專利名稱：一種快速高效dna重組的方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體為可對靶標DNA進行缺失、突變和插入外源DNA片 段，一種快速高效DNA重組的方法及試劑盒。
背景技術：
DNA重組技術自從20世紀70年代初期問世以來，經過了近40年的發展歷程，無論 是在基礎理論研究領域，還是在生產實際應用方面，都已經取得了驚人的成績。DNA重組技 術不僅使整個生命科學的研究發生了前所未有的深刻變化，同時也有力地促進了醫學科學 研究的發展，在疾病的臨床診斷、遺傳病的基因治療、新型疫苗的研制以及癌癥和艾滋病的 研究等諸多科學均已取得了相當的成就。然而，利用限制性內切酶和連接酶為主要工具的傳統DNA重組技術，很難對像BAC 文庫這樣的大分子DNA進行修飾。傳統DNA重組技術中，大多要求DNA片段上存在單一的 限制性內切酶位點，而在大分子DNA中一般的內切酶都存在多個位點。另外，大分子DNA的 體外操作困難、易斷裂，連接、轉化效率也隨DNA片段長度的增加而下降。如果可以在細菌體內完成DNA重組操作，將可以解決以上傳統DNA重組技術中 存在的不足之處。研究發現，來自發光桿菌(Photorhabdusluminescens)的重組酶—— Plu2935和Plu2936可以在細菌體內協同作用，完成DNA分子之間的重組。Plu2936為5，-3， 核酸外切酶，Plu2935為單鏈DNA退火蛋白。在進行DNA重組時，Plu2936與雙鏈線性DNA片 段結合并按5，-3，方向降解DNA單鏈，在另外一條DNA鏈上產生3，突出端。接著，Plu2935 便與DNA 3，突出端結合，形成蛋白-DNA復合體。在受體DNA進行復制時，蛋白-DNA復合體 尋找同源序列的DNA并退火，新成新的DNA分子。在Plu2935和Plu293重組酶的配合作用 下，帶有短同源臂(35 50bp)的供體DNA分子可以在體內重組到受體DNA分子的同源區 域上，從而實現對DNA分子的替換、插入、刪除、突變等多種修飾。該重組酶體系對靶標DNA 分子的大小沒有限制，不受內切酶位點的限制，不需要體外鏈接和轉化過程，可以對各種大 小DNA分子進行操作，尤其DNA大分子修飾方面具有獨特的優勢。
發明內容
本發明所解決的技術問題在于提供一種快速高效DNA重組的方法及試劑盒，以 解決背景技術中的問題。一種快速高效DNA重組的方法包括以下兩步1.引物設計與PCR擴增因為Plu2935和Plu2936重組酶進行DNA重組時，需要兩DNA片段之間有40bp以 上的同源序列，所以在擴增供體DNA的引物5’端應引入40個堿基以上、與受體DNA片段同 源的序列。PCR擴增的條件一般為94°C預變性5min，94°C變性45sec，58°C退火1. 5min， 72°C延伸1 3min(時間長短根據PCR產物大小設定，一般是lmin/lkb DNA)，30個循環， 最后72°C延伸IOmin0
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PCR產物用試劑盒進行純化，去除模板DNA和剩余的引物。因為模板DNA可能會被 轉化進BL-REC的感受態細胞，在抗性平板上生長，給陽性轉化子的篩選帶來困難。引物則 可以與PCR產物競爭受體DNA的同源序列，從而導致重組效率下降。2. DNA電轉化入重組酶表達工程菌的感受態細胞 將純化的PCR產物(供體DNA)與受體DNA片段按照摩爾比1 1混勻，取DNA混 合物(< IOyg)加入到BL-REC感受態細胞中，混勻后加入到電轉杯中，1250v電擊一次。 在電擊杯中加入ImL復蘇液(S0C培養基，0. ImM的MgCl2溶液)，將細菌懸浮并轉移至Ep管 中，37°C復蘇lh，涂板，37°C倒置培養。挑轉化子，對重組DNA進行酶切和PCR鑒定。一種快速高效DNA重組的試劑盒，本發明在大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中誘導表達 來自發光桿菌的重組酶基因——plu2935和plu2936，利用重組酶Plu2935和Plu2936共同 作用，在不需要體外酶切、鏈接的情況下完成DNA重組，達到快速、高效修飾DNA的目的，由 表達重組酶的感受態細胞、對照感受態細胞、標準樣品、復蘇液組成。在本發明中，所述的重組酶的感受態細胞，由經IPTG誘導過的BL-REC工程菌制 備，所述的BL-REC工程菌，由克隆有發光桿菌重組酶基因的pET32a質粒導入大腸桿菌 BL21 (DE3)中構建而成，所述的發光桿菌重組酶基因，由plu2935和plu2936基因組成的共 表達框，所述的對照感受態細胞，由未經誘導的BL-REC工程菌制備，所述的標準樣品，包括 PUC19質粒和含同源序列的氯霉素抗性基因PCR產物組成，氯霉素抗性基因PCR產物，所述 的pUC19質粒，200ng/l·! L的水溶液，所述的氯霉素抗性基因PCR產物，200ng/μ L的水溶 液，所述的復蘇液，由SOC培養基和0. ImM MgCl2溶液均勻混合而成。有益效果本發明操作簡單，效率較高，尤其在DNA大分子修飾方面具有獨特的優勢。
圖1重組酶Plu2935和Plu2936的工作模型圖2重組酶表達質粒pET-plu構建圖3試劑盒中標準樣品重組效率的檢測
具體實施例方式為了使本發明實現的技術手段、創作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結 合具體圖示，進一步闡述本發明。一種快速高效DNA重組的方法及試劑盒，首先制備DNA重組試劑盒1.抽提發光桿菌總DNA將發光桿菌接種到LB斜面，30°C培養6 8h進行活化，然后接一環于50ml LB液 體培養基中，30°C，200r/min搖床培養過夜。離心收集菌體，用TES溶液(lOmMTris-HCl， pH8. 0, ImM EDTA, IOOmM NaCl)沖洗一次。離心，沉淀重懸于TEl (25%蔗糖，25mM Tris-HCl, pH8.0,25mM EDTA)中，加入十二烷基硫酸鈉(SDS)至終濃度為2 %，混勻使細胞裂解，加入 IM NaCl溶液，37°C溫育5min。離心，取上清，等體積酚氯仿抽提，2倍體積乙醇沉淀，70% 乙醇洗滌，吹干，用溶于一定體積的溶液TE2 (lOmMTris-HCl，pH8.0，ImM EDTA)中，再加入 IMNaCl, 10μ g/mlRNase,0. 6mg/ml蛋白酶K，37°C溫育30min。等體積酚氯仿抽提，乙醇沉淀，加IOOml水溶解沉淀，_20°C保存。2. PCR 擴增 plu2935 和 plu2936 基因設計引物兩對引物Plu5-F/Plu5-R，Plu6_F/Plu6-R。Plu5_F :5，-GCCCATGGCCA TGAGCACAGCAGTACAAAAAG-3‘ (Nco I), Plu5~R :5’ CTAGGGATCCTTATGATGCCTTTTTCC-3，(Bam H I) :Plu6~F 5’ -AAGGATCCCTAGCAGGAGGAATTCATATGATCAGCAATGAACTCATTC-3’ (BamH I)， Plu6~R :5’ GCGAGCTCTCATTTCCATTGATCGCCAAATTTG-3’ (Sac I)。以發光桿菌總 DNA 為模板， 以 Plu5-F/Plu5-R 或 Plu6_F/Plu6_R 為引物，分別 PCR 擴增 plu2935 基因和 plu2936 基因。 PCR 反應條件為94°C預變性 5min，94°C變性 45sec，58°C退火 1. 5min，72°C延伸 1. 5min，30 個循環，最后72°C延伸lOmin。采用試劑盒回收純化PCR產物，_20°C保存。3.重組酶基因plu2935和plu2936克隆入pET32a載體Nco I和BamH I雙酶切pET32a和plu2935基因的PCR產物，連接、轉化DH5 α，獲 得的質粒命名為pET-plu2935。BamH I和Sac I雙酶切pET_plu2935和plu2936基因的 PCR產物，連接、轉化DH5a，獲得重組酶表達質粒pET-plu。將pET-plu轉入宿主菌BL(DE3) 中，獲得工程菌BL21-REC。4.制備高效表達重組酶的工程菌感受態細胞將工程菌BL21-REC接入5ml LB培養基中，37°C培養過夜。按2%接種量轉接到 50ml LB培養基中，37°C振蕩培養1. 5h左右，至OD600值達0. 2 0. 3，加入終濃度為lmmol/ L 的 IPTG，37°C培養 lh，誘導表達重組酶 Plu2935 和 Plu2936。4°C，IOOOOrpm 離心 5min 收 集菌體，倒凈培養基，加入IOmL預冷無菌水，充分懸浮菌體。4°C，IOOOOrpm離心5min收集 菌體，倒凈無菌水，加入IOmL預冷無菌水，充分懸浮菌體。4°C，IOOOOrpm離心5min收集 菌體，倒凈無菌水，加入0. 5mL無菌水懸浮菌體，將感受態細胞按每管50 μ L分裝到EP管 中，_80°C保存。5.制備重組效率測試標準樣品和對照樣品為了檢測4中感受態細胞中重組酶Plu2935和Plu2936的重組活性，我們制備了 用于重組效率測定的標準樣品，包括氯霉素抗性基因的PCR產物和pUC19質粒。設計引物 對 Chl-F/Chl-R，PCR 擴增氯霉素抗性基因。Chl-F 5’ -ACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAA AGGAAGAGTTACCTGTGACGGAAGATCACTTC-3，(下劃線部分40的堿基為pUC19質粒同源序列，其 余部分為卡那霉素抗性基因的引物部分)，Chl-R :5’ -AATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTG GTCTGACAGCATCCGCTTATTATCACTTATTC-3 ‘(下劃線部分40的堿基為pUC19質粒同源序列，其 余部分為氯霉素抗性基因的引物部分)。氯霉素抗性基因的PCR產物中存在40bp與pUC19 質粒同源序列。同時，我們還設置了對照感受態細胞(Control)。除了不加入IPTG進行誘導外，對 照感受態細胞的制備與4中表達重組酶的BL21-REC工程菌制備完成一致。因為沒有進行 IPTG誘導，對照感受態細胞中沒有重組酶Plu2935和Plu2935表達，無法進行DNA重組，在 相應抗生素平板上不會有克隆子出現。一種快速高效DNA重組的方法1.引物設計與PCR擴增因為Plu2935和Plu2936重組酶進行DNA重組時，需要兩DNA片段之間有40bp以 上的同源序列，所以在擴增供體DNA的引物5’端應引入40個堿基以上、與受體DNA片段同
5源的序列。PCR擴增的條件一般為94°C預變性5min，94°C變性45sec，58°C退火1. 5min， 72°C延伸1 3min(時間長短根據PCR產物大小設定，一般是lmin/lkb DNA)，30個循環， 最后72°C延伸IOmin0PCR產物用試劑盒進行純化，去除模板DNA和剩余的引物。因為模板DNA可能會被 轉化進BL-REC的感受態細胞，在抗性平板上生長，給陽性轉化子的篩選帶來困難。引物則 可以與PCR產物競爭受體DNA的同源序列，從而導致重組效率下降。2. DNA電轉化入重組酶表達工程菌的感受態細胞將純化的PCR產物(供體DNA)與受體DNA片段按照摩爾比1 1混勻，取DNA混 合物(< IOyg)加入到BL-REC感受態細胞中，混勻后加入到電轉杯中，1250v電擊一次。 在電擊杯中加入ImL復蘇液(S0C培養基，0. ImM的MgCl2溶液)，將細菌懸浮并轉移至Ep管 中，37°C復蘇lh，涂板，37°C倒置培養。挑轉化子，對重組DNA進行酶切和PCR鑒定。利用本發明測定的plu2935和plu2936共表達框序列ATGAGCACAGCAGTACAAAAAGTTTATGAAATCATCAACCCGCTCAAGACTGAATTTGAGCAAATTTGTAGTGAGCCGGGCATAGTATTTAAACGTG
AGTCTGAATTTGCTATGCAGATATTCGCAAATAATGATTTTTTAGCCACAACTGCATTAAATAATCCGGTTTCAGCGCGTAGCGCAGTAATGAACATTGCAGCAATTGGCATTAGTCTAAACCCTGCGCAAAAGCTGGCTTATCTAGTGCCACGAAACAAAAGCGTGTGTCTTGATATCAGTTACATGGGTTTGATGCACATCGCTCAACAATCGGGTGCTATTAAGTGGTGTCAATCCGCTGTTGTTCGAAAAAATGACATATTCAAGCGCACATCTATTGATACTGCGCCAATTCACGAATACAACGAATTCGACACAGCGCAATCGAGGGGGGACATTGTCGGCGCGTATACAGTAATCAAAACGGATGACTGTGATTACATTACTCACACAATGAGAGCATCAGCTATATTTGATATCAGAGATAGATCATCGGCATGGATAGCATATAAAACAAAAGGGAAATCGTGTCCGTGGGTCACGGACGA
GGAACAAATGATTTTAAAAACCGTAGTCAAGCAGGCGGCTAAGTATTGGCCTCGCAGGGAGCGATTAGATAAAGCCATTGACTATGTAAACACAGAGGCGGGTGAAGGAATTGATTTTAGCAAAGGTCAAAACTCTTACATTGACGTAACTCCCGCAGCAGATAGCACAATCGAAAGTATAACAAACTTACTTACAACAATGAATAAAACTTGGGACGATGATTTACTTCCACTTTGTTCAAAGATATTCAGACGACAAATATTATCACCCGCCGAATTAACAGAGTCGGAGGCAATTAAAGCATCTGATTTTTTAAGGAAAAAGGCATCATAAGGATCCCTAGCAGGAGGAATTCATATGATCAGCAATGAACTCATTCTCAGCAAAACAGGGGTTGATTTGCTCACAGTCGAACAGGGAAGTCATGATTGGCAGCGGTTAAGATTGGGAGTAATAACGGCATCGGAAGCCGGAAAAGTGATATCAAAACCGCGTAGTGGTACAAAATGGACAGACATGAAGCTGACATATTTCTATACACTTCTGGGCGAAGTGTGCACAGGTAGTACGCCGGAAGTAAATGCAAAAACATTAGCGTGGGGAAAAAATTACGAAGAATCAGCAAGAGCAACTTTTGAATTTGTAGCTGATGTAAATGTAACGGAAACTTCAATTCTATTTAAAGATGAATCGCTCAGAACCGCATGCTCACCAGATGGTATTTG[0066TAGTGACGGACTTGGGCTTGAACTTAAATGTCCTTTTACTACTGCTGTA[0067TTTATGAAATTCCGCTTGGGTGGTTTTGATGCTATTAAATCTGAATATAT[0068GGCTCAAGTTCAATATTCGATGTGGGTCACAGGTAAAAATGAATGGTAC[0069TTTGCTAATTATGACCCGCGTATGACTCGTGAAGGGATTCATTACGTTGT[0070TGTTGAGCGTGACAACGAATATATGAGTCAGTTTAATGATATGGTTCCC[0071GATTTCATAGAAAAAATGGACGAATCATTAAATGAAATCGGCTTCAAAT[0072TTGGCGATCAATGGAAATGA[0073利用本發明測定的含同源序列的氯霉素抗性基因序列[0074ACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTTACCTGTGA[0075CGGAAGATCACTTCGCAGAATAAATAAATCCTGGTGTCCCTGTTGATAC[0076CGGGAAGCCCTGGGCCAACTTTTGGCGAAAATGAGACGTTGATCGGC[0077ACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGG[0078CGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATG[0079GAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATC[0080GTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAA[0081CCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAA[0082AAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGA[0083TGAATGCTCATCCGGAATTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGG[0084TGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAAC[0085TGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCA[0086GTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTG[0087GCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAA[0088TCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGAC[0089AACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCG[0090ACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGA[0091TGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGAT[0092GAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTT[0093AAACGCCTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGATAATAAGCGGATGCTGTC[0094AGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATT[0095以上所述僅是本發明的優選實施方式，本發明的保護范圍并不僅局限于上述實施
例，凡屬于本發明思路下的技術方案均屬于本發明的保護范圍。應當指出，對于本技術領域 的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理前提下的若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也 應視為本發明的保護范圍。
權利要求
一種快速高效DNA重組的方法包括以下兩步(1).引物設計與PCR擴增Plu2935和Plu2936重組酶進行DNA重組時，需要兩DNA片段之間有40bp以上的同源序列，所以在擴增供體DNA的引物5’端應引入40個堿基以上、與受體DNA片段同源的序列。PCR擴增的條件一般為94℃預變性5min，94℃變性45sec，58℃退火1.5min，72℃延伸1～3min(時間長短根據PCR產物大小設定，一般是1min/1kb DNA)，30個循環，最后72℃延伸10min，PCR產物用試劑盒進行純化，去除模板DNA和剩余的引物，因為模板DNA可能會被轉化進BL REC的感受態細胞，在抗性平板上生長，給陽性轉化子的篩選帶來困難，引物則可以與PCR產物競爭受體DNA的同源序列，從而導致重組效率下降；(2).DNA電轉化入重組酶表達工程菌的感受態細胞將純化的PCR產物(供體DNA)與受體DNA片段按照摩爾比1∶1混勻，取DNA混合物(＜10μg)加入到BL REC感受態細胞中，混勻后加入到電轉杯中，1250v電擊一次。在電擊杯中加入1mL復蘇液(SOC培養基，0.1mM的MgCl2溶液)，將細菌懸浮并轉移至Ep管中，37℃復蘇1h，涂板，37℃倒置培養。挑轉化子，對重組DNA進行酶切和PCR鑒定。
2.一種快速高效DNA重組的試劑盒，其特征在于由表達重組酶的感受態細胞、對照感 受態細胞、標準樣品、復蘇液組成。
3.根據權利要求2所述的一種快速高效DNA重組的試劑盒，其特征在于所述的重組 酶的感受態細胞，由經IPTG誘導過的BL-REC工程菌制備，所述的BL-REC工程菌，由克隆有 發光桿菌重組酶基因的pET32a質粒導入大腸桿菌BL21(DE3)中構建而成，所述的發光桿菌 重組酶基因，由plu2935和plu2936基因組成的共表達框，所述的對照感受態細胞，由未經 誘導的BL-REC工程菌制備，所述的標準樣品，包括pUC19質粒和含同源序列的氯霉素抗性 基因PCR產物組成，氯霉素抗性基因PCR產物，所述的pUC19質粒，200ng/ μ L的水溶液，所 述的氯霉素抗性基因PCR產物，200ng/ μ L的水溶液，所述的復蘇液，由SOC培養基和0. ImM MgCl2溶液均勻混合而成。
全文摘要
一種快速高效DNA重組的方法及試劑盒，通過提取發光桿菌的總DNA，以此為模板PCR擴增plu2935和plu2936基因，將plu2935和plu2936基因克隆入pET32a載體，構建獲得重組酶表達載體pET-plu，將pET-plu導入BL21(DE3)中，獲得可表達重組酶Plu2935和Plu2936的工程菌BL21-REC。IPTG誘導BL21-REC，表達Plu2935和Plu2936重組酶，并制備成感受態細胞。將含有同源序列的兩DNA片段工轉化入BL21-REC感受態細胞，在相應抗性平板上篩選獲得含重組DNA的轉化子。
文檔編號C12N15/09GK101899431SQ20101011340
公開日2010年12月1日 申請日期2010年2月25日 優先權日2010年2月25日
發明者萬俊松 申請人:萬俊松