專利名稱：一種人工改造合成的dORF2<sup>art</sup>基因及其編碼的蛋白質的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，尤其涉及一種豬圓環病毒2型(PorcineCircovirus Type 2，PCV2)的除去核定位信號的經密碼子修飾的d0RF2art基因，該基因編碼的核衣殼 蛋白dCap，及核衣殼蛋白dCap在重組乳酸乳菌球中的表達。
背景技術：
據有關部門統計，我國養豬業每年因各種疾病造成的直接經濟損失總計達上百億 元，直接導致生產成本上升。另外，因疾病所造成的病原污染及治療藥物殘留的食物安全問 題對人類健康也構成一定的威脅。由此可見，目前影響我國養豬業的瓶頸已經不是豬種、飼 料和市場，而是各種疾病所帶來的威脅。疾病的流行是制約我國養豬業可持續發展的主要 因素。因此，采取有效措施控制豬病，對促進養豬業的健康發展和提高動物源性食品安全性 具有重要的意義。豬免疫抑制性疫病已成為全球規模化養豬所面臨的一大問題。原因之一是豬群被 豬圓環病毒2型(Porcine Circovirus type 2，PCV2)感染，導致群體免疫力和健康水平下 降，使豬群對疾病的易感性增高。同時研究表明，PCV2感染可引起繼發性免疫缺陷，發病或 感染豬至少存在短暫的不能激發有效的免疫應答現象。豬圓環病毒(PorcineCircovirus, PCV)屬于圓環病毒科(Circoviridae)圓 環病毒屬(Circovirus)，其基因組是一種環狀、單鏈DNA，長約1760bp左右，分子量為 0. 58X 106Da。PCV對外環境抵抗力較強，在酸性環境及氯仿中可以存活較長時間。根據PCV 的致病性、抗原性及核苷酸序列差異可將其分為PCV1和PCV2兩型。PCV1無致病性，而PCV2 是引發豬斷奶后多系統衰弱綜合癥(Post WeaningMultisystemic Wasting Syndrome, PMWS)的主要病原。該病主要以患畜生長遲緩、進行性消瘦和多系統病理損傷為特征。此外， PCV2還與豬皮炎與腎病綜合癥(Porcine Dermatitis And Nephropathy Syndrome，PDNS)、 新生仔豬先天性腦陣顫、增生性壞死肺炎以及懷孕母豬的繁殖障礙等疾病有關。PCV2已給 全球養豬業造成巨大的經濟損失。因此，近幾年來有效預防和治療PCV2感染受到了業界的 普遍關注。迄今為止，對PCV2感染尚無有效防治措施。在國內，疫苗研究仍處于實驗室研究 階段，尚無商品化疫苗問世。在國外，盡管有報道已成功研制出PCV2注射疫苗，正在我國進 行申報，但我們估計其價格不菲，我國養豬業能否承受如此代價仍是未知數。另一方面，傳 統的注射疫苗在使用過程中存在嚴重的免疫應激，常導致豬只發熱、采食量明顯下降、以及 生長放緩等副作用，因此，如何減少免疫應激也是業界一直關注的問題。再者，傳統的DNA 疫苗雖然制備簡單、成本低廉、可誘導體液免疫和細胞免疫，但是，質粒DNA導入細胞/機體 的效率低下，外源基因表達水平低，DNA在宿主細胞內持續表達可能誘發免疫耐受、自身免 疫、過敏反應和超免疫性，并可能誘導抗DNA抗體，而且存在整合到宿主染色體上的風險。 這些局限促使研究者尋找一種更為安全、表達水平更高、免疫效果更好的免疫調節劑，如由 病毒囊膜蛋白或核衣殼蛋白制備的口服(滴眼或鼻拭、噴)疫苗，通過粘膜免疫以獲得免疫保護。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是一種無入侵性，無病原性的食品安全級 (GRAS)微生物，被認為是粘膜水平上投遞抗原和藥物分子的良好載體。相對于乳桿酸 (Lactobacillus)，乳酸乳球菌因其不定植于動物腸道中，不會引起動物的抗藥性等特點而 受到廣泛的認可和運用。通過免疫刺激動物的口腔、呼吸道、生殖道以及眼角膜等，乳酸乳 球菌可將抗原有效地遞逞到粘膜免疫系統。乳鏈球菌素誘導的表達系統(Nisin Control Expression System，NICE系統) 是目前廣泛研究和使用的乳酸乳球菌表達系統，該菌屬于革蘭氏陽性菌，以乳鏈球菌素 (Nisin)為誘導劑。Nisin是FDA批準可用于食品生產加工中的食品級防腐劑。以Nisin 為誘導劑的NICE系統，避免了如大腸桿菌、酵母菌等表達系統以IPTG、甲醇等有毒物質為 誘導劑，在誘導劑層面保證了安全；同時該系統為緊密型表達系統，具有不含包涵體、含有 較少的蛋白酶、下游操作簡單，以及便于大規模發酵等優點。因此NICE系統是制備粘膜免 疫疫苗的理想表達系統。密碼子偏好性是制約外源基因在NICE表達系統中獲得高效表達的主要因素之 一。隨著生物信息學和基因化學合成的發展，在不改變氨基酸序列的前提下，根據宿主的 密碼子偏好性對外源基因進行密碼子修飾并進行化學合成經修飾的基因已成為可能。該技 術使得更多的外源基因可在乳酸乳球菌表達系統中進行表達，同時許多研究表明經密碼子 修飾的基因其編碼的蛋白質具有同樣的生物功能，即基因密碼子修飾對蛋白質功能并無影 響。
發明內容
針對以上問題，本發明旨在構建含PCV2的d0RF2art基因的重組乳酸乳球菌表達系 統，在重組乳酸乳球菌中表達由其編碼的dCap衣殼蛋白。本發明的第一個目的在于提供一種人工改造合成的d0RF2art基因，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO 1 所示。本發明的第二個目的在于提供一種含有權利要求1所述(101^2"1基因的原核表達 載體。本發明的第三個目的在于提供一種用d0RF2art基因原核表達載體轉化的重組乳酸 乳球菌(Lactococcus lactis NZ9000)，并表達 dCap 蛋白。本發明的第四個目的在于提供一種構建d0RF2art基因原核表達載體的方法，包括 以下步驟1)根據乳酸乳球菌密碼子偏好性設計并人工合成d0RF2art基因；2)首先利用限制性內切酶將步驟1)人工合成的d0RF2art基因進行酶切，再通 過連接酶將該基因插入至原核表達載體(PNZ8048)，得到d0RF2art基因原核表達載體 (pNZ8048-d0RF2art)。本發明的技術路線為1)根據乳酸乳球菌密碼子偏好性設計d0RF2art基因；2)按照步驟1)所設計的核苷酸序列人工合成d0RF2art基因；3)構建 d0RF2art 基因原核表達載體 pNZ8048-d0RF2art ；
4) pNZ8048-d0RF2art 轉化乳酸乳球菌；5)乳酸乳球菌轉化子(Lactococcus lactis NZ9000)誘導表達dCap蛋白。本發明所述d0RF2art基因針對表達宿主菌_乳酸乳球菌的密碼子偏好性，通過生 物信息學方法對野生型的d0RF2基因(d0RF2rt)進行密碼子偏好性修飾，以提高其在宿主中 表達量。經密碼子修飾的d0RF2art基因，相對于野生型基因，579個堿基中共有142個堿基 進行了修飾，其中72個堿基進行了轉換(同類嘌呤或嘧啶間相互轉化)，70個堿基進行了 顛換(嘌呤嘧啶間相互轉化)。密碼子修飾后d0RF2art基因經DNAstar軟件驗證后證實其 所編碼的氨基酸序列與野生型的相同。本發明采用乳酸乳球菌作為表達宿主，由于該菌為益生菌，所以其表達過程中產 生的外源蛋白無需分離、純化，就可以作為口服疫苗直接飼喂動物；同時該菌可調節動物胃 腸道的非特異性免疫功能，從而賦予了普通微生態制劑特異性免疫調節的功能。
圖 1 是重組表達載體 pNZ8048-d0RF2art 的酶切圖，M :DNA markerDL5000,1 5 pNZ8048-d0RF2art Nco I.Sac I 酶切產物；圖 2 是本發明 dCap 蛋白 SDS-PAGE 電泳分析圖，M :proteinmarker，1 3 :Nisin 誘導濃度依次為 30ng/ml，20ng/ml，10ng/ml ；圖3是本發明d0RF2art原核達載體pNZ8048_d0RF2art的構建流程圖。圖4是人工改造dORFart與野生型d0RF2wt編碼的氨基酸序列的同源性比較圖， Query代表d0RF2wt基因序列即野生型d0RF2基因；Optimised代表d0RF2art基因序列即修飾型d0RF2基因；*代表顛換(嘧啶一嘌呤 /嘌呤一嘧啶)代表轉換(嘧啶一嘧啶/嘌呤一嘌呤)。
具體實施例方式以下結合具體實施例對本發明的技術路線做進一步詳細說明。材料與來源限制性內切酶Ncol、SacI、T4DNA連接酶均購自寶生物(大連)公司，E. coli MC1061、乳酸乳球菌載體pNZ8048及乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000購買自荷蘭 NIZ0 Food Research, NL。pNZ8048是一種具有廣泛宿主范圍的載體，可在L. lactis和E. coli中復制，帶有 氯霉素(Cm)抗性篩選標記；L. lactis NZ9000由泛素缺陷型菌株MG1363衍生而來，其染色 體上整合有nisK和nisR基因；E. coliMC1061用于重組載體的克隆和大量DNA制備。實施例1設計d0RF2art基因核苷酸序列以GenBank發布的d0RF2[gi 147883260]為基礎，截去前123個堿基，針對表達宿 主乳酸乳球菌的密碼子偏好性，用OPTIMIZER(http://genomes.urv. es/0PTIMIZER/)對其 進行密碼子修飾，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。實施例2化學合成經密碼子修飾的基因在經設計的d0RF2art基因兩端加上Ncol，SacI酶切位點序列，并委托寶生生物工 程(大連)公司進行化學合成并克隆至pMD19-T-sample，得到pMD 19_d0RF2art。
實施例3 pNZ8048-d0RF2art原核表達載體的構建構建過程參閱圖3，Ncol和SacI分別雙酶切pMD19_d0RF2art和pNZ8048原核表達 質粒，凝膠回收。16°C連接過夜，再轉化E. coliMC1061，氯霉素抗性篩選，挑6個陽性菌落， 分別進行PCR和Nco I, Sac I雙酶切鑒定，鑒定結果參閱圖1。符合預期結果的菌株編號 為MC1061-dCap，送往上海英駿生物技術有限公司進行測序，所得結果與GenBank的Blastn 比對，分析d0RF2art與野生型d0RF2wt之間編碼的氨基酸序列的同源性，參閱圖4，比對結果 證明d0RF2art與d0RF2wt編碼的氨基酸序列完全相同實施例4 dCap蛋白的誘導表達將鑒定正確的攜有(101^2心基因的原核表達載體電擊轉化至乳酸乳球菌 Lactococcus lactis NZ9000中。挑取單菌落接種到含氯霉素(5 ii g/ml)的GM17液體培養 基中，30°C，靜置培養過夜。次日，按2%的接種量接種到含氯霉素(5i!g/ml)的GM17液體 培養基中；當0D600 ^0.4時，加入10mg/ml的Nisin至其終濃度為10ng/ml，30°C下誘導 5h后收菌，12% SDS-PAGE進行分析，證實有dCap蛋白的表達，分子量約為22kD，與預期結 果相符合。結果參閱圖2。GM17培養基配方及配置方法胰蛋白胨5. 0g ；大豆胨5. 0g ；牛肉膏5. 0g ；酵母膏 2. 5g ；抗壞血酸 0. 5g ;MgS04. 7H20 0. 25g ；磷酸甘油二鈉 19. 0g ；蒸餾水 1000ml。pH 6.9。 121°C滅菌冷卻之后再加入預先已滅菌的20% (w/v)葡萄糖溶液至終濃度為0.5% (w/v)
權利要求
一種人工改造合成的dORF2art基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.含有權利要求1所述d0RF2art基因的原核表達載體。
3.用權利要求2所述原核表達載體轉化的乳酸乳球菌。
4.一種構建d0RF2art基因原核表達載體的方法，包括以下步驟1)根據乳酸乳球菌密碼子偏好性設計并人工合成d0RF2art基因；2)將步驟1)人工合成的d0RF2art基因，首先通過限制性內切酶進行酶切，再通過連接 酶將該基因插入至原核表達載體，得到d0RF2art基因原核表達載體。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，公開了一種豬圓環病毒2型(PorcineCircovirus Type 2，PCV2)的除去核定位信號的經密碼子修飾的dORF2art基因，該基因編碼的核衣殼蛋白dCap，及核衣殼蛋白dCap在重組乳酸乳菌球NZ9000(Lactococcus lactis NZ9000)中的表達。所述dORF2art基因可在重組乳酸乳球菌NZ9000中表達PCV2囊膜蛋白，為制成抗PCV2粘膜免疫苗打下了良好的基礎。
文檔編號C12N1/21GK101875941SQ20101012116
公開日2010年11月3日 申請日期2010年3月9日 優先權日2010年3月9日
發明者李適云, 李雪玲, 梁關海, 羅奇, 羅文華, 胡文鋒, 胡斌, 陳曉鵬 申請人:胡文鋒