專利名稱：一種沙棘葉黃酮苷元的生產方法
技術領域：
本發明涉及黃酮苷元的生產方法，具體涉及一種沙棘葉黃酮苷元的生產方法，即
利用微生物發酵的技術從沙棘葉中獲取黃酮苷元的方法。
背景技術：
近年來，很多體內和體外實驗都表明黃酮類化合物有很多的生物功能，包括抗炎癥、抗過敏、抗癌、抗高血壓、抗關節炎和抗菌活性，降低慢性疾病如心血管疾病，治療皮膚病，防止血小管凝集抗過敏作用、抗腫瘤等。沙棘葉中含有豐富的黃酮類物質，其含量遠高于果實中黃酮的含量，并且葉片的低油脂含量也使得其成為黃酮的優質來源；另一方面，沙棘葉來源廣泛，從未被充分利用。目前，國內有利用沙棘葉提取黃酮的，但是沒有人關注其產物的構型和生理活性高低。 通常，黃酮糖苷的生理活性低于黃酮苷元，黃酮苷元比黃酮糖苷具有更高的生物利用率。人體實驗表明，黃酮主要在腸道中被吸收，脂溶性的苷元可從小腸直接吸收；糖苷型的黃酮小部分可以通過結腸中的細菌、微生物的P-葡萄糖苷酶或P-半乳糖苷酶作用而水解，生成的產物又進一步被細胞降解，生成苷元，被結腸壁吸收入血，大部分被腸腔內微生物通過雜環裂解方式降解和代謝而損失掉。即黃酮苷元比黃酮糖苷具有更高的生物效價。有研究表明，在人體內，苷元型的大豆異黃酮比糖苷型吸收更快，被吸收量更多。另外，由于黃酮苷元更容易被吸收，其各種生物活性功能也更強。高榮海等發現小鼠對大豆異黃酮苷元吸收效果強于大豆異黃酮糖苷，大豆異黃酮苷元免疫功能優于大豆異黃酮糖苷。因此，生產黃酮苷元具有更為明顯的意義。 所謂微生物轉化是利用微生物細胞中的酶高效地、選擇性地催化一種化學成分進行某種化學反應，以獲得具有高活性成分的過程。利用微生物發酵液中的代謝酶轉化糖苷型黃酮為苷元形式的黃酮不僅可以降低成本，而且具有反應條件溫和，大豆異黃酮苷元不易變性等優點，因此成為近年來許多學者研究的熱點之一。 目前研究最多的是大豆異黃酮，大豆制品發酵過程中能分泌13 -葡萄糖苷酶的微生物，主要是曲霉、根霉、毛霉和酵母等真菌，尤其是根霉屬(吳定，江漢湖，發酵大豆制品中異黃酮形成及其功能，中國調味品，2001(6) :3-6)。申請號為200610134132. 9、發明名稱為微生物酶法制備大豆異黃酮苷元的方法的專利申請中以大豆異黃酮粉為原料，用培養米曲霉菌發酵制備的P _葡萄糖苷酶能使大豆異黃酮苷轉化率達到90%以上，生物利用率明顯提高。王振麗(王振麗，利用微生物代謝酶轉化大豆異黃酮的研究，沈陽農業大學，2007)篩選了產胞外P-葡萄糖苷酶活力較高的菌株LWQ-0508。王秀伶等(王秀伶，邵建柱，朱寶成等，大豆異黃酮微生物轉化菌株的篩選與鑒定，河北農業大學，2006)以氫黃豆苷元為底物，分離出了能轉化二氫黃豆苷為100% S-型雌馬酚的革蘭氏陰性細菌菌株。在其他黃酮類化合物的轉化方面，申請號為03153489. 9、發明名稱為銀杏黃酮甙元的生產方法的專利申請公開了一種銀杏黃酮苷元的生產方法，采用微生物菌株或生物酶作用原料中黃酮糖苷的生物轉化技術提高產物中黃酮苷元含量。
在其它天然化合物的生物轉化方面，研究也十分活躍。目前有通過酶的作用對沙棘黃酮進行構型轉化，但是酶解法轉化中催化劑是昂貴的糖苷水解酶，成本高，不利于工業化生產。因此應該更多考慮微生物進行轉化。微生物在常溫、常壓等較為溫和的條件下進行糖苷的轉化，能最大限度保護原料中化學成分免遭破壞，為綠色環保技術，能夠在最小成本下獲得最大利益。但是，目前尚未見關于沙棘黃酮微生物發酵轉化的研究報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種沙棘葉黃酮苷元的生產方法，利用微生物轉化技術提高苷元型沙棘黃酮的含量，從而提高沙棘黃酮的生理活性和最終產品中苷元型黃酮的含量。本發明利用黑曲霉對沙棘葉黃酮進行轉化，即利用黑曲霉代謝產生的聚乳糖醛酸酶等對糖苷型黃酮進行酶解，最后生成槲皮素、山奈酚和異鼠李素等黃酮苷元。本發明所采用的為食源性微生物，轉化產物可以直接用于食品。 —種沙棘葉黃酮苷元的生產方法，按照如下操作步驟進行 (1)將黑曲霉接種于液體培養基中，所述液體培養基的組分與用量為每100mL水中加入乙二醇10-20mL、橘皮粉2-4g， (NH4)2S04 1-3g，麩皮1-3g，尿素0. 05-0. lg， CaCl20. 01-0. 02g，初始pH值為5. 0-5. 5 ; (2)將黃酮類化合物含量為10-15%的沙棘葉提取物粉末加入到接種有黑曲霉的液體培養基中，然后將其置于28-42t:條件下，振蕩發酵2-10天，其中，每毫升液體培養基中加入3-7mg沙棘葉提取物粉末； (3)將發酵后的溶液在40-6(TC條件下，振蕩酶解l-5h ; (4)酶解后的溶液置于4。C條件下靜置30-90min，離心15_60min，將沉淀用甲醇溶解，過濾后得到含有黃酮苷元的甲醇溶液。 所述黑曲霉接種于液體培養基中的接種量為每毫升培養基中300-200000個孢子。 步驟(2)中所述沙棘葉提取物粉末的制備方法為本領域常規方法，例如以沙棘葉為原料，提取采用的溶劑是甲醇水溶液、堿性水或者乙醇水溶液，利用振蕩提取，微波輔助提取或者回流方法提取，然后將得到的提取液冷凍干燥，得到含有黃酮類化合物的沙棘葉提取物粉末。所述步驟(2)和(3)的振蕩速度為80-180r/min。 本發明的有益效果本發明以沙棘葉為主料生產黃酮苷元產品，根據文獻報道和實驗結果證明，以往作為廢棄物丟棄的沙棘葉中同樣含有大量的黃酮類物質，其含量比果實高。而且，葉子還有產量大，易采摘收集，儲存方便，采摘周期長等優勢。本發明采用微生物菌株作用原料中黃酮糖苷的生物轉化技術提高產物中黃酮苷元含量，微生物在常溫、常壓等較為溫和的條件下進行糖苷的轉化，能最大限度保護原料中化學成分免遭破壞，為綠色環保技術，能夠在最小成本下獲得最大利益。該方法將糖苷型沙棘總黃酮轉化成黃酮苷元的效率達到10-30%。此外，本發明所采用的微生物為食源性微生物，轉化產物可以直接用于食品。
具體實施例方式
以下實施例僅用以說明而非限制本發明的技術方案。
實施例1 (1)含有黃酮類化合物的沙棘葉提取物粉末的制備在45t:下，對沙棘葉通過80%甲醇水溶液震蕩提取8小時，抽濾，重復三次，合并提取液。然后，將提取液冷凍干燥，得到沙棘葉提取物粉末，粉末中黃酮類化合物含量為12%，其中沙棘總黃酮(即三種主要苷元的所有存在形式的總和)的含量為3. 3% ; (2)液體培養基的配制向100mL水中加入乙二醇15mL、橘皮粉3g， (NH4)2S04 2g，麩皮2g，尿素0. 075g， CaCl2 0. 015g，調節pH值為5. 0 ; (3)取50mL步驟(2)的液體培養基向其中接種黑曲霉(Asp. niger cmcc3. 316，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC))，每毫升培養基接種量2X10S個孢子；
(4)取步驟(1)得到的沙棘葉提取物粉末150mg加入到步驟(3)的接種有黑曲霉的液體培養基中，然后將其置于28°C， 150r/min條件下，發酵4_5天；
(5)將發酵后的溶液在50°C ， 150r/min條件下，酶解3h ; (6)酶解后的溶液置于4t:條件下靜置30min，以3000rpm離心15min，將沉淀用甲醇溶解，過濾后得到含有黃酮苷元的甲醇溶液。溶液中山奈酚0. 4484mg、異鼠李素0. 2828mg，轉化率為23% (以沙棘總黃酮計)。
實施例2 (1)含有黃酮類化合物的沙棘葉提取物粉末的制備在45t:下，對沙棘葉通過65%乙醇水溶液震蕩提取8小時，抽濾，重復三次，合并提取液。然后，將提取液冷凍干燥，得到沙棘葉提取物粉末，粉末中黃酮類化合物含量為15%，其中沙棘總黃酮(即三種主要苷元的所有存在形式的總和)的含量為4. 7% ; (2)液體培養基的配制向100mL水中加入乙二醇10mL、橘皮粉2g， (NH4)2S04 lg，麩皮lg，尿素0. 05g， CaCl2 0. Olg，調節pH值為5. 5 ; (3)取50mL步驟(2)的液體培養基向其中接種黑曲霉(Asp. niger cmcc3. 316，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC))，每毫升培養基接種量4Xl(f個孢子；
(4)取步驟(1)得到的沙棘葉提取物粉末250mg加入到步驟(3)的接種有黑曲霉的液體培養基中，然后將其置于3(TC，80r/min條件下，發酵7_10天；
(5)將發酵后的溶液在60 °C ， 80r/min條件下，酶解5h ; (6)酶解后的溶液置于4。C條件下靜置90min，以3000r/min離心30min，將沉淀用甲醇溶解，過濾后得到含有黃酮苷元的甲醇溶液。溶液中槲皮素0.2462mg，山奈酚0. 0758mg，異鼠李素0. 7008mg，轉化率為21% (以沙棘總黃酮計)。
實施例3 (1)含有黃酮類化合物的沙棘葉提取物粉末的制備在45t:下，對沙棘葉通過80%甲醇水溶液震蕩提取8小時，抽濾，重復三次，合并提取液。然后，將提取液冷凍干燥，得到沙棘葉黃酮類化合物粉末，粉末中黃酮類化合物含量為12%，其中沙棘總黃酮的含量為3. 1% ; (2)液體培養基的配制向100mL水中加入乙二醇20mL、橘皮粉4g， (NH4)2S04 3g，麩皮3g，尿素0. lg， CaCl2 0. 02g，調節pH值為5. 2 ;
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(3)取50mL步驟(2)的液體培養基向其中接種黑曲霉(Asp. nigercmcc3. 316，購
自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC))，每毫升培養基接種300個孢子； (4)取步驟(1)得到的沙棘葉提取物粉末350mg加入到步驟(3)的接種有黑曲霉
的液體培養基中，然后將其置于42°C， 180r/min條件下，發酵2_3天； (5)將發酵后的溶液在40°C ， 180r/min條件下，酶解lh ; (6)酶解后的溶液置于4t:條件下靜置60min，以1500r/min離心30min，將沉淀用甲醇溶解，過濾后得到含有黃酮苷元的甲醇溶液。溶液中主要苷元為槲皮素0. 5185mg，轉化率為14% (以沙棘總黃酮計)。
權利要求
一種沙棘葉黃酮苷元的生產方法，其特征在于，按照如下操作步驟進行(1)將黑曲霉接種于液體培養基中，所述液體培養基的組分與用量為每100mL水中加入乙二醇10-20mL、橘皮粉2-4g，(NH4)2SO4 1-3g，麩皮1-3g，尿素0.05-0.1g，CaCl2 0.01-0.02g，初始pH值為5.0-5.5；(2)將黃酮類化合物含量為10-15％的沙棘葉提取物粉末加入到接種有黑曲霉的液體培養基中，然后將其置于28-42℃條件下，振蕩發酵2-10天，其中，每毫升液體培養基中加入3-7mg沙棘葉提取物粉末；(3)將發酵后的溶液在40-60℃條件下，振蕩酶解1-5h；(4)酶解后的溶液置于4℃條件下靜置30-90min，離心15-60min，將沉淀用甲醇溶解，過濾后得到含有黃酮苷元的甲醇溶液。
2. 根據權利要求1所述的沙棘葉黃酮苷元的生產方法，其特征在于，所述黑曲霉接種于液體培養基中的接種量為每毫升培養基中300-200000個孢子。
3. 根據權利要求l所述的沙棘葉黃酮苷元的生產方法，其特征在于，步驟(2)中所述沙棘葉提取物粉末的制備方法為以沙棘葉為原料，提取采用的溶劑是甲醇水溶液、堿性水或者乙醇水溶液，利用振蕩提取，微波輔助提取或者回流方法提取，然后將得到的提取液冷凍干燥，得到含有黃酮類化合物的沙棘葉提取物粉末。
4. 根據權利要求l所述的沙棘葉黃酮苷元的生產方法，其特征在于，所述步驟(2)和(3)的振蕩速度為80-180r/min。
全文摘要
本發明公開了屬于黃酮苷元的生產方法領域的一種沙棘葉黃酮苷元的生產方法，該方法是從沙棘葉中提取黃酮類化合物，然后將其加入到接種有黑曲霉的液體培養基中，所述液體培養基的組分與用量為每100mL水中加入乙二醇10-20mL、橘皮粉2-4g，(NH4)2SO4 1-3g，麩皮1-3g，尿素0.05-0.1g，CaCl20.01-0.02g，初始pH值為5.0-5.5；在28-42℃條件下，振蕩發酵培養2-10天；然后在40-60℃條件下，振蕩酶解1-5h；酶解后的溶液靜置、離心，沉淀用甲醇溶解，過濾后得到含有黃酮苷元的甲醇溶液。本發明的原料沙棘葉來源廣泛，本發明采用微生物菌株作用原料中黃酮糖苷的生物轉化技術提高產物中黃酮苷元含量，明顯提高了沙棘葉中槲皮素、山奈酚和異鼠李素三種主要苷元的含量。
文檔編號C12P17/06GK101768613SQ20101012081
公開日2010年7月7日 申請日期2010年3月9日 優先權日2010年3月9日
發明者馮淑環, 李剛, 李里特, 殷麗君, 程永強 申請人:中國農業大學