專利名稱：具有高產d-塔格糖能力的l-阿拉伯糖異構酶的突變體酶l20a及其突變方法
技術領域：
本發明涉及一種具有高產D-塔格糖能力的L-阿拉伯糖異構酶的突變體酶及其突 變方法，以及利用該突變體酶生產D-塔格糖的技術，屬于生物工程、基因工程和酶工程技 術領域。
背景技術：
D-塔格糖是近年發現的一種具有特殊保健功能的功能性甜味劑。D-塔格糖屬于
天然稀有糖的一種，在許多食品中都發現少量存在，如高溫滅菌牛奶、奶酪、酸奶及其它奶 制品等。2000年美國食品與藥物管理局(FDA)確定D-塔格糖為普遍公認安全食品(GRAS)， 并正式批準作為甜味劑用于食品飲料業以及醫藥制劑中；隨后聯合國糧農組織和世界衛生 組織的聯合食品添加劑委員會第57次會議批準D-塔格糖作為食品添加劑；歐盟也于2003 年批準D-塔格糖在歐洲上市。 目前，國內對于D-塔格糖生產的研究還處于起步階段，國外對其研究已較為深 入，方法主要有兩種化學法和生物法。但目前市售的D-塔格糖都是由化學法生產的。由于 一方面化學法生產存在許多不利因素，如化學污染物多，堿性條件下異構化反應副產物多， 分離困難等；另一方面由于消費者消費觀念的轉變，天然食品的需求日益增長，因此近年來 對D-塔格糖生產的研究集中在生物法上。 研究發現L-阿拉伯糖異構酶(EC 5.3. 1.4，縮寫為L-AI)可以催化D-半乳糖 轉化為D-塔格糖，是目前生物法生產D-塔格糖最為有效的途徑。但是L-AI是一種非專 一性酶，它可以分別催化L-阿拉伯糖和D-半乳糖為L-核酮糖和D-塔格糖。研究表明 L-AI催化L-阿拉伯糖的效率明顯高于D-半乳糖。本發明所使用的來源于(Acidothermus cellulolytics)ATCC 43068的L_AI酶是一種高耐熱性酶，具有工業應用前景。因此，進一 步提高該酶催化D-半乳糖轉化生產D-塔格糖的能力將賦予其更好的應用潛能。
發明內容
本發明的 一 個目的是提供提高來源于解纖維熱酸菌
(Acidothermuscellipolytics) ATCC 43068的L-AI酶產D_塔格糖能力的方案。 本發明的另一個目的是提出具有更高生產D-塔格糖能力的單突變體酶L20A，及
其構建方法。 同時本發明還提供了一種利用該單突變體酶L20A生產D-塔格糖的方法。
本發明的技術方案一種L-可拉伯糖異構酶的單突變體酶L20A，將來源于解纖維 熱酸菌(Acidothe麗s eel lipolytics) ATCC 43068的L_阿拉伯糖異構酶L-AI酶(其基 因序列詳見Appl Microbiol Biotechnol D0I10. 1007/s00253-009-2322-z)，進行突變所 得的單突變體酶L20A ;其為L-AI酶基因中第20位的亮氨酸Leu突變成了丙氨酸Ala，命名 為L20A ;它相比于野生型L-AI酶具有更高的產D-塔格糖的能力。
下游外側引物
正向突變引物
反向突變引物 所述的L-阿拉伯糖異構酶的單突變體酶L20A的制備方法，根據ATCC43068的 L-AI酶基因序列，設計突變引物，對L-AI酶進行定點突變，測定DNA序列，鑒定出第20位 Leu密碼子突變成Ala密碼子，并將其表達于大腸桿菌中，經誘導即得L-阿拉伯糖異構酶的 單突變體酶L20A;步驟為
(1)定點突變利用重疊延伸PCR技術，以表達載體pET-22b(+)-araA為原始模版，經PCR1，PCR2 及PCR3，引入L20A突變點，定點突變的引物為
上游外側引物5' -TATATAAGCTTTCACCACGGCCGCGATGC-3'，
:5， -TTATCCATATGACCGACCTGCCCTATCCG-3，， :5' -CAGCATGCGTACGGCGAGGACGT-3，,下劃線為突變堿基， :5' -CGCCGTACGCATGCTGACTGC-3，,下劃線為突變堿基，
PCR1反應體系為10XPCR buffer 5iiL，2mM dNTP 4 ii L， 10 ii M上游外側引物 liiL，10iiM反向突變引物liiL，模版DNA liiL，5U/mL taq plus 0. 5 y L，加入雙蒸水至 50ii L。 PCR2反應體系為IOXPCR buffer 5iiL，2mM dNTP 4 ii L， 10 ii M下游外側引物 lyL，lOiiM正向突變引物liiL，模版DNA liiL，5U/mL taq plus 0. 5 y L，加入雙蒸水至 50ii L。PCR1、 PCR2擴增條件為94t:預變性4min ;隨后進行94。C變性lmin，56t:退火
lmin，72。C延伸lmin的35個循環；最后72。C保溫10min ;PCR1、 PCR2擴增產物經瓊脂糖電泳檢測，割膠回收純化； PCR3反應體系為10XPCR buffer 10iiL，2mM dNTP 8 ii L， 10 ii M上游外側引物 1 ii L， 10 ii L下游外側引物1 y L， PCR1純化產物10 ii L， PCR2純化產物10 ii L， 5U/mL taq plus lyL，加入雙蒸水至100iiL;PCR3擴增條件為94t:變性lmin，56t:退火lmin，72t:延伸5min ;隨后進行94°C 變性lmin，56。C退火lmin，72。C延伸lmin的35個循環；最后72。C保溫10min。
(2)突變體載體質粒的構建 經瓊脂糖電泳膠回收純化后的PCR3擴增產物經限制性內切酶Ndel和HindIII消 化后連接至載體pET-22b (+)，并轉化至大腸桿菌DH5 a感受態細胞中，在含50 y g/mL氨芐 青霉素的LB固體培養基培養過夜后，挑單克隆于含50 ii g/mL氨芐青霉素的LB液體培養基 培養，后提取突變質粒，將突變質粒轉化至表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，突 變質粒經測序鑒定為正確的突變；
(3)突變體的表達 挑取轉入表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3)的單克隆于含50 y g/mL氨芐青霉素的LB 液體培養基中，37t:振蕩培養過夜，按2%接種量接種至含50 ii g/mL氨芐青霉素的LB液體 培養基中；37t:振蕩培養至0D6。。為0. 6-0. 8時，加入0. 4mM終濃度的異丙基_ P _D_硫代半 乳糖苷(IPTG)進行誘導表達，并在3(TC繼續振蕩培養12h后，將發酵液于4t:、1000rpm離 心10min收集菌體；
(4)單突變體酶的純化 將步驟(3)收集的突變體菌體重懸于Tris-HCl緩沖液中，經超聲波破碎后，于4t:、1000rpm離心20min去除細胞碎片，收集上清，經強陰離子交換柱Q-S印harose進行初 步純化，隨后收集活性部分再經分子篩S印hodex S200純化，得到單突變體酶L20A的純酶 制品。 本發明的有益效果本發明構建了一個有工業經濟價值的單突變體酶L20A，實現 了 L-AI酶活力的提高，比野生型L-AI酶更有利于D-塔格糖的工業化生產。
圖1野生型L-AI酶和單突變體酶L20A的D-塔格糖轉化圖。A表示野生型L-AI 酶；B表示單突變體酶L20A。 下游外側引物
正向突變引物
反向突變引物
具體實施例方式
實施例1 :本例說明單突變體酶L20A的制備。
(1)定點突變 利用重疊延伸PCR技術，以表達載體pET-22b(+)-araA為原始模版，經PCR1，PCR2 及PCR3，引入L20A突變點，定點突變的引物為
上游外側引物5' -TATATAAGCTTTCACCACGGCCGCGATGC-3'，
:5， -TTATCCATATGACCGACCTGCCCTATCCG-3，， :5' -CAGCATGCGTACGGCGAGGACGT-3，(下劃線為突變堿基) :5' -CGCCGTACGCATGCTGACTGC-3，(下劃線為突變堿基)
PCR1反應體系為10XPCR buffer 5iiL，2mM dNTP 4 ii L， 10 ii M上游外側引物 liiL，10iiM反向突變引物liiL，模版DNA liiL，5U/mL taq plus 0. 5 y L，加入雙蒸水至 50ii L。 PCR2反應體系為10XPCR buffer 5iiL，2mM dNTP 4 ii L， 10 ii M下游外側引物 lyL，lOiiM正向突變引物liiL，模版DNA liiL，5U/mL taq plus 0. 5 y L，加入雙蒸水至 50ii L。PCR1、 PCR2擴增條件為:94"C預變性4min ;隨后進行94。C變性lmin，56。C退火
lmin，72。C延伸lmin的35個循環；最后72。C保溫10min。 PCR1、 PCR2擴增產物經瓊脂糖電泳檢測，并通過膠回收純化。PCR3反應體系為10XPCR buffer 10iiL，2mM dNTP 8 ii L， 10 ii M上游外側引物
1 ii L， 10 ii L下游外側引物1 y L， PCR1純化產物10 ii L， PCR2純化產物10 ii L， 5U/mL taq
plus lyL，加入雙蒸水至100iiL。PCR3擴增條件為94t:變性lmin，56t:退火lmin，72t:延伸5min ;隨后進行94°C 變性lmin，56。C退火lmin，72。C延伸lmin的35個循環；最后72。C保溫10min。
(2)突變體載體質粒的構建 經瓊脂糖電泳膠回收純化后的PCR3擴增產物經限制性內切酶Ndel和HindIII消 化后連接至載體pET-22b (+)，并轉化至大腸桿菌DH5 a感受態細胞中，在含50 y g/mL氨芐 青霉素的LB固體培養基培養過夜后，挑單克隆于含50 ii g/mL氨芐青霉素的LB液體培養基 培養，后提取突變質粒，將突變質粒轉化至表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞中，突 變質粒經測序鑒定為正確的突變。
(3)突變體的表達 挑取轉入表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3)的單克隆于含50 y g/mL氨芐青霉素的LB 液體培養基中，37t:振蕩培養過夜，按2%接種量接種至含50 ii g/mL氨芐青霉素的LB液體 培養基中；37t:振蕩培養至0D6。。為0. 6-0. 8時，加入0. 4mM終濃度的IPTG進行誘導表達， 并在3(TC繼續振蕩培養12小時后，將發酵液于4t:、1000rpm離心10min收集菌體。
(4)突變體酶的純化 將表達的突變體菌體重懸于Tris-HCl緩沖液中，經超聲波破碎后，于4 °C 、 1000rpm離心20min去除細胞碎片，收集上清，經強陰離子交換柱Q-S印harose進行初步純 化，隨后收集并濃縮活性部分再經分子篩S印hodex S200純化，得到單突變體酶L20A的純 酶制品，經SDS-PAGE檢測為單一條帶。
實施例2 :本例說明酶活分析。 1)酶活的測定方法半胱氨酸-咔唑法測定L-AI的活力取適當稀釋的酶液 20iiL，加入裝有980iiL預先用50mM Tris-HCL(p朋.0)配置的50mM D-半乳糖溶液中，在 75t:水浴中反應10min后，于冰上終止反應。取適當稀釋的反應液50 y L，加入950 y L去 離子水，加入200iiL 1.5X的鹽酸-半胱氨酸溶液，再加入6mL 75%的硫酸，混勻，然后加 入200 ii L 0. 12%的咔唑酒精溶液，立即混勻并于6(TC水浴保溫10min后冰浴終止反應，在 560nm處測定吸光度。 一個酶活單位的定義為在該條件下每分鐘生成1 P mol D-塔格糖所 需的酶量。 2)酶活的比較將突變體酶L20A的純酶制品與野生型L-AI純酶制品相比，可以 發現突變體酶L20A的產D-塔格糖的能力明顯上升，其酶活為野生型的2. 2倍；而其產 L-核酮糖的能力，與野生型相比基本保持不變，說明該突變體酶L20A對催化生產D-塔格糖 的底物專一性有明顯改善作用。 實施例3 :利用突變體酶L20A轉化生產D-塔格糖。 在兩份50mM Tris-HCl配置的終濃度為50mM的D-半乳糖溶液中，每份中分別加 入一定量的野生型L-AI酶或突變體酶L20A，使反應體系中酶活為0. 1U/mL，75t:水浴條件 下進行轉化反應，分別在1、2、4、6、8、10、12、24小時取樣，煮沸10min滅酶，1000rpm離心 10min，取上清后利用高效液相色譜(HPLC)測定生成的D-塔格糖含量。
HPLC進行產物分析的色譜條件為Agilent 1200 HPLC色譜儀，色譜柱Shodex NH2P-504E，Shodex RI-101示差折光檢測器，流動相為65% (V/V)乙腈水溶液，柱溫35°C ， 流速lmlVmin。 結果列于圖1 ，突變體酶L20A與野生型L-AI相比，其催化速度顯著提高，轉化率提 高了8%。突變體酶L20A反應lh，其轉化率達50X ;反應處，轉化率即達到最高61% ;而 野生型L-AI酶反應lh，其轉化率只有20%;10h以后反應才達到平衡，最高轉化率為53%。
權利要求
一種L-阿拉伯糖異構酶的單突變體酶L20A，其特征在于將來源于解纖維熱酸菌(Acidothermus cellulolytics)ATCC 43068的L-阿拉伯糖異構酶L-AI酶，進行突變所得的單突變體酶L20A；其為L-AI酶基因中第20位的亮氨酸Leu突變成了丙氨酸Ala，命名為L20A；它相比于野生型L-AI酶具有更高的產D-塔格糖的能力。
2. 權利要求1所述的L-阿拉伯糖異構酶的單突變體酶L20A的制備方法，其特征在于 根據ATCC 43068的L_AI酶基因序列，設計突變引物，對L_AI酶進行定點突變，測定DNA序 列，鑒定出第20位Leu密碼子突變成Ala密碼子，并將其表達于大腸桿菌中，經誘導即得 L-阿拉伯糖異構酶的單突變體酶L20A ;步驟為(1) 定點突變利用重疊延伸PCR技術，以表達載體pET-22b(+)-araA為原始模版，經PCR1， PCR2及PCR3，引入L20A突變點，定點突變的引物為上游外側引物5' -TATATAAGCTTTCACCACGGCCGCGATGC-3'，下游外側引物5' -TTATCCATATGACCGACCTGCCCTATCCG-3'，正向突變引物5' -CAGCATOeeTACGGCGAGGACGT-3'，下劃線為突變堿基，反向突變引物5' -CGCCGTAeeeATGCTGACTGC-3'，下劃線為突變堿基，PCR1反應體系為10XPCR buffer 5iiL，2mM dNTP 4 ii L， 10 ii M上游外側引物1 ii L，10iiM反向突變引物liiL，模版DNA liiL，5U/mL taq plus 0. 5 y L，加入雙蒸水至50 y L ; PCR2反應體系為10XPCR buffer 5iiL，2mM dNTP 4 ii L， 10 ii M下游外側引物1 ii L，10iiM正向突變引物liiL，模版DNA liiL，5U/mL taq plus 0. 5 y L，加入雙蒸水至50 y L ; PCR1、PCR2擴增條件為94t:預變性4min ;隨后進行94。C變性lmin， 56"退火lmin，72t:延伸lmin的35個循環；最后72"保溫10min ; PCR1、PCR2擴增產物經瓊脂糖電泳檢測，割膠回收純化；PCR3反應體系為:10XPCR buffer 10iiL，2mM dNTP 8 ii L， 10 ii M上游外側引物1 ii L， 10 ii M下游外側引物1 y L， PCR1純化產物10 ii L， PCR2純化產物10 ii L， 5U/mL taq plus liiL，加入雙蒸水至100iiL ;PCR3擴增條件為94t:變性lmin，56t:退火lmin，72t:延伸5min ;隨后進行94"C變性 lmin，56t:退火lmin，72t:延伸lmin的35個循環；最后72"C保溫10min ;(2) 突變體載體質粒的構建經瓊脂糖電泳膠回收純化后的PCR3擴增產物經限制性內切酶Ndel和HindiII消化 后連接至載體pET-22b (+)，并轉化至大腸桿菌DH5 a感受態細胞中，在含50 y g/mL氨芐青 霉素的LB固體培養基培養過夜后，挑單克隆于含50 ii g/mL氨芐青霉素的LB液體培養基培 養，后提取突變質粒，將突變質粒轉化至表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，突變 質粒經測序鑒定為正確的突變；(3) 突變體的表達挑取轉入表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3)的單克隆于含50 y g/mL氨芐青霉素的LB液體 培養基中，37t:振蕩培養過夜，按2%接種量接種至含50 ii g/mL氨芐青霉素的LB液體培養 基中；37t:振蕩培養至0D6。。為0. 6-0. 8時，加入0. 4mM終濃度的異丙基_ P _D_硫代半乳糖 苷IPTG進行誘導表達，并在3(TC繼續振蕩培養12h后，將發酵液于4°C 、 1000rpm離心10min收集菌體；(4)單突變體酶的純化將步驟(3)收集的突變體菌體重懸于Tris-HCl緩沖液中，經超聲波破碎后，于4t:、 lOOOrpm離心20min去除細胞碎片，收集上清，經強陰離子交換柱Q-S印harose進行初步純 化，隨后收集活性部分再經分子篩S印hodex S200純化，得到單突變體酶L20A的純酶制品。
全文摘要
具有高產D-塔格糖能力的L-阿拉伯糖異構酶的突變體酶L20A及其突變方法，屬于生物工程、基因工程和酶工程技術領域。本發明通過基因突變，將來源于解纖維熱酸菌(Acidothermus cellulolytics)ATCC 43068的L-阿拉伯糖異構酶(簡稱L-AI酶)的20位氨基酸Leu替換為Ala，獲得單突變體酶L20A，它的D-塔格糖的生產能力較野生型L-AI酶有顯著提高。
文檔編號C12P19/02GK101768581SQ20101011233
公開日2010年7月7日 申請日期2010年2月20日 優先權日2010年2月20日
發明者江波, 沐萬孟, 程麗芳 申請人:江南大學