專利名稱：一種所羅門姜黃的轉基因方法
技術領域：
本發明涉及一種植物的轉基因方法，具體涉及一種所羅門姜黃的轉基因方法。
背景技術：
所羅門姜黃(Curcuma soloensis Voel.)是一種很少見的熱帶觀賞花卉，屬于姜科姜黃屬，多年生球根草本花卉。原產所羅門群島，我國廣東已引種栽培。所羅門姜黃株高30 60厘米，植株叢生，葉片長橢圓形，亮綠色，可作觀葉植物盆栽觀賞，亦適合庭園栽培。花期為每年的4 10月，圓柱形的穗狀花序從根莖抽出，花序形如寶塔；紫紅色的苞片在花序上排列緊密，質地如玉般高雅，艷麗多姿，可作花境、花壇布置；此外，所羅門姜黃也是切花的優雅花材，極具觀賞性。花卉是具有很強時令性、新穎性、奇特性、文化性的產品，花卉新品種不僅是最主要的生產資料，而且也是決定花卉產品競爭力的基本要素。沒有一流的品種就不會有一流的產品，就沒有領導花卉潮流的能力，就難以獲得由新品種帶來的高額利潤，更不會有一流的效益。因此通過育種技術，加強科技創新能力，培育優良的花卉新品種是實現花卉業優質高效的根本措施。從所羅門姜黃的觀賞特性來看，雖然該種具有株形好，花葉兼美的觀賞價值，但也有一些重要的園藝性狀急需改造。比如(1)所羅門姜黃開花是在4-10月，若要進行花卉的周年生產，則需改良其開花時間，使其可以周年開花；(2)紫紅色花序的觀賞期可達1個月，但花序上的黃色小花只開放1-2天即腐爛，沾污花序，嚴重的影響整支花序的觀賞價值；(3)花序長10-15厘米，此長度作為切花則稍短。因此需要通過育種技術有針對性地改良這些園藝性狀，從而增強所羅門姜黃在花卉市場的競爭力。多年來，育種學家和園藝工作者利用傳統的雜交育種來改良觀賞植物的性狀，培育出了大量的觀賞植物新品種，但這種育種方法有其局限性。育成一個新品種，往往需要多年多次雜交，育種周期長，而且具有盲目性，對改良某一特定性狀不利。國內外植物育種的經驗與取得的成果已經證實，將分子生物學理論與技術應用于品種改良而形成的分子育種技術為植物育種帶來了一場深刻的革命。轉基因分子育種技術不僅可以大大縮短育種周期，還能夠明顯克服當前育種的盲目性。可根據人類的需要，準確地選擇任何一種目的基因，打破種屬界限，有目的地進行性狀改良，將控制某一特定性狀如株型、花形、花色、花香、 開花時間、觀賞壽命等的基因導入觀賞植物，有針對性的改良植物性狀，從而創造出技術含量高、市場競爭優勢明顯的花卉新品種。在培育花卉優良品種方面，轉基因技術是一個朝陽行業。目前植物轉基因技術主要有花粉通道法、農桿菌介導法和基因槍轟擊法。后兩種方法存在諸多不足如它們需要一個離體培養的階段，需要專業的技術人員在實驗室中無菌操作，費時費工，還需要高級專業的實驗設備以及諸多的組織培養藥劑，成本昂貴。并且這兩種轉基因方法的轉化率僅為千分-百分之幾，轉化率很低。花粉通道法具有成本低，操作簡單等優點，目前已經廣泛的用于植物的轉基因中。但是各種植物的生理特性是不同的，如果將其他植物的花粉通道轉基
3因法移用到另外一種植物上，很可能是不會獲得成功的。因此利用花粉管道法進行轉基因時，應根據具體的植物的生理特性采用具體的方法具體操作。目前關于姜科花卉的轉基因技術尚未見成功報道。由于轉基因花卉所具有的廣闊市場前景和轉基因花卉僅用于觀賞，而不作為食品和動物飼料從而使得公眾較容易接受這一優勢，可以預計在不遠的將來，轉基因花卉將會在花卉市場上拋頭露面大放異彩。
發明內容
本發明的目的是提供一種快速、簡單、轉化效率高的所羅門姜黃的轉基因方法。本發明結合所羅門姜黃的生理特征，在授粉后用注射器將質粒注射到異花傳粉后的柱頭里，質粒就順著花柱下行到子房，轉化受精卵細胞從而得到轉基因的種子，種子萌發出苗，經常規栽培管理即可得到轉基因植株，從而實現了本發明的目的。本發明的所羅門姜黃的轉基因方法包括以下步驟a)在所羅門姜黃異花授粉后1-3小時內，將3-10 μ L，濃度為300-500 μ g/mL的質粒溶液注射到已異花授粉的柱頭里，待其生長、結實，收獲種子；b)將收獲的種子進行培養，使其萌發出苗，利用質粒上的篩選標記或PCR分子檢測法檢測植株，鑒定出轉入質粒的陽性植株，即為轉基因植株。所述的質粒可根據育種的具體要求，優選含有一種或者數種能控制特定性狀的基因，如控制花卉的株型、花形、花色、花香、開花時間、觀賞壽命等性狀的基因。由于所羅門姜黃只有異花授粉才能結出種子，因此為實現本發明，必須采用異花授粉的柱頭。異花授粉步驟如下觀察所羅門姜黃的黃色小花開放程度，選擇花瓣完全打開的小花，用鑷子刮取下花粉，將花粉涂抹在另一朵已去除雄蕊的小花的柱頭上。所述的已異花授粉的柱頭所在的花優選位于花序中段至下段，該段花的結種率高，而位于花序上部的小花通常不能結種。所述的收獲的種子在進行萌發出苗培養前，優選用質量分數為2-10%次氯酸鈉浸泡5-lOmin或用質量分數為0. 1 %的氯化汞溶液浸泡2_;3min進行消毒。消毒過的種子的發芽率可達95-100%，明顯高于不消毒直接播種的30-60%的發芽率。收獲的種子在25-30°C 條件下，約3-7天可萌發出苗，利用質粒的篩選標記或者PCR分子檢測法檢測萌發植株，鑒定出轉入質粒的陽性植株，即為轉基因植株。將該轉基因植株移栽至花盆或者大田，遮光 30-50%，以免灼傷嫩葉，生長適溫為20-30°C，每天早晚各澆水1次，成活率可達100%。待植株高約5cm以上即可進行以后的常規栽培管理。所羅門姜黃無論是盆栽或地栽，都可在4月份進入花期，施肥澆水，滿足植株的養分和水分需求，提供充足的光照，所羅門姜黃可從4-10月不斷開花，在此期間可不斷的實施本發明。所羅門姜黃結種子的數量與授粉季節有關，最合適的季節是夏季6-8月，結種率 (結種率=結種小花數/授粉小花數)約50%，早于6月或遲于8月授粉則結種數減少至 20%以下；結種率不受栽培方式的影響，地栽或盆栽均可；每朵花結種數則與栽培方式有關，若地栽可結種15-20粒/朵，而盆栽能結種5-10粒/朵。為了篩選方便，優選含有篩選標記的質粒，所述的篩選標記優選為抗性基因或者報告基因。所述的抗性基因優選為潮霉素磷酸轉移酶基因(HPT)、新霉素磷酸轉移酶基因 (NPTII)或抗除草劑基因(BAR)。所述的報告基因優選為轉葡糖醛酸酶基因(GUS)。
所述的PCR分子檢測法是根據質粒的序列設計引物，從待篩選的植株中擴增轉入質粒的DNA片段，凝膠電泳檢測后，若能夠擴增出有質粒的條帶則為轉基因植株。本發明結合所羅門姜黃的生理特征，在所羅門姜黃異花授粉后1-3小時內這個特殊的時間，將3-10 μ L，濃度為300-500 μ g/mL的質粒溶液注射到柱頭中，使其通過花粉管通道下行進入子房，轉化受精卵細胞從而得到轉基因種子，種子萌發出苗后即可得到轉基因植株。本發明人通過實驗發現，若授粉后不足1小時將質粒注射至柱頭中，則會影響種子的生長，而收不到種子；若授粉后3小時后將質粒注射至柱頭中，雖然可以收獲種子，但是經檢測，沒有轉基因成功的種子。質粒溶液量應控制在3-10 μ L之間，從而保證注射質粒的質量在IOOOng以上，低于3 μ L則進入子房的質粒太少，轉化率很低；高于10 μ L后，轉化率并沒有升高，浪費質粒溶液。本發明以攜帶椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子和GUS報告基因的PCAMBIA-1301質粒作為轉基因對象，經過本發明的方法處理后，成功的獲得了轉基因植株，其轉化率高達646%。本發明的所羅門姜黃的轉基因方法具有以下有益效果1)原創性本發明的所羅門姜黃的轉基因方法是轉基因方法在姜科植物中首次獲得成功，可以作為姜科其他種轉基因的借鑒。2)操作簡便、可重復性高本發明以所羅門姜黃的花為受體，只需用導入工具如注射器即可，不需要高級專業的實驗設備，因此不需專業技術人員也可操作；而且只要是開花期間均可注射外源基因，一年中可多次進行。3)不需要組織培養傳統的轉基因方法是農桿菌介導法或基因槍法，這些方法均需要一個離體培養的階段，需要在實驗室中無菌操作，費時費工。本方法即可在實驗室中進行，又可在大田中操作即可。4)周期短傳統的轉基因方法需要4個月左右才可得到轉基因植株，而本方法可在半個月內得到轉基因種子，種子3-7天即可萌發，因此20天左右就可得到轉基因植株。5)成本低傳統的轉基因方法需要高壓滅菌鍋、超凈工作臺、人工培養室等實驗設備，還需要準備眾多的組織培養藥劑，若是基因槍法則還需準備注射金粒，成本昂貴。本方法不需準備專業設備，成本低，只需用注射器注射外源基因。6)轉化率高傳統的轉基因方法轉化率為千分-百分之幾，本方法的轉化率可高達6-洸％。7)經濟效益高本發明操作簡單，且成本低，只要是開花期即可采用本發明對所羅門姜黃進行轉基因操作，適合大規模的大田操作，滿足改良花卉觀賞性狀的要求，為觀賞花市場提供新的轉基因花卉新品種，充分發揮所羅門姜黃的觀賞價值，并可以幫助企業提高市場競爭力，獲得較高的經濟效益。
圖1是實施例4中對萌發植株的PCR擴增后，PCR產物的電泳圖，其中1代表以 pCAMBIA-1301質粒為模板擴增后的產物，2，3，4，5分別代表以不同的萌發植株的DNA為模板擴增后的產物，M代表Marker。
具體實施例方式
下述實施例是用于對本發明的內容進行闡述，而不是對本發明的限制，因此在與本發明的權利要求書相當的含義和范圍內的任何改變，都應認為是在權利要求書的范圍內。實施例1(1)應用常規堿裂解法從含有pCAMBIA-1301質粒的大腸桿菌DH5 α提取 pCAMBIA-1301質粒，再用TE溶液稀釋至300 μ g/mL。該質粒攜帶椰菜花葉病毒(CaMV) 35S 啟動子和GUS報告基因，可以從生物試劑公司購買到。(2)所羅門姜黃開花植株的準備地栽的所羅門姜黃每半月施復合肥1次，復合肥選用N P K = 1 1-2 1-2，每天早晚各澆水1次，不遮陰以保證充足的光照，所羅門姜黃可從4-10月不斷開花，從而增加種子的數量和質量；(3)所羅門姜黃的人工授粉8月份觀察所羅門姜黃的黃色小花開放程度，選擇花瓣完全打開的小花，用鑷子刮取下花粉，將花粉涂抹在另一朵已去除雄蕊的小花的柱頭上；(4)將步驟(3)中異花授粉后1小時的花，用醫用注射器注射5μ L 300 μ g/mL 的pCAMBIA-1301質粒溶液至該已異花授粉的柱頭中，約半個月后收獲種子，每朵花可收集 15-20粒種子；(5)轉基因植株的篩選及栽培將步驟中收獲的種子用5%次氯酸鈉浸泡5 分鐘，再撈出用清水沖凈，將種子置于鋪有濕濾紙的培養皿中，30°C條件下約3天可萌發出苗，發芽率95 %。剪下約1厘米的葉片，將剪取的葉片泡于GUS染色液(公知技術)中10-20 小時，葉片染上藍色的即為轉基因植株。經統計，本實施例的轉化率可達9%。將轉基因植株移栽至花盆或大田，遮光30-50%以免灼傷嫩葉，生長適溫為20-30°C，每天早晚各澆水1 次，成活率可達100%。待植株高約5厘米以上即可進行以后的常規栽培管理。實施例2(1)本實施例的pCAMBIA-1301質粒與實施例1的相同，該pCAMBIA-1301質粒用 TE溶液稀釋至500 μ g/mL。(2)所羅門姜黃開花植株的準備地栽的所羅門姜黃每半月施復合肥1次，復合肥選用N P K = 1 1-2 1-2，每天早晚各澆水1次，不遮陰以保證充足的光照，所羅門姜黃可從4-10月不斷開花，從而增加種子的數量和質量；(3)所羅門姜黃的人工授粉9月份觀察所羅門姜黃的黃色小花開放程度，選擇花瓣完全打開的小花，用鑷子刮取下花粉，將花粉涂抹在另一朵已去除雄蕊的小花的柱頭上；(4)將步驟(3)中異花授粉后2小時的花，用醫用注射器注射6μ L 500 μ g/mL 的pCAMBIA-1301質粒溶液至該已異花授粉的柱頭中，約20天后收獲種子，每朵花可收集 10-12粒種子；(5)轉基因植株的篩選及栽培將步驟中收獲的種子用5%次氯酸鈉浸泡7 分鐘，再撈出用清水沖凈，將種子置于鋪有濕濾紙的培養皿中，25°C條件下約7天可萌發出苗，發芽率95%。剪下約1厘米的葉片進行GUS染色檢測，葉片染上藍色的即為轉基因植株。經統計，本實施例的轉化率可達6 %，將轉基因植株移栽至花盆或大田，遮光30-50 %以免灼傷嫩葉，生長適溫為20-30°C，每天早晚各澆水1次，成活率可達100%。待植株高約5厘米以上即可進行以后的常規栽培管理。實施例3(1)本實施例的pCAMBIA-1301質粒與實施例1的相同，該pCAMBIA_1301質粒用 TE溶液稀釋至400yg/mL。(2)所羅門姜黃開花植株的準備地栽的所羅門姜黃每半月施復合肥1次，復合肥選用N P K = 1 1-2 1-2，每天早晚各澆水1次，不遮陰以保證充足的光照，所羅門姜黃可從4-10月不斷開花，從而增加種子的數量和質量；(3)所羅門姜黃的人工授粉7月份觀察所羅門姜黃的黃色小花開放程度，選擇花瓣完全打開的小花，用鑷子刮取下花粉，將花粉涂抹在另一朵已去除雄蕊的小花的柱頭上；(4)將步驟(3)中異花授粉后3小時的花，用醫用注射器注射3μ L 400 μ g/mL 的pCAMBIA-1301質粒溶液至已異花授粉的柱頭中，約半個月后收獲種子，每朵花可收集 15-20粒種子；(5)轉基因植株的篩選及栽培將步驟中收獲的種子用10%次氯酸鈉浸泡8 分鐘，再撈出用清水沖凈，將種子置于鋪有濕濾紙的培養皿中，28°C條件下約5天可萌發出苗，發芽率100%。剪下約1厘米的葉片進行GUS染色檢測，葉片染上藍色的即為轉基因植株。經統計，本實施例的轉化率可達8 %，將轉基因植株移栽至花盆或大田，遮光30-50 %以免灼傷嫩葉，生長適溫為20-30°C，每天早晚各澆水1次，成活率可達100%。待植株高約5 厘米以上即可進行以后的常規栽培管理。實施例4本實施例與實施例3基本相同，只是在以下步驟與實施例3不同步驟(3)所羅門姜黃的人工授粉10月份觀察步驟(2)黃色小花開放的程度，選擇花瓣完全打開的小花，用鑷子刮取下花粉，將花粉涂抹在另一朵已去除雄蕊的小花的柱頭上；步驟將步驟(3)異花授粉后1小時的花，用醫用注射器注射10μ L 400 μ g/ mL的pCAMBIA-1301質粒溶液至已異花授粉的柱頭中，約1個月后收獲種子，每朵花可收集 8-10粒種子；步驟(5)轉基因植株的篩選及栽培收獲的種子直接播于大田，2周后發芽率為60%。剪取2厘米長的葉片作PCR檢測。常規方法提取植株的葉片總基因組DNA，以此為模板(80ng)進行轉基因的PCR檢測，根據pCAMBIA-1301質粒序列設計引物，引物為 HPT U (5-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3) /HPT L (5-ACAGCGTCTCCGACCTGAT-3)，擴增片段全長為 638bp。PCR 反應條件為 94°C 4min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 45s，30 個循環；72°C 5min。1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，如圖1所示，泳道2，3，5中都含有與泳道1中同樣大小的目的片段，表明其所代表的植株中含有pCAMBIA-1301質粒，上述植株即為轉基因植株。經統計，本實施例的轉化率可達。實施例5本實施例與實施例1基本相同，只是在以下步驟與實施例1不同步驟(3)所羅門姜黃的人工授粉9月份觀察所羅門姜黃的黃色小花開放程度， 選擇花瓣完全打開的小花，用鑷子刮取下花粉，將花粉涂抹在另一朵已去除雄蕊的小花的
7柱頭上；步驟⑷將步驟(3)中異花授粉后2小時的花，用醫用注射器注射6yL 300 μ g/ mL的pCAMBIA-1301質粒溶液至已異花授粉的柱頭中，約20天后收獲種子，每朵花可收集 12-15粒種子；經統計，收獲種子的發芽率95%，轉化率14%。實施例6本實施例與實施例5基本相同，只是在以下步驟與實施例5不同步驟(3)所羅門姜黃的人工授粉10月份觀察所羅門姜黃的黃色小花開放程度， 選擇花瓣完全打開的小花，用鑷子刮取下花粉，將花粉涂抹在另一朵已去除雄蕊的小花的柱頭上；步驟⑷將步驟(3)中已異花授粉后2小時的花，用醫用注射器注射IOyL 300 μ g/mL的pCAMBIA-1301質粒溶液至已異花授粉的柱頭中，約1個月后收獲種子，每朵花可收集10-11粒種子。經統計，收獲種子的發芽率95%，轉化率20%。實施例7本實施例與實施例1基本相同，與實施例1不同的是步驟(5):所述的種子用0. 氯化汞消毒3分鐘，再用清水沖洗后播種。經統計，收獲種子的發芽率98%，轉化率7%。
權利要求
1.一種所羅門姜黃(Curcuma soloensis Voel)的轉基因方法，其特征在于，包括以下步驟a)在所羅門姜黃異花授粉后1-3小時內，將3-10μ L，濃度為300-500 μ g/mL的質粒溶液注射到已異花授粉的柱頭里，待其生長、結實，收獲種子；b)將收獲的種子進行培養，使其萌發出苗，利用質粒上的篩選標記或PCR分子檢測法檢測植株，鑒定出轉入質粒的陽性植株，即為轉基因植株。
2.根據權利要求1所述的所羅門姜黃的轉基因方法，其特征在于所述的質粒為轉基因載體，含有一種或者數種能控制花卉性狀的基因。
3.根據權利要求1所述的所羅門姜黃的轉基因方法，其特征在于所述的已異花授粉的柱頭所在的花位于花序的中段至下段。
4.根據權利要求1所述的所羅門姜黃的轉基因方法，其特征在于所述的種子萌發出苗培養前，用質量分數為2-10%次氯酸鈉浸泡5-lOmin或用質量分數為0. 的氯化汞溶液浸泡2-aiiin進行消毒。
5.根據權利要求1所述的所羅門姜黃的轉基因方法，其特征在于所述的篩選標記為抗性基因或報告基因。
6.根據權利要求5所述的所羅門姜黃的轉基因方法，其特征在于所述的抗性基因為潮霉素磷酸轉移酶基因(HPT)、新霉素磷酸轉移酶基因(NPT II)或抗除草劑基因(BAR)。
7.根據權利要求5所述的的所羅門姜黃的轉基因方法，其特征在于所述的報告基因為轉β -葡糖醛酸酶基因(⑶S)。
全文摘要
本發明公開了一種快速、簡單、轉化效率高的所羅門姜黃的轉基因方法。它包括以下步驟a)在所羅門姜黃異花授粉后1-3小時內，將3-10μL，濃度為300-500μg/mL的質粒溶液注射到柱頭里，待其生長、結實，收獲種子；b)將收獲的種子進行培養，使其萌發出苗，利用質粒上的篩選標記或PCR分子檢測法檢測植株，鑒定出轉入質粒的陽性植株，即為轉基因植株。本發明的轉基因方法是轉基因方法在姜科植物中首次獲得成功，該方法操作簡單，成本低，轉化率高，適合大規模的大田操作，滿足改良花卉觀賞性狀要求，為花卉市場提供新的轉基因花卉新品種，充分發揮所羅門姜黃的觀賞價值，并可以幫助企業提高市場競爭力，獲得較高的經濟效益。
文檔編號C12N15/82GK102191273SQ20101011998
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月3日 優先權日2010年3月3日
發明者劉念, 吳國江, 張施君, 盛愛武 申請人:中國科學院華南植物園