專利名稱：一種誘導臍帶間充質干細胞分化為類神經細胞的方法
技術領域：
本發明屬于細胞生物學領域，涉及一種穩定誘導人臍帶間充質干細胞的方法。
背景技術：
神經系統創傷的修復在臨床上仍然是一大亟待解決的難題。作為神經缺損修復黃金標準的自體神經移植存在著來源有限，供區遺留感覺障礙等缺點。干細胞具有來源豐富，分離培養容易，體外增殖能力強，具有多向分化潛力的特點，近年來已成為組織工程產品種子細胞研究的熱點。研究發現，胚胎干細胞(ESCs)，神經干細胞(NSCs)、骨髓基質干細胞(BMSCs)、臍血干細胞等均具有向神經細胞分化的潛能，在移植于動物模型后能改善其神經功能，可作為治療神經系統疾病的種子細胞。然而，ESCs 尚存在定向分化和純化的技術障礙，且面臨眾多倫理、法律方面的問題，移植后有形成畸胎瘤的可能，應用受到一定限制。NSCs也受到取材困難、不易獲得及倫理、法律方面問題的影響。雖然自體BMSCs在體內或體外均可誘導成為類許旺細胞，自體移植既可解決許旺細胞來源問題，促進神經再生，又符合醫學倫理學的規范，但BMSCs細胞采集過程對供者造成痛苦，分離細胞量有限，且隨著年齡增長其干細胞數量和增殖能力也顯著下降，較難滿足臨床需要。臍血MSC含量稀少，分離困難，不適合規模化操作，其采集也面臨著倫理學的限制。近來研究表明，人臍帶富含間充質干細胞(HUCMSCs)，是一個可能優于骨髓和其它組織的種子細胞源泉，能夠克服以上所有的缺陷，具備以下優點(1)來源充足，取材方便， 作為一種分娩廢棄物，其采集不存在任何倫理問題；(2)每根臍帶的長度在40 60cm，細胞數量豐富，增殖能力強；C3)分離出的MSC免疫表型不成熟，具有較弱的免疫細胞抗原性。HUCMSCs具有與BMSCs相似的干細胞特性，具有良好的自我更新和多向分化增殖能力， 因此可在較短的時間內可獲得更多的細胞數量，以滿足臨床需求。研究表明HUCMSCs在體外可被誘導為神經元樣或神經膠質樣細胞，移植治療大鼠脊髓損傷或帕金森病，可在體內微環境內向神經元和星形膠質細胞分化，為中樞神經系統疾病的治療提供了新的種子細胞來源。將干細胞誘導為類神經細胞的傳統方法是化學誘導法，即干細胞在各種誘導劑作用下，可表現出神經細胞形態及特異性標志物。但誘導劑可能影響細胞分裂和存活，引起細胞收縮并提高細胞對抗體的免疫活性，是否能用于臨床還需要進一步的實驗證實。近來發現，將體細胞與干細胞共培養，通過體細胞分泌的營養因子等因素，可誘導干細胞定向分化，是一項較簡便經濟的方法。將大鼠許旺細胞與大鼠BMSCs或人胚胎神經嵴細胞共培養， 發現上述兩種干細胞均可表達NeStin，GFAP等神經細胞表面標志。這些實驗為將HUCMSCs 向許旺細胞定向分化提供了新方法。至今為止，尚未有將HUCMSCs通過化學或共培養的方法誘導為類神經細胞，并應用于神經損傷修復研究的報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種誘導臍帶間充質干細胞分化為類神經細胞的方法。
本發明提供了一種誘導臍帶間充質干細胞分化為類神經細胞的方法，該方法包括(1)將臍帶間充質干細胞與許旺細胞用0. 4μ m孔徑的Transwell小室隔離共培養，所用培養液為許旺細胞培養液；(2)每三天全量或者半量換一次液，培養兩周即可得到類神經細胞。所用的干細胞通常為臍帶間充質干細胞，兩周時間可以是10-15天。所述的隔離共培養是小室內放置許旺細胞，下層培養板放置臍帶間充質干細胞。所述的隔離共培養也可以是小室內放置臍帶間充質干細胞，下層培養板放置許旺細胞。所用的培養液中含有福司柯林和神經生長因子。其中，福司柯林的濃度通常是 2-14 μ m,神經生長因子的濃度通常是10-200ng。所用的臍帶間充質干細胞可以取臍帶，通過下述方法獲得將臍帶從手術臺上取下，無菌下浸入DMEM/10% FBS培養基中；PBS充分洗去血液，去除臍靜脈及動脈，將臍帶剪碎至Imm3大小組織塊，移至0. 復合膠原酶NB4和0. 1 %透明質酸酶混合液中，37°C持續振蕩消化池，然后加入3倍勻漿量的PBS稀釋，繼續振蕩30分鐘后，細胞濾器過濾，離心、重懸、計數。細胞接種于培養皿中，置于37°C，5% CO2孵育箱培養。培養4 后更換培養基， 去掉未貼壁細胞。以后每2天換液1次，至細胞融合傳代。所用的小鼠許旺氏細胞可通過下述方法獲得取出生2周齡GFP C57BL6小鼠，脫臼處死后，放入75%酒精浸泡10分鐘，在無菌條件下，取小鼠雙側坐骨神經。置于盛有2% 復合膠原酶NB4的15ml離心管中消化，2小時后，離心去上清，加入許旺細胞培養液重懸細胞，計數種植。待培養4 細胞融合后，吸棄培養液，加入0. 復合膠原酶NB4，消化30分鐘后，輕輕振蕩，收集細胞，離心，棄上清，用培養液重懸細胞，計數種植，4 后再重復上述操作一次。細胞表面分子標志檢測如下取臍帶間充質細胞，去掉培養液，用PBS洗1遍，再用0. 25%胰蛋白酶-EDTA消化，收集細胞，PBS洗滌后制成濃度為lxl06/200ul的單細胞懸液。分別加入鼠抗人 CD90-PE、CD105-PE、CD73-APC、CD34-FITC、CD14-FITC、CD19-FITC、 HLA-DR-PE, CD44-FITC 抗體，對照組為 IgG1Ii-FITC, IgG2bK_PE、IgG1Ii-APC15 單抗各 5ul，最后4°C孵育30min，流式細胞儀檢測。具體而言，本發明的高效誘導臍帶間充質干細胞分化為類神經細胞的方法，操作步驟如下一種誘導臍帶間充質干細胞分化為類神經細胞的方法，其特征是由下述步驟構成(1)將臍帶間充質干細胞與許旺細胞用0. 4μ m孔徑的Transwell小室隔離共培養。其中，包括小室內放置許旺細胞，下層培養板放置臍帶間充質干細胞，或小室內放置臍帶間充質干細胞，下層培養板放置許旺細胞。其所用培養液為許旺細胞培養液(含 2-14 μ mforskolin,10_200ng heregulin-β _1).(2)每三天全量或者半量換一次液，共培養至兩周即可得到類神經細胞。本發明應用隔離共培養的方法，復合膠原酶和透明質酸酶混合后消化臍帶可以大量分離臍帶間充質細胞，經傳代至第3代就可以獲得高純度的間充質干細胞。使臍帶間充質干細胞誘導分化為了神經細胞，細胞分化率達到70%以上。經過共培養兩周后，其細胞表達NF-200，nestin，β-Ill-tubulin等神經細胞特異性標記率達到70 80%。如圖2和圖3所示。
圖1是培養得到的細胞鏡下圖。圖2是培養一周后的細胞鏡下圖。其中，A4:共培養Iw后，部分細胞表現出神經元的形態，且B-III-bubulin陽性。B4 共培養一周后，形態似神經元，GFP陽性的一個細胞。 C4:共培養兩周后，細胞形態非常接近神經元，伸出細長的突起，且NF-200標記陽性。圖3是不同時間點神經元特異性標志的表達情況。1 5時間點分別為8h，Mh， 72h，lw,2w.可以看出，隨著共培養時間的推移，Nestin神經前體細胞標記表達率在24h時升高，隨后逐漸降低，符合細胞不斷成熟過程。而其它成熟神經元特異性標記率呈逐漸增高的趨勢。
具體實施例方式實驗步驟一、材料和方法臍帶取自上海市第一人民醫院婦產科足月剖宮產嬰兒，均經父母授權同意。二、主要試劑和因子2周齡C57BL/6小鼠10只(上海中科院試驗動物養殖中心)、DMEM培養基 (Gibco, USA)、復合膠原酶 NB4(Serva，Germany)、胎牛血清(FBS =Hyclone, Australia)、 磷酸鹽緩沖液(PBS，PH7. 2)、許旺細胞培養液(SCCM，khwann cells culture medium含 IOngheregulin-β -U2uM forsklinUO % FBSU00u/ml 青霉素、lOOu/ml 鏈霉素和高糖 DMEM)。兔抗人 NF-200、Β-tubulinIII、GFAP, Nestin (Milipore, USA)流式抗體購自(BD， USA)。三、分離臍帶間充質細胞將臍帶從手術臺上取下，無菌下浸入DMEM/10% FBS培養基中，4°C保存；超凈臺內取出臍帶，PBS充分洗去血液，去除臍靜脈及動脈，將臍帶剪碎至Imm3大小組織塊，移至 0. 復合膠原酶NB4和0. 透明質酸酶混合液中，37°C持續振蕩消化池，然后加入3倍勻漿量的PBS稀釋，繼續振蕩30分鐘后，細胞濾器過濾，離心、重懸、計數。細胞接種于培養皿中，置于37°C，5%C02孵育箱培養。培養4 后更換培養基，去掉未貼壁細胞。以后每2 天換液1次，至細胞融合傳代。四、分離、純化小鼠許旺氏細胞取出生2周齡GFP C57BL6小鼠，脫白處死后，放入75%酒精浸泡10分鐘，在無菌條件下，取小鼠雙側坐骨神經。置于盛有2%復合膠原酶NB4的15ml離心管中消化，2小時后，離心去上清，加入許旺細胞培養液重懸細胞，計數種植。待培養4 細胞融合后，吸棄培養液，加入0. 1 %復合膠原酶NB4，消化30分鐘后，輕輕振蕩，收集細胞，離心，棄上清，用培養液重懸細胞，計數種植，4 后再重復上述操作一次。
五、細胞表面分子標志檢測取第3代臍帶間充質細胞，去掉培養液，用PBS洗1遍，再用0. 25%胰蛋白酶-EDTA 消化，收集細胞，PBS洗滌后制成濃度為lX106/200ul的單細胞懸液。分別加入鼠抗人 CD90-PE、CD105-PE、CD73-APC、CD34-FITC、CD14-FITC、CD19-FITC、HLA-DR-PE, CD44-FITC 抗體，對照組為IgGA-FITC、IgG2bK-PE、IgG^-APC0單抗各5ul，最后4°C孵育30min，流式細胞儀檢測。六、向許旺細胞誘導分化1.接觸共培養法按照許旺細胞和臍帶間充質細胞1 1(5χ103 5xl03)比例種植在6孔板中，置入37°C CO2培養箱中，每隔一天半量換液。在8h、Mh、72h、lw,2w進行觀察拍照，4 %多聚甲酸固定 30min，行免疫熒光鑒定，檢測 Nestin、GFAP、NF-200、B_tubulinIII、MAB1580 表達情況。對照組為單純培養的臍帶間充質細胞。2.非接觸共培養法在Transwell小室中種植臍帶間充質細胞，下層6孔板中種植經純化的許旺細胞，在8h，24h, 72h，lw，2w不同的時間用免疫熒光進行檢測Nestin、GFAP, NF-200、 B-tubulinIII、MAB1580。對照組為單純種植在Transwell小室中的臍帶間充質細胞。七、免疫熒光鑒定對需要鑒定的細胞，用PBS洗2次后，4%多聚甲醛固定15min，0. 1 % Tritonx-100 破膜lOmin，PBS洗三次，5min/次，山羊血清室溫孵育15min，加入一抗4°C過夜，PBS清洗，加二抗室溫孵育1小時，加DAPI染核，一抗分別為兔抗鼠SlOOd 200)，P75，兔抗人 GFAP(1 200)、Nestin(l 200)、NF-200 (1 200)、B-tubulinlll (1 200)、 MAB1580(1 200)熒光顯微鏡下拍照，隨機取6張IOOx視野相片計數，計算許旺細胞純度及類神經元表達各類神經元特異標志的比率。實驗結果一、臍帶間充質細胞的分離、純化及擴增細胞培養后，第二天即可見少量形態各異的貼壁細胞，散在分布。一周后，貼壁細胞形成集落，細胞形態隨著傳代逐漸均一，為兩個或三個突起的長梭形或扁平形的成纖維樣細胞，少量為多突起的星形細胞。細胞折光性好，核仁明顯。成纖維樣細胞增殖旺盛，至兩周左右可以達到80%融合。二免疫表型測定對第3代臍帶間充質干細胞行FACS檢測。臍帶間充質細胞表達⑶105、⑶73、⑶90 和 CD44 不表達 CD34、CD14、CD45、CD19 及 HLA-DR。CD105, CD90, CD73 是間充質細胞相關抗原，⑶14是單核巨噬細胞表面標志，⑶34和⑶45是造血干細胞陽性標記，⑶44為細胞粘附分子，在細胞的貼壁過程中發揮重要的作用。本實驗結果表明，臍帶間充質細胞表達間充質細胞特異性抗原標志而不表達造血系細胞、內皮細胞特異性標志。三臍帶間充質細胞誘導分化為類神經元。1).誘導后細胞形態的變化共培養ai，24h，7a!，臍帶間充質細胞形態均無明顯變化。共培養一周后，臍帶間充質細胞的胞體開始變圓，部分細胞伸出長長的突起，呈雙極、 多極型，有些形成次級突起。多個細胞的突起有時互相連接呈網狀。到兩周時，細胞形態更加接近神經元，而對照組細胞形態無變化。2).神經元樣細胞表達神經細胞特異性抗原標志情況3組不同代次的臍帶間充質細胞，在共培養誘導他后，15. 3士3 % Nestin 陽性，24h 時陽性率達到 70士3 %，72h 后，Nestin+(8士2 % )，NF_200+(32士5 % )， B-III-tubulin+08 士 7% )。共培養Iw后，類神經元表達神經元特異標志情況為 NF-200+(42 士 5 % )，B-III_tubulin+(54 士 7 % )，GFAP+QO 士 3 %)，其誘導 2 周后為 NF-200+(70. 5士5% )，B-III-tubulin+(68. 1 士3% ) ,Nestin(4. 2士3% )，GFAP08士2% )。
權利要求
1.一種誘導臍帶間充質干細胞分化為類神經細胞的方法，其特征是包括下述步驟(1)將臍帶間充質干細胞與許旺細胞用0.4μπι孔徑的Transwell小室隔離共培養，所用培養液為許旺細胞培養液；(2)每三天全量或者半量換一次液，培養兩周即可得到類神經細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是步驟(1)中所述的隔離共培養是小室內放置許旺細胞，下層培養板放置臍帶間充質干細胞。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征是步驟(1)中所述的隔離共培養是小室內放置臍帶間充質干細胞，下層培養板放置許旺細胞。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征是步驟(1)中所用的培養液中含有福司柯林和神經生長因子。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征是步驟(1)培養液中福司柯林的濃度是 2-14 μ m0
6.根據權利要求4所述的方法，其特征是步驟(1)培養液中神經生長因子的濃度是 10-200ng。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征是所用的干細胞為臍帶間充質干細胞。
全文摘要
本發明屬于細胞生物學領域，涉及一種誘導臍帶間充質干細胞分化為類神經細胞的方法。該方法將臍帶間充質干細胞與許旺細胞用0.4μm孔徑的Transwell小室隔離共培養，所用培養液為許旺細胞培養液；每三天全量或者半量換一次液，培養兩周即可得到類神經細胞。本發明應用隔離共培養的方法，復合膠原酶和透明質酸酶混合后消化臍帶可以大量分離臍帶間充質細胞，經傳代至第3代就可以獲得高純度的間充質干細胞。使臍帶間充質干細胞誘導分化為了神經細胞，細胞分化率達到70％以上。其細胞表達NF-200，nestin，β-III-tubulin等神經細胞特異性標記率達到70～80％。
文檔編號C12N5/0775GK102191217SQ20101012459
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月12日 優先權日2010年3月12日
發明者沈尊理, 祝加學, 秦金保 申請人:上海市第一人民醫院