專利名稱：一種同時(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種厭氧細(xì)菌的分離方法。
背景技術(shù)：
可同時(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌主要用于含有硫酸鹽和硝酸鹽污水的處理，該功能菌株快速分離和鑒定對(duì)于污水處理工藝的改進(jìn)以及污水處理的效能提高具有重要的意義，同時(shí)該菌株在微生物降解機(jī)理研究方面具有重要的科研價(jià)值。目前，現(xiàn)有可同時(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的分離方法對(duì)厭氧環(huán)境要求嚴(yán)格，厭氧條件控制困難，分離過程中工作量大，分離周期較長(zhǎng)，同時(shí)現(xiàn)有的分離方法不易獲得純菌株，還存在即使獲得了菌株，卻不是目的功能菌株，而且非目的菌株對(duì)硫酸鹽、硝酸鹽和亞硝酸的降解效果不好?？赏瑫r(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌分離困難，導(dǎo)致許多的基礎(chǔ)理論的研究無法進(jìn)行，且隨著環(huán)境的日益惡化，特別是工業(yè)廢水硫酸鹽和硝酸鹽污染的加劇，可同時(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的分離和相關(guān)的研究凸顯出重要性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有分離同時(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的方法分離周期較長(zhǎng)、不易獲得純菌株的問題，而提供了一種同時(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的分離方法。本發(fā)明同時(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的分離方法按照以下步驟進(jìn)行 一、對(duì)環(huán)境樣本采用DNA抽提試劑盒提取樣品中環(huán)境微生物的總DNA，然后針對(duì)硫酸鹽還原的亞硫酸還原酶基因和反硝化的特異基因nis K基因的序列，采用兩套特異性引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增得到同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌；二、步驟一中擴(kuò)增出的能同時(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、純化培養(yǎng)和富集培養(yǎng)，即得到同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的菌液A ；三、菌液A采用兩套特異性引物對(duì)菌液中細(xì)菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行電泳檢測(cè)，將同時(shí)能夠擴(kuò)增出亞硫酸還原酶基因和nis K基因條帶的菌液確定為同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌I ；四、細(xì)菌I經(jīng)過分離培養(yǎng)、純化培養(yǎng)和富集培養(yǎng)得到同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的菌液B ；五、菌液B采用兩套特異性引物對(duì)菌液中細(xì)菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行電泳檢測(cè)，將同時(shí)能夠擴(kuò)增出亞硫酸還原酶基因和nis K基因條帶的菌液確定為同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌II ；六、 細(xì)菌II經(jīng)過分離培養(yǎng)、純化培養(yǎng)和富集培養(yǎng)得到純菌株即為同時(shí)用于硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌；其中步驟一、步驟三和步驟五中進(jìn)行PCR擴(kuò)增的兩套特異性引物均為第一套硫酸鹽還原的亞硫酸還原酶基因的上游引物為5’- AC[C/G]CACTGGAAGCACG _3’，下游引物為5’ -TGCCGAGGAGAACGATGTC-3’，第一套引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)熱5min、94°C 變性30s、56°C復(fù)性45s、72°C延伸90s、循環(huán)30次和72°C延伸lOmin，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系由 2μ L 的 IOXPCR Buffer,2y L 的 dNTPs (0. 3mmol/L)、1 μ L 的濃度為 0. 1 μ mol/L 的上游引物、1 μ L的濃度為0. 1 μ mol/L的下游引物、0. 3 μ L的濃度為0. 3U/μ L的rT^ E和2yL的濃度為2yg/L的DNA樣品組成；第二套反硝化的特異基因nis K基因上游引物為 5' - TCACACCCCGAGCCGCGCGT-3，，下游引物為 5，- AGKCGTTGAACTTKCCGGTCGG -3，，第二套引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)熱5min、94°C變性30s、55°C復(fù)性45s、72°C延伸90s、循環(huán)30次和72°C延伸lOmin，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系由2 μ L的IOXPCR Buffer,2 μ L的濃度為0. 3mmol/L的dNIPs、l μ L的濃度為0. 1 μ mol/L的上游引物、1 μ L的濃度為0. 1 μ mol/ L的下游引物、0. 3 μ L的濃度為0. 3U/ μ L的rT^ Ε、2 μ L的濃度為2 μ g/L的DNA樣品和 20 μ L的dH20組成。本發(fā)明中的步驟二和步驟四中的分離培養(yǎng)方法均為待分離的厭氧細(xì)菌接種于液態(tài)培養(yǎng)基中，采用亨蓋特厭氧滾管技術(shù)進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后對(duì)分離培養(yǎng)得到的菌株進(jìn)行檢驗(yàn)，篩選出同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌，其中，培養(yǎng)溫度為35 38°C，培養(yǎng)時(shí)間為 7 12天；其中液態(tài)培養(yǎng)基由 4g Na2SO4J-Og KNO3、2. Og NaNO3Ug MgSO4 ·7Η20、0· 5g K2HPO4, 5g酒石酸鉀鈉、1. Og KH2P04、0. 2g CaCl2 ·2Η20和1750mL蒸餾水組成，pH為7. 5 ；亨蓋特厭氧滾管技術(shù)中所使用的固體培養(yǎng)基由4g Na2SO4,2. Og KN03、2. Og NaNO3Ug MgSO4 ·7H20、0. 5g K2HPO4,5g 酒石酸鉀鈉、1. Og ΚΗ2Ρ04、0· 2g CaCl2 · 2H20、12g 瓊脂和 1750mL 蒸餾水組成，pH 為7. 5 ；步驟二和步驟四中的純化培養(yǎng)的方法均為分離培養(yǎng)得到的細(xì)菌接種于固體培養(yǎng)基中在35 38°C條件下培養(yǎng)5 14天得到單菌落；其中固體培養(yǎng)基由4g Na2S04、2.0g KNO3, 2. Og NaNO3Ug MgSO4 · 7Η20、0· 5g K2HP04、5g 酒石酸鉀鈉、1. Og ΚΗ2Ρ04、0· 2g CaCl2 · 2Η20、 12 g瓊脂和1750mL蒸餾水組成，pH為7.5 ；步驟二和步驟四中的富集培養(yǎng)的方法均為純化培養(yǎng)得到的細(xì)菌接種于液體培養(yǎng)基中，在35 38°C條件下富集培養(yǎng)7 14天得到菌液，然后同時(shí)采用特異性引物對(duì)菌液中細(xì)菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將同時(shí)能夠擴(kuò)增出的條帶的菌液確定為同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌；其中液態(tài)培養(yǎng)基由4g Na2SO4,2. Og ΚΝ03、 2. Og NaNO3Ug MgSO4 · 7Η20、0· 5g K2HP04、5g 酒石酸鉀鈉、1. Og ΚΗ2Ρ04、0· 2g CaCl2 · 2Η20 禾口 1750mL蒸餾水組成，pH為7. 5。本發(fā)明的分離方法，與現(xiàn)有厭氧同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化細(xì)菌的分離方法相比， 周期縮短了 409Γ50%，工作量小，周期短；通過兩組特異性引物的PCR擴(kuò)增，能有針對(duì)性的快速的分離，避免了非厭氧同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化細(xì)菌對(duì)檢測(cè)的干擾，使得整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差小，準(zhǔn)確可靠，本發(fā)明的分離方法得了目的菌株的純菌株，且對(duì)硝酸鹽和亞硝酸的降解效果好。
圖1為具體實(shí)施方式
五中的厭氧細(xì)菌的二維掃描電鏡圖； 圖2為具體實(shí)施方式
五中的厭氧細(xì)菌的三維掃描電鏡圖3為具體實(shí)施方式
五中的系統(tǒng)發(fā)育樹；
圖4為具體實(shí)施方式
五中的厭氧細(xì)菌對(duì)Ν03_和Ν02_的降解效果圖，圖中—表示 NO2^的濃度，-A-表示NO3-的濃度，-δ—表示NO3-的降解率；
圖5為具體實(shí)施方式
五中的厭氧細(xì)菌對(duì)S042_的降解效果圖，-▲一表示S042_的濃度， -^表示S042_的去除率；
圖6為具體實(shí)施方式
五的分離方法的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式同時(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的分離方法按照以下步驟進(jìn)行一、對(duì)環(huán)境樣本采用DNA抽提試劑盒提取樣品中環(huán)境微生物的總 DNA，然后針對(duì)硫酸鹽還原的亞硫酸還原酶基因和反硝化的特異基因nis K基因的序列，采用兩套特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌；二、步驟一中擴(kuò)增出的能同時(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、純化培養(yǎng)和富集培養(yǎng)，即得到同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的菌液A ；三、菌液A采用兩套特異性引物對(duì)菌液中細(xì)菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行電泳檢測(cè)，將同時(shí)能夠擴(kuò)增出亞硫酸還原酶基因和nis K基因條帶的菌液確定為同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌I ；四、細(xì)菌I 經(jīng)過分離培養(yǎng)、純化培養(yǎng)和富集培養(yǎng)得到同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的菌液B ； 五、菌液B采用兩套特異性引物對(duì)菌液中細(xì)菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行電泳檢測(cè)， 將同時(shí)能夠擴(kuò)增出亞硫酸還原酶基因和nis K基因條帶的菌液確定為同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌II ；六、細(xì)菌II經(jīng)過分離培養(yǎng)、純化培養(yǎng)和富集培養(yǎng)得到純菌株即為同時(shí)用于硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌；其中步驟一、步驟三和步驟五中的進(jìn)行PCR擴(kuò)增的兩套特異性引物均為第一套硫酸鹽還原的亞硫酸還原酶基因的上游引物為5’- AC[C/G] CACTGGAAGCACG-3，，下游引物為 5，-TGCCGAGGAGAACGATGTC-3，，第一套引物對(duì)應(yīng)的 PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)熱5min、94°C變性30s、56°C復(fù)性45s、72°C延伸90s、循環(huán)30次和72°C 延伸 IOmin, PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系由 2 μ L 的 10XPCR Buffer、2y L 的 dNTPs (0. 3mmol/ L)、lyL的濃度為0. lymol/L的上游引物、1 μ L的濃度為0. 1 μ mol/L的下游引物、 0. 3yL的濃度為0. 3U/yL的rhg E和2 μ L的濃度為2 μ g/L的DNA樣品組成；第二套反硝化的特異基因nis K基因上游引物為5’ -TCACACCCCGAGCCGCGCGT-3’，下游引物為 5’ -AGKCGTTGAACTTKCCGGTCGG-3’，第二套引物對(duì)應(yīng)的 PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)熱 5min、94°C 變性30s、55°C復(fù)性45s、72°C延伸90s、循環(huán)30次和72°C延伸lOmin，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系由 2 μ L 的 10XPCR Buffer,2 μ L 的濃度為 0. 3mmol/L 的 dNTPsU μ L 的濃度為 0. 1 μ mol/ L的上游引物、1 μ L的濃度為0. 1 μ mol/L的下游引物、0. 3 μ L的濃度為0. 3U/μ L的r/i^ Ε、2 μ L的濃度為2 μ g/L的DNA樣品和20 μ L的dH20組成。本實(shí)施方式步驟一中的樣品采自厭氧ABR反應(yīng)器中的活性污泥，該反應(yīng)器用于處理含有硫酸鹽和硝酸鹽的污水。本實(shí)施中的引物均從市場(chǎng)上購買得到。本實(shí)施方式步驟一中DNA的提取方法按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟二和步驟四中的分離培養(yǎng)方法均為待分離的厭氧細(xì)菌接種于液態(tài)培養(yǎng)基中，采用亨蓋特厭氧滾管技術(shù)進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后對(duì)分離培養(yǎng)得到的菌株進(jìn)行檢驗(yàn)，篩選出同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌，其中，培養(yǎng)溫度為35 38°C，培養(yǎng)時(shí)間為7 12天；液態(tài)培養(yǎng)基由4g Na2SO4, 2. Og KNO3>2. Og NaNO3Ug MgSO4 · 7Η20、0· 5g K2HP04、5g 酒石酸鉀鈉、1. Og ΚΗ2Ρ04、0· 2g CaCl2 · 2H20和1750mL蒸餾水組成，pH為7. 5 ；亨蓋特厭氧滾管技術(shù)中所使用的固體培養(yǎng)基由 4g Na2SO4,2. Og ΚΝ03、2· Og NaNO3Ug MgSO4 · 7Η20、0· 5g K2HP04、5g 酒石酸鉀鈉、1. Og KH2P04、0. 2g CaCl2 ·2Η20、12 g瓊脂和1750mL蒸餾水組成，pH為7. 5。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
本實(shí)施方式分離得到的菌進(jìn)行檢驗(yàn)(鏡鑒或革蘭氏染色)可按照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版中記載的方法進(jìn)行。本實(shí)施方式所使用的液態(tài)培養(yǎng)基的配制方法為將4g Na2SO4,2. Og KN03、2. Og NaNO3Ug MgSO4 ·7Η20、0. 5g K2HP04、5g酒石酸鉀鈉、1. Og ΚΗ2Ρ04、0· 2g CaCl2 ·2Η20和 1750mL 蒸餾水混合，煮沸，同時(shí)通入體積純度為99. 99%的氮?dú)庖则?qū)除氧氣，然后向培養(yǎng)基中加入 0. 5g的L-半胱氨酸，利用L-半胱氨酸還原作用去除氧，降低氧化還原電位(低于-IOOmV)， 獲得厭氧條件，即得到液體培養(yǎng)基。具 體實(shí)施方式三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至二不同的是步驟二和步驟四中的純化培養(yǎng)的方法均為分離培養(yǎng)得到的細(xì)菌接種于固體培養(yǎng)基中在35 38°C條件下培養(yǎng)5 14天得到單菌落；其中固體培養(yǎng)基由4g Na2SO4,2. Og KN03、2. Og NaNO3Ug MgSO4 · 7Η20、0· 5g K2HP04、5g 酒石酸鉀鈉、l.Og KH2PO4、0. 2g CaCl2 · 2H20、12 g 瓊脂和 1750mL蒸餾水組成，pH為7. 5。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至二相同。本實(shí)施方式純化得到的菌進(jìn)行檢驗(yàn)(鏡鑒或革蘭氏染色)可按照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版中記載的方法進(jìn)行。本實(shí)施方式所使用的固體培養(yǎng)基的配制方法為將4g Na2SO4,2. Og KN03、2. Og NaNO3Ug MgSO4 ·7Η20、0· 5g K2HP04、5g酒石酸鉀鈉、1. Og ΚΗ2Ρ04、0· 2g CaCl2 ·2Η20、12 g瓊脂和1750mL蒸餾水混合放入到電磁鍋中，煮沸后加入0. 5g L-半胱氨酸和質(zhì)量濃度為0. 2% 的刃天青溶液，若有氧氣存在，培養(yǎng)基的顏色為粉紅色，不斷加熱煮沸，蓋上鍋蓋，通入質(zhì)量純度為99. 99%的氮?dú)?(T40min，直至培養(yǎng)基由粉紅色變成無色，然后厭氧管分裝，在121°C 的條件下滅菌20min，即得到了固體培養(yǎng)基。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至三不同的是步驟二和步驟四中的富集培養(yǎng)的方法均為純化培養(yǎng)得到的細(xì)菌接種于液體培養(yǎng)基中，在35 38°C條件下富集培養(yǎng)7 14天得到菌液，然后同時(shí)采用特異性引物對(duì)菌液中細(xì)菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 將同時(shí)能夠擴(kuò)增出的條帶的菌液確定為同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌；其中液態(tài)培養(yǎng)基由 4gNa2S04、2. Og ΚΝ03、2· Og NaNO3Ug MgSO4 · 7Η20、0· 5g K2HPO4,5g 酒石酸鉀鈉、1. Og KH2P04、0. 2g CaCl2 ·2Η20和1750mL蒸餾水組成，pH為7. 5。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至三相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式同時(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的分離方法按照以下步驟進(jìn)行一、對(duì)環(huán)境樣本采用DNA抽提試劑盒提取樣品中環(huán)境微生物的總 DNA，然后針對(duì)硫酸鹽還原的亞硫酸還原酶基因(DSR基因)和反硝化的特異基因nis K基因的序列，采用兩套特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌； 二、步驟一中擴(kuò)增出的能同時(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、純化培養(yǎng)和富集培養(yǎng)，即得到同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的菌液A ；三、菌液A采用兩套特異性引物對(duì)菌液中細(xì)菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行電泳檢測(cè)，將同時(shí)能夠擴(kuò)增出亞硫酸還原酶基因和nis K基因條帶的菌液確定為同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌 I ；四、細(xì)菌I經(jīng)過分離培養(yǎng)、純化培養(yǎng)和富集培養(yǎng)得到同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的菌液B ；五、菌液B采用兩套特異性引物對(duì)菌液中細(xì)菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行電泳檢測(cè)，將同時(shí)能夠擴(kuò)增出亞硫酸還原酶基因和nis K基因條帶的菌液確定為同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌II ；六、細(xì)菌II經(jīng)過分離培養(yǎng)、純化培養(yǎng)和富集培養(yǎng)得到純菌株即為同時(shí)用于硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌；其中步驟一、步驟三和步驟五中的進(jìn)行PCR擴(kuò)增的兩套特異性引物均為第一套硫酸鹽還原的亞硫酸還原酶基因的上游引物為 5，- AC[C/G] CACTGGAAGCACG-3'，下游引物為 5，-TGCCGAGGAGAACGATGTC-3，，第一套引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)熱5min、94°C變性30s、56°C復(fù)性45s、72°C延伸90s、 循環(huán)30次和72°C延伸lOmin，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系由2μ L的10XPCR Buffer、2y L的 dNTPs (0. 3mmol/L)、1 μ L的濃度為0. 1 μ mol/L的上游引物、1 μ L的濃度為0. 1 μ mol/L的下游引物、0. 3 μ L的濃度為0. 3U/ μ L的r/i^ E禾口 2 μ L的濃度為2 μ g/L的DNA樣品組成； 第二套反硝化的特異基因nis K基因上游引物為5' -TCACACCCCGAGCCGCGCGT-3'，下游引物為5' -AGKCGTTGAACTTKCCGGTCGG-3'，第二套引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)熱5min、 94°C變性30s、55°C復(fù)性45s、72°C延伸90s、循環(huán)30次和72°C延伸lOmin，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系由 2 μ L 的 10 X PCR Buffer,2 μ L 的 dNTPs (0. 3mmol/L)、1 μ L 的濃度為 0. 1 μ mol/L 的上游引物、1 μ L的濃度為0. 1 μ mol/L的下游引物、0. 3 μ L的濃度為0. 3U/μ L的rT^ E、 2 μ L的濃度為2 μ g/L的DNA樣品和20 μ L的dH20組成。本實(shí)施方式步驟一中對(duì)環(huán)境樣本采用DNA抽提試劑盒提取樣品中環(huán)境微生物的總DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，若DSR基因的序列和特異基因nis K基因的序列不同時(shí)存在，則將該樣品被淘汰掉。本實(shí)施方式步驟一中的樣品采自厭氧ABR反應(yīng)器，該反應(yīng)器能夠?qū)崿F(xiàn)硫酸鹽還原和反硝化兩種功能。本實(shí)施中的引物均從市場(chǎng)上購買得到。本實(shí)施方式步驟一中DNA抽提試劑盒試劑盒按說明書操作。 本實(shí)施方式步驟二和步驟四中的分離培養(yǎng)方法均為待分離的厭氧細(xì)菌接種于液態(tài)培養(yǎng)基中，采用亨蓋特厭氧滾管技術(shù)進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后對(duì)分離培養(yǎng)得到的菌株進(jìn)行檢驗(yàn)，篩選出同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌，其中，培養(yǎng)溫度為36°C，培養(yǎng)時(shí)間為10 天；液態(tài)培養(yǎng)基由 4g Na2SO4,2. Og KNO3>2. Og NaNO3Ug MgSO4 ·7Η20、0· 5g K2HP04、5g酒石酸鉀鈉、1. Og KH2P04、0. 2g CaCl2 ·2Η20和1750mL蒸餾水組成，ρΗ為7. 5 ；亨蓋特厭氧滾管技術(shù)中所使用的固體培養(yǎng)基由 4g Na2SO4,2. Og KNO3>2. Og NaNO3Ug MgSO4 ·7Η20、0· 5g K2HPO4,5g 酒石酸鉀鈉、1. Og KH2P04、0. 2g CaCl2 ·2Η20、12 g瓊脂和1750mL蒸餾水組成，ρΗ為7. 5，其中，本實(shí)施方式分離得到的菌進(jìn)行檢驗(yàn)(鏡鑒或革蘭氏染色)可按照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》 第八版中記載的方法進(jìn)行，所使用的液態(tài)培養(yǎng)基的配制方法為將4g Na2SO4,2. Og ΚΝ03、 2. Og NaNO3Ug MgSO4 · 7Η20、0· 5g K2HP04、5g 酒石酸鉀鈉、1. Og KH2PO4、0. 2g CaCl2 · 2H20 和1750mL蒸餾水混合，煮沸，同時(shí)通入體積純度為99. 99%的氮?dú)庖则?qū)除氧氣，然后向培養(yǎng)基中加入0. 5g的L-半胱氨酸，利用L-半胱氨酸還原作用去除氧，降低氧化還原電位(低于-IOOmV)，獲得厭氧條件，即得到液體培養(yǎng)基。本實(shí)施方式步驟二和步驟四中的純化培養(yǎng)的方法均為分離培養(yǎng)得到的細(xì)菌接種于固體培養(yǎng)基中在37°C條件下培養(yǎng)12天得到單菌落；其中固體培養(yǎng)基由4g Na2SO4, 2. Og KNO3>2. Og NaNO3Ug MgSO4 · 7Η20、0· 5g K2HP04、5g 酒石酸鉀鈉、1. Og ΚΗ2Ρ04、0· 2g CaCl2 · 2H20、12 g瓊脂和1750mL蒸餾水組成，ρΗ為7. 5 ；純化得到的菌進(jìn)行檢驗(yàn)(鏡鑒或革蘭氏染色)可按照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版中記載的方法進(jìn)行；所使用的固體培養(yǎng)基的配制方法為將 4g Na2SO4,2. Og ΚΝ03、2· Og NaNO3Ug MgSO4 · 7Η20、0· 5g K2HPO4,5g M石酸鉀鈉、1. Og KH2P04、0. 2g CaCl2 · 2H20、12 g瓊脂和1750mL蒸餾水混合放入到電磁鍋中，煮沸后加入0. 5g L-半胱氨酸和質(zhì)量濃度為0. 2%的刃天青溶液，若有氧氣存在，培養(yǎng)基的顏色為粉紅色，不斷加熱煮沸，蓋上鍋蓋，通入質(zhì)量純度為99. 99%的氮?dú)?5min，直至培養(yǎng)基由粉紅色變成無色，然后厭氧管分裝，在121°C的條件下滅菌20min，即得到了固體培養(yǎng)基。 本實(shí)施方式步驟二和步驟四中的富集培養(yǎng)的方法均為純化培養(yǎng)得到的細(xì)菌接種于液體培養(yǎng)基中，在37°C條件下富集培養(yǎng)12天得到菌液，然后同時(shí)采用特異性引物對(duì)菌液中細(xì)菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將同時(shí)能夠擴(kuò)增出的條帶的菌液確定為同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌；其中液態(tài)培養(yǎng)基由4gNa2S04、2. Og KN03、2. Og NaNO3Ug MgSO4 ·7Η20、0. 5g K2HPO4、5g 酒石酸鉀鈉、1. Og KH2PO4、0. 2g CaCl2 · 2H20 和 1750mL 蒸餾水組成，pH 為 7· 5。本實(shí)施方式的分離方法與現(xiàn)有分離方法相比，周期縮短了 60%，且獲得了目的菌株的純菌株，分離速度快。本實(shí)施方式獲得的純菌株采用《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版中記載的方法，進(jìn)行生理生化鑒定、脂肪酸分析和16s rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析。本實(shí)施方式分離得到的厭氧細(xì)菌(smo)進(jìn)行生理鑒定，如圖1和圖2所示，SNlO 菌株為短桿菌，菌體形態(tài)為短桿狀，菌體大小為寬0. 4(Tl. O μ m，長(zhǎng)1. 5^2. 5 μ m ；革蘭氏染色為陰性，接觸酶陽性，淀粉水解陽性，油脂水解陽性，甲基紅陰性，乙酰甲基醇陰性，產(chǎn)吲哚陽性，檸檬酸鹽利用陽性，石蕊牛奶可還原、凝固；硝酸鹽還原陽性，明膠液化陰性，產(chǎn)硫化氫陽性，產(chǎn)氨試驗(yàn)陽性，尿素水解陽性，最適生長(zhǎng)溫度為20 40°C，初始生長(zhǎng)pH值為 7. 5 ；需氧性為厭氧；葡萄糖氧化發(fā)酵為產(chǎn)酸；葡萄糖發(fā)酵陰性，果糖發(fā)酵陰性，乳糖發(fā)酵陰性，蔗糖發(fā)酵陰性，乙醇發(fā)酵陰性；平板菌落形態(tài)為圓形、表面隆起，顏色為白色。本實(shí)施方式分離得到的厭氧細(xì)菌(smo)的脂肪酸主要分布在 C12:0 C19-CYC-FAME，主要月旨肪酸為 C14:0-FAME, C16:O-FAME 禾口 C18: lc-FAME, C18:0-FAME, C19-CYC-FAME，含量分別為 7. 56%, 48. 23%, 9. 15%, 8. 67%, 6. 98% 占到脂肪酸總數(shù)的80. 59%。本實(shí)施方式分離得到的厭氧細(xì)菌(smo)，經(jīng)測(cè)序后獲得16S rDNA序列，GenBank 登錄號(hào)為DQ450463，系統(tǒng)發(fā)育樹16個(gè)菌株的平均遺傳距離為0. 045，系統(tǒng)樹發(fā)育樹如圖3 所示,系統(tǒng)進(jìn)化表明，Smo菌株的16S rmk序諷與Paenibacillus sp. (EU124565)的相似性為97%，結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特性，初步鑒定為作mi如以7ΛΛ5 sp. SNlO0本實(shí)施方式分離得到的厭氧細(xì)菌(smo)對(duì)NO3-和N02_的降解效果如圖4所示，從圖中可以看出NO3-濃度變化范圍是從初始的5830. 92mg/L,降低到86. 41mg/L，去除率在第 7d的時(shí)候達(dá)到了 98. 52%，而整個(gè)降解過程中有N02_的產(chǎn)生，菌株的中間代謝產(chǎn)物有N02_，而 NO2-濃度期間變化不大，整個(gè)過程中最高為686. 07mg/L, SNlO菌株具有很強(qiáng)的反硝化功能。 如圖5所示，本實(shí)施方式分離得到的厭氧細(xì)菌(smo)對(duì)SO/—的降解效果如圖5所示，從圖 5可以看出，S042_的濃度變化范圍從682. 83mg/L到23. 94mg/L,對(duì)于S042_的去除率最高達(dá)至IJ 96. 49%，SNlO菌株具有較強(qiáng)的硫酸鹽還原能力。本實(shí)施方式分離得到的厭氧細(xì)菌(SWO) 同時(shí)具有硫酸鹽還原功能和反硝化功能，菌株可能先利用硫酸根而后利用硝酸根，該菌株是一株非常具有應(yīng)用價(jià)值的菌株，特別是在地下水修復(fù)以及相應(yīng)的厭氧環(huán)境中，具有較高的開發(fā)潛力。<110>哈爾濱工業(yè)大學(xué)
<120> 一種同時(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的分離方法
<160> 4
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<221> misc_feature <222> (3) <223> m =a 或 c <220>
<223>第一套進(jìn)行PCR擴(kuò)增的硫酸鹽還原的亞硫酸還原酶基因的上游引物的序列 <400> 1
acmcactgga agcacg 16 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>第一套進(jìn)行PCR擴(kuò)增的硫酸鹽還原的亞硫酸還原酶基因的下游引物的序列 <400> 2
tgccgaggag aacgatgtc 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二套進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反硝化的特異基因nis K基因的上游引物的序列 <400> 3
tcacaccccg agccgcgcgt 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<221> misc_feature <222> (3，14)<223> k=g 或 t <220>
<223>第二套進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反硝化的特異基因nis K基因的下游引物的序列 <400>5
agkcgttgaa cttkccggtc gg 2權(quán)利要求
1.一種同時(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的分離方法，其特征在于同時(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的分離方法按照以下步驟進(jìn)行一、對(duì)環(huán)境樣本采用DNA 抽提試劑盒提取樣品中環(huán)境微生物的總DNA，然后針對(duì)硫酸鹽還原的亞硫酸還原酶基因和反硝化的特異基因nis K基因的序列，采用兩套特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌；二、步驟一中擴(kuò)增出的能同時(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、純化培養(yǎng)和富集培養(yǎng)，即得到同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的菌液A ；三、菌液A采用兩套特異性引物對(duì)菌液中細(xì)菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行電泳檢測(cè)，將同時(shí)能夠擴(kuò)增出亞硫酸還原酶基因和nis K基因條帶的菌液確定為同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌I ；四、細(xì)菌I經(jīng)過分離培養(yǎng)、純化培養(yǎng)和富集培養(yǎng)得到同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的菌液B;五、菌液B采用兩套特異性引物對(duì)菌液中細(xì)菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行電泳檢測(cè)，將同時(shí)能夠擴(kuò)增出亞硫酸還原酶基因和nis K基因條帶的菌液確定為同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌II ；六、細(xì)菌II經(jīng)過分離培養(yǎng)、純化培養(yǎng)和富集培養(yǎng)得到純菌株即為同時(shí)用于硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌；其中步驟一、步驟三和步驟五中進(jìn)行PCR擴(kuò)增的兩套特異性引物均為第一套硫酸鹽還原的亞硫酸還原酶基因的上游引物為5’- AC[C/G]CACTGGAAGCACG-3'，下游引物為 5' -TGCCGAGGAGAACGATGTC-3’，第一套引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)熱5min、94°C變性30s、56°C復(fù)性45s、72°C延伸90s、循環(huán)30次和72°C延伸IOmin, PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系由 2μ L 的 10XPCR Buffer、2y L 的濃度為 0. 3mmol/L 的 dNTPs、1 μ L 的濃度為 0. 1 μ mol/L 的上游引物、1 μ L的濃度為0. 1 μ mol/L的下游引物、0. 3 μ L的濃度為0. 3U/μ L的rhg E 和2yL的濃度為2yg/L的DNA樣品組成；第二套反硝化的特異基因nis K基因上游引物為 5，- TCACACCCCGAGCCGCGCGT-3，，下游引物為 5，-AGKCGTTGAACTTKCCGGTCGG-3，，第二套引物對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)熱5min、94°C變性30s、55°C復(fù)性45s、72°C延伸90s、循環(huán)30次和72°C延伸lOmin，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系由2 μ L的10XPCR Buffer,2 μ L的濃度為0. 3mmol/L的dNIPs、l μ L的濃度為0. 1 μ mol/L的上游引物、1 μ L的濃度為0. 1 μ mol/ L的下游引物、0. 3 μ L的濃度為0. 3U/ μ L的rT^ Ε、2 μ L的濃度為2 μ g/L的DNA樣品和 20 μ L的dH20組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的分離方法， 其特征在于步驟二和步驟四中的分離培養(yǎng)方法均為待分離的厭氧細(xì)菌接種于液態(tài)培養(yǎng)基中，采用亨蓋特厭氧滾管技術(shù)進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后對(duì)分離培養(yǎng)得到的菌株進(jìn)行檢驗(yàn)，篩選出同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌，其中，培養(yǎng)溫度為35 38°C，培養(yǎng)時(shí)間為7 12天；液態(tài)培養(yǎng)基由 4g Na2SO4,2. Og ΚΝ03、2· Og NaNO3Ug MgSO4 ·7Η20、0. 5g K2HPO4Ag酒石酸鉀鈉、·1.Og KH2P04、0. 2g CaCl2 ·2Η20和1750mL蒸餾水組成，pH為7.5 ；亨蓋特厭氧滾管技術(shù)中所使用的固體培養(yǎng)基由 4g Na2SO4,2. Og ΚΝ03、2· Og NaNO3Ug MgSO4 · 7Η20、0· 5g K2HPO4,5g 酒石酸鉀鈉、1. Og KH2P04、0. 2g CaCl2 · 2H20、12g 瓊脂和 1750mL 蒸餾水組成，pH 為 7. 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種同時(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的分離方法，其特征在于步驟二和步驟四中的純化培養(yǎng)的方法均為分離培養(yǎng)得到的細(xì)菌接種于固體培養(yǎng)基中在35 38°C條件下培養(yǎng)5 14天得到單菌落；其中固體培養(yǎng)基由4g Na2SO4,·2.Og KNO3>2. Og NaNO3Ug MgSO4 · 7Η20、0· 5g K2HP04、5g 酒石酸鉀鈉、1. Og ΚΗ2Ρ04、0· 2g CaCl2 · 2H20、12 g瓊脂和1750mL蒸餾水組成，pH為7. 5。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種同時(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的分離方法， 其特征在于步驟二和步驟四中的富集培養(yǎng)的方法均為純化培養(yǎng)得到的細(xì)菌接種于液體培養(yǎng)基中，在35 38°C條件下富集培養(yǎng)7 14天得到菌液，然后同時(shí)采用特異性引物對(duì)菌液中細(xì)菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將同時(shí)能夠擴(kuò)增出的條帶的菌液確定為同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌；其中液態(tài)培養(yǎng)基由 4g Na2SO4,2. Og KN03、2. Og NaNO3Ug MgSO4 · 7H20、0. 5g K2HPO4、5g 酒石酸鉀鈉、1. Og KH2PO4、0. 2g CaCl2 · 2H20 和 1750mL 蒸餾水組成，pH 為 7· 5。
全文摘要
一種同時(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的分離方法，它涉及一種厭氧細(xì)菌的分離方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有分離同時(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌的方法分離周期較長(zhǎng)、不易獲得純菌株的問題。方法一、提取DNA、PCR擴(kuò)增；二、分離培養(yǎng)、純化培養(yǎng)和富集培養(yǎng)；三、PCR擴(kuò)增；四、分離培養(yǎng)、純化培養(yǎng)和富集培養(yǎng)；五、PCR擴(kuò)增；六、分離培養(yǎng)、純化培養(yǎng)和富集培養(yǎng)即得到同時(shí)進(jìn)行硫酸鹽還原和反硝化的厭氧細(xì)菌。本發(fā)明的分離方法，與現(xiàn)有厭氧同時(shí)硫酸鹽還原和反硝化細(xì)菌的分離方法相比，周期縮短了40%~50%，工作量小，周期短；本發(fā)明的分離方法得了目的菌株的純菌株，且對(duì)硝酸鹽和亞硝酸的降解效果好。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102277309SQ201010122778
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2010年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月12日
發(fā)明者于申, 代陽, 孫偉, 李春穎, 王博, 王哲, 趙光, 魏利 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)