本發明經研究顯示，首次證明了 Mfn2基因單核苷酸多態性位點rs2336384(位于 Mfn2內含子2中，片段重疊群contig :NT_021937. 18位置6583430T/G)與高血壓密切相關， 而且發現了它的新功能Mfn2基因單核苷酸多態性位點rs2336384位于Mfn2，內含子2中 (片段重疊群contig :NT_021937. 18位置6583430T/G)基因型的改變將導致高血壓的發病 風險升高，其中關聯研究結果顯示，在Mfn2基因rs2336384T — G在病例和對照組中的分布 存在顯著性差異(P< 0.05)，該SNP多態性可改變轉錄因子結合位點。在此基礎上完成了 本發明。本發明提供了一種對個體的高血壓易感性進行診斷的方法，它包括步驟檢測該 個體的Mfn2基因rs2336384位點的基因型，以此判斷該個體患高血壓的發病風險是否高于 普通人群。在一優選例中，所述的差異是選自rs2336384的單核苷酸多態性。rs2336384位于 Mfn2，內含子2中(片段重疊群contig :NT_021937. 18位置6583430T/G)。其中，脫氧核糖 核酸(DNA)序列編號:rs2336384位置基于SEQID NO :1/6。
本發明提供了一種檢測樣品是否存在Mfn2基因的單核苷酸多態性的方法，包括 步驟(a)用Mfn2基因內含子2特異性引物擴增樣品的基因組DNA，得到擴增產物；和(b)檢測擴增產物中單核苷酸多態性位點rs2336384的基因型。Mfn2基因的詳細序列可參見登錄號為rs2336384的核苷酸序列(可參見網址 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)。本發明人對Mfn2基因中的內含子2中(片段重疊群contig :NT_021937. 18位置 6583430)區域進行了測序。Mfn2基因rs2336384位點的多態性可直接用于高血壓的個性化治療。在使用本發 明Mfn2基因rs2336384位點的多態性時，還可同時使用其他治療高血壓的藥劑。本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效的本發明Mfn2蛋白以及藥學 上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、 乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被制成針劑形 式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。諸如片劑 和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠 囊在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天0. 1微克/千克體重-約 10毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。使用藥物組合物時，是將安全有效量的Mfn2蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于普哺 乳動物，其中該安全有效劑量通常至少約0. 1微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過 約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0. 1微克/千克體重_約100毫克/千克體重。當 然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內。檢測Mfn2基因的rs2336384的基因型也可用于診斷高血壓。檢測可以針對基因 組DNA，也可針對Mfn2基因的擴增片段。Mfn2基因的rs2336384的基因型可用已有的技術 如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。本發明提供了一種檢測原發性高血壓易感性基因的方法，它包括檢測線粒體融合 基因2(Mfn2)的rs2338384位點的基因型，rs2338384帶有G基因型的個體，高血壓的易感 性顯著高于普通人群。本發明還公開了相應的檢測試劑盒，該試劑盒含有擴增rs2338384 位點的引物，還可以包括擴增Mfn2基因第2號內含子區域的引物。利用本發明檢測 rs2338384位點的基因型，方法簡單易行，快速高效，成本低廉，為高血壓的診斷和治療提供 了一個簡捷的新途徑。
圖1是MFn2基因rs2338384位點基因型的檢測結果。圖2是測序結果截圖。顯示了 rs2338384的一種SNP基因型的測序結果。 rs2338384 位于 Mfn2，內含子 2 中(片段重疊群 contig :NT_021937. 18 位置 6583430T/G)。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆；實驗室手冊(New York :ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1熒光PCR檢測一、實驗材料7900HT熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，聚合酶鏈反應液(TaqManEXPress Master Mix)由美國應用生物系統公司(ABI)定制合成。二、引物及探針設計與合成以MFn2基因內含子1的部分序列為模板，使用Primer ExpressTM 2. 0軟件分析 TaqMan引物和探針位點，并由美國應用生物系統公司(ABI)定制合成。檢測用引物MFn2基因rs2336384上游引物序列5' -CTCAGAGCTGTACTGTCTTTAAG-3‘ (SEQ ID NO 2)MFn2 基因 rs2336384 下游引物序列5' -AGACAAGGGAAGGAAGTGAC-3 ‘ (SEQID N0 3)熒光探針MFn2 基因 rs2336384 熒光探針 1 :5 ‘ -VIC-GCTGTGGCGTCATGCT-TAMRA-3 ‘ (SEQ ID NO 4)MFn2 基因 rs2336384 熒光探針 2 5 ‘ -FAM-GCTGTGGCTTCATGCT-TAMRA-3 ‘ (SEQ ID NO 5)三、樣本檢測實驗共檢測918例高血壓病例和489例正常對照人群，每例收集血樣標本約2ml， 用酚/氯仿抽屜基因組DNA，抽提結果用微量紫外/可見光分光光度計(INFINIGEN公司) 檢測。按如下體系進行熒光PCR擴增，最后用SDS 2. 3掃描并聚類分析。
四、型檢測結果基因組DNA抽提的檢測結果所有樣本的基因組DNA符合檢測要求(260/280 > 1. 8，濃度> lOng/ul，如下圖所 示樣本660號的檢測結果)。MFn2基因rs2336384位點基因型的檢測結果
實施例2用測序法檢測原發性高血壓易感基因MFn2基因的rs2336384位點。挑選上述高 血壓病例_對照組樣本各10例進行測序判斷rs2336384的基因型。一、實驗方法PCR測序引物仍采用上述熒光PCR用引物，擴增的產物經純化后直接測序。測序的 儀器是ABI公司的3130x1遺傳分析儀，用sequence analysis 5. 2分析軟件進行分析，結 果用chromas也可以查看。二、實驗結果測序結果截圖如圖2所示。可見，20例的測序結果與7900熒光PCR的基因型分析結果完全一致。
三、MFn2基因rs2336384基因型和高血壓易感的關聯分析MFn2基因rs2336384在高血壓病人和對照中分布的比較采用RxC x 2檢驗.用 SPSS軟件進行統計分析，檢測結果及SPSS軟件分析結果如圖所示 在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用做參考，就如同每一篇文獻被單獨引 用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講述內容之后，本領域技術人員可以 對本發明做各種改動或修改，這些形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
一種高血壓易感基因的rs2336384位點的檢測方法，其特征在于，檢測Mfn2基因rs2338384位點的基因型，所述的rs2338384帶有G基因型的個體高血壓的發病風險顯著高于普通人群。
2.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，rs2338384位點位于Mfn2基因內含子 2內。
3.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，該方法包括步驟(a)抽提樣品的基因組DNA，擴增獲得Mfn2基因內含子2中包含rs2338384位點的區域；(b)檢測步驟(a)產物中單核苷酸多態性位點rs2338384的基因型。
4.如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，擴增Mfn2基因內含子2中包含 rs2338384位點的區域的引物序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。
5.如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，檢測rs2338384的基因型的探針序列如 SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 所示。
6.一種檢測高血壓易感基因的試劑盒，其特征在于，它含有與位點rs2338384結合的 探針。
7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，與位點rs2338384結合的探針的序列如 SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 所示。
8.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，它還包括特異性擴增Mfn2基因內含子2 中包含rs2338384位點的區域的引物。
9.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，特異性擴增Mfn2基因內含子2中包含 rs2338384位點的區域的引物的序列如SEQ ID NO 2禾口 SEQ ID N0:3所示。
全文摘要
本發明屬于分子生物學和醫學領域，涉及一種檢測高血壓易感性基因的方法及其檢測試劑盒。本發明提供了一種檢測原發性高血壓易感性基因的方法，它包括檢測線粒體融合基因2(Mfn2)/增殖抑制基因(HSG)rs2336384位點的基因型，rs2336384帶有G基因型的個體，高血壓的易感性顯著高于普通人群。本發明還公開了相應的檢測試劑盒，該試劑盒含有擴增rs2338384位點的引物，還可以包括擴增Mfn2基因第2號內含子內包含rs2338384位點的區域的引物。利用本發明檢測rs2336384位點的基因型，方法簡單易行，快速高效，成本低廉，為高血壓的診斷和治療提供了一個簡捷的新途徑。
文檔編號C12Q1/68GK101892302SQ20101012903
公開日2010年11月24日 申請日期2010年3月18日 優先權日2010年3月18日
發明者劉潔琳, 劉闊, 劉雅, 吳海, 李志忠, 李瑤, 柳景華, 樓煜清, 溫紹君, 王佐廣, 羅毅, 謝毅 申請人:首都醫科大學附屬北京安貞醫院;復旦大學