專利名稱：魚類哈維氏弧菌pcr快速檢測試劑盒及使用方法
技術領域：
本發明屬于水產動物、海產品及海水污染的監測技術。特別是水產養殖動物的哈維氏弧菌感染的檢測一魚類哈維氏弧菌PCR快速檢測試劑盒及使用方法。
背景技術：
哈維氏弧菌廣泛存在于海洋環境中，是引起水產動物感染致病的主要菌源，能引 起水產動物的皮膚潰爛、肌體出血和大批死亡，危害十分巨大。已有的研究表明，哈維氏弧 菌攜帶的溶血素是水產動物的致病因子即感染致病的根源，對于哈維氏弧菌的檢測方法， 目前主要有生理生化檢測方法、熒光抗體技術、酶聯免疫吸附試驗、rRNA基因探針雜交技術 等。但這些方法存在一些缺點和不足生理生化檢測十分耗時耗力、結果不穩定；熒光抗體 技術需要較昂貴的儀器設備；酶聯免疫吸附實驗靈敏度不高，且易受干擾、rRNA基因在物 種中非常保守，使得技術特異性不強。目前的PCR雖然是一種具有靈敏度高、特異性強的靶 DNA快速檢測方法，樣品中含有少量的致病因子就能檢出。然而，已有的PCR檢測技術方法 較為繁瑣，且對哈維氏弧菌檢測識別率較低。
發明內容
本發明的目的是提供一種魚類哈維氏弧菌的PCR快速檢測試劑盒及使用方法，以 快速檢測和判定或者監測水產動物、海產品及哈維氏弧菌污染的海水，彌補現有技術的不足。研究表明哈維氏弧菌攜帶的溶血素是水產動物感染致病的根源，即本發明所指 的致病因子，快速檢測樣品中的致病因子基因即可判斷水產動物是否感染致病，從而為進 一步為防治感染提供依據。本發明在克隆出哈維氏弧菌致病因子的編碼基因，分析其序列 特征的基礎上，以該特異基因的保守區段設計特異性引物，并且采用PCR快速技術檢測哈 維氏弧菌，具有準確、快速、靈敏等優點。可作為水產養殖魚類疾病的快速、簡便、準確的檢 測方法，也可用作養殖水體、飼料和海產品的質量檢測以及海水污染的監控。本發明的主要原理為裂解液將樣品中的細菌進行裂解，釋放出細菌DNA，加入 PCR反應試劑和Tag酶等，以哈維氏弧菌致病因子的特異DNA片段引物為模板，對樣品中釋 放出的哈維氏弧菌致病因子DNA進行專一性擴增，濃度達到可檢測范圍后進行檢測。由于 設計的特異引物為哈維氏弧菌所特有，因此，樣品中含有的哈維氏弧菌就被會被檢出。本發明的PCR快速檢測試劑盒包括以下7種試劑(1)裂解液含有胰蛋白酶、Tris、EDTA，pH為7. 5-8. 5，其濃度分別為1-lOmg/mL， 10-50mmol/L,l-10mmol/L ；(2) PCR 反應液含 dNTP 和 MgCL2 溶液dATP, dTTP, dCTP和dGTP的四種混合物dNTP，其中每種濃度2. 0-3. Ommol/L ；濃度 為 20-30mmol/L 的 MgCL2 溶液；(3)Taq 酶液3υ/μ L ；
(4)引物對所述的引物對是人工設計并人工合成的DNA片段，堿基序列分別為上游引物5，-GAAAACCAATACATCGCTCTGACT-3，，10-20μ mol/L下游引物5，-TTGACAATTGATTCGTACTTTCTAGC-3，，10-20μ mol/L (5)滅菌去離子水(6)陽性對照(7)陰性對照。本發明使用PCR快速檢測試劑盒檢測哈維氏弧菌的方法，其特征在于檢測程序如 下a.待檢樣品的處理及模板DNA制備待檢樣品經無菌生理鹽水清洗后，取0. 1-0. 2g待檢組織于潔凈的滅菌勻漿器中， 加入0. 5-1. OmLTE緩沖液，充分研磨，取0. 5-1. OmL樣品液于1. 5mL滅菌離心管，用于提取 模板DNA。將上述模板DNA于100°C水浴保持10-15分鐘。冷卻后于4°C 12000rpm離心10 分鐘，吸取上清200 μ L作為PCR模板，并于-20°c保存。海水樣品不需要樣品處理，可直接進入PCR擴增。b. PCR 擴增在一個PCR管內加入1 μ L模板DNA，9 μ LPCR反應液，1 μ L酶液，1 μ L引物，用滅 菌去離子水補足到50 μ L，在3000g離心5秒鐘混勻，置于PCR儀中進行擴增使擴增倍數達 到IO7左右。同樣制作其它待測樣品以及陽性對照和陰性對照品。PCR擴增條件94°C預變性3分鐘，94°C變性1分鐘，58°C退火1分鐘，72°C延伸1 分鐘，如此進行25個循環，然后72°C延伸10分鐘。本發明的PCR快速檢測結果判定方法取10 μ L PCR產物(加2-6 μ L 0. 25-0. 75%澳酚藍上樣緩沖液)加于1. 2-2. 0% 瓊脂糖凝膠中(含有溴化乙錠濃度為0. 5-1. 0 μ g/mL)，100-150V電壓電泳25-30分鐘，取 凝膠在紫外透射儀下觀察。當在622bp出現特異核酸條帶，即可判斷樣品中含有哈維氏弧 菌，反之則沒有。同樣方法可判斷海產品及海水受污染情況。本發明在設計哈維氏弧菌致病因子特異引物并成功建立PCR檢測技術的基礎上， 進一步研制成簡單快速敏感的PCR檢測試劑盒，與現有的哈維氏弧菌病原檢測技術相比， 本發明具有以下顯著特點本發明的PCR快速檢測試劑盒，僅需提供一對針對哈維氏弧菌 DNA的特異引物，即可對樣品中哈維氏弧菌進行檢測或監控，方法簡便、快速、靈敏，而為水 產養殖、海水水質監控以及海產品加工的質量控制提供準確的、標準的、科學的方法。通過 快速檢測樣品中的致病因子基因即可判斷水產動物是否感染致病，從而為進一步防治感染 提供依據。本發明具有的優點如下1.檢測速度快1_3小時即可得到檢測結果，而其它方法需要一天或一周以上；2.檢測靈敏度較高檢測下限為10個/yL致病菌，其它方法須經過細菌培養增 殖后才能進行檢測；3.可以應用于多領域多種類樣品的檢測水產養殖領域水生動物遭受哈維氏弧菌感染情況的檢測，養殖水體被污染情況的監測，養殖飼料和鮮活餌料遭受哈維氏弧菌污 染的品控。環保領域海水受污染情況的監控。食品領域水產品加工過程中時哈維氏弧菌污染的防控。
具體實施例方式本發明的所述魚類哈維氏弧菌PCR快速檢測試劑盒，其中所述PCR試劑的最佳成 分和用量為 實施例11.養殖場病魚及健康魚中哈維氏弧菌的檢測取工廠化海水養殖場發病的牙鲆、大菱鲆、鱸魚及對照健康魚，樣品魚用無菌生理 鹽水清洗，無菌取病變部位組織或正常組織0. lg，加0. 5mL PH為8. 0、濃度為lOmmol/L的 裂解液，勻漿。然后置100°C水浴中保持10分鐘。取出冷卻后于4°C 12000rpm離心10分 鐘，吸取上清1 μ L作為PCR模板，加入最終濃度為2mmol/L的dNTP、20mmol/L的MgCL2溶 液、20 μ mol/L的上下游引物、3U/μ L的Taq酶液以及相應體積的滅菌去離子水，進行PCR 擴增。取10 μ LPCR產物加于1. 5%瓊脂糖凝膠中，IOOv電壓電泳30分鐘，在紫外透射儀 下觀察。在622bp出現特異條帶，此即為樣品中含有哈維氏弧菌。健康魚樣品在622bp無 特異條帶。實施例22.海水中哈維氏弧菌的檢測取工廠化養殖的魚池、蝦池、扇貝育苗池中海水樣品。用無菌海水對樣品進行5倍 稀釋，然后置100°c水浴中保持10分鐘。取出冷卻后于4°C 12000rpm離心10分鐘，吸取上 清1 μ L作為PCR模板，加入最終濃度為2mmol/L的dNTP、20mmol/L的MgCL2溶液、20 μ mol/ L的上下游引物、3υ/μ L的Taq酶液以及相應體積的滅菌去離子水，進行PCR擴增。
取10μ L PCR產物加于1. 5 %瓊脂糖凝膠中，IOOv電壓電泳30分鐘，在紫外透射儀下觀察。在622bp出現特異條帶，表明該樣品中含有哈維氏弧菌，該海水已經被污染。在 622bp無特異條帶出現，表明該海水未被污染。實施例33.海產品中哈維氏弧菌的檢測取超市購買的魚片、烤魚、魷魚絲樣品0. lg，加0. 5mL加0. 5mL PH為8.0、濃度為 10mmol/L的裂解液，勻漿。然后置100°C水浴中保持10分鐘。取出冷卻后于4°C 12000rpm 離心10分鐘，吸取上清1 μ L作為PCR模板，加入最終濃度為2mmol/L的dNTP、20mmol/L的 MgCL2溶液、20 μ mol/L的上下游引物、3U/ μ L的Taq酶液以及相應體積的滅菌去離子水，進 行PCR擴增。取10 μ LPCR產物加于1. 5%瓊脂糖凝膠中，IOOv電壓電泳30分鐘，在紫外透射儀 下觀察。在622bp出現特異條帶，此即為樣品中含有哈維氏弧菌或殘留，衛生不合格或加工 原料不合格。衛生合格海產品樣品在622bp無特異條帶。<110>中國海洋大學<120>魚類哈維氏弧菌PCR快速檢測試劑盒<160>2<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1). . (24)<400>1gaaaaccaat acatcgctct gact24<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1). . (26)<400>2ttgacaattg attcgtactt tctagc2權利要求
一種魚類哈維氏弧菌PCR快速檢測試劑盒，其特征在于包括以下7種試劑(1)裂解液含有胰蛋白酶、Tris、EDTA，pH為7.5-8.5，其濃度分別為1-10mg/mL，10-50mmol/L，1-10mmol/L；(2)PCR反應液含dNTP和MgCL2溶液；dATP，dTTP，dCTP和dGTP的四種混合物dNTP，其中每種濃度2.0-3.0mmol/L；濃度為20-30mmol/L的MgCL2溶液；(3)Taq酶液3U/μL.；(4)引物對上游引物5’-GAAAACCAATACATCGCTCTGACT-3’，10-20μmol/L下游引物5’-TTGACAATTGATTCGTACTTTCTAGC-3’，10-20μmol/L(5)滅菌去離子水(6)陽性對照(7)陰性對照。
2.根據權利要求1所述的魚類哈維氏弧菌PCR快速檢測試劑盒，其特征在于所述PCR 試劑的最佳成分為PCR反應試劑最佳用量__試劑盒試劑組成(25個反應)體積
3.利用上述魚類哈維氏弧菌PCR快速檢測試劑盒檢測哈維氏弧菌的方法，其特征在于 檢測程序如下a.待檢樣品的處理及模板DNA制備待檢樣品經無菌生理鹽水清洗后，取0. 1-0. 2g待檢組織于潔凈的滅菌勻漿器中，加入 0. 5-1. OmL TE緩沖液，充分研磨，取0. 5-1. OmL樣品液于1. 5mL滅菌離心管，用于提取模板 DNA ；將上述模板DNA于100°C水浴保持10-15分鐘，冷卻后于4°C 12000rpm離心10分鐘， 吸取上清200 μ L作為PCR模板，并于_20°C保存； 海水樣品不需要樣品處理，可直接進入PCR擴增；b. PCR擴增在一個PCR管內分別加入1 μ L模板DNA，9 μ LPCR反應液，1 μ L酶液和1 μ L引物，然后 用滅菌去離子水補足到50 μ L，在3000g離心5秒鐘混勻，置于PCR儀中進行擴增使擴增倍 數達到IO7左右；同樣制作其它待測樣品以及陽性對照和陰性對照品；PCR擴增條件94°C預變性3分鐘，并且分別以94°C變性1分鐘，58 °C退火1分鐘和 72°C延伸1分鐘，如此進行25個循環，然后72°C延伸10分鐘。
4.根據權利要求1所述的魚類哈維氏弧菌PCR快速檢測試劑盒，其特征在于PCR快速 檢測結果判定方法取已加入0. 25-0. 75%澳酚藍上樣緩沖液的10 μ L PCR產物，加于含有溴化乙錠濃度 為0. 5-1. 0 μ g/mL的1. 2-2. 0%瓊脂糖凝膠中，在100_150v電壓下電泳25-30分鐘，取電泳 結束后的凝膠在紫外透射儀下觀察，當在622bp出現特異核酸條帶，即可判斷樣品中含有 哈維氏弧菌，反之則沒有。
全文摘要
本發明公開一種魚類哈維氏弧菌PCR快速檢測試劑盒及使用方法。該試劑盒包括7種試劑裂解液、PCR反應液、dNTP混合物、Taq酶液、引物對、陽性對照及陰性對照等。哈維氏弧菌DNA的特異引物對5’-GAAAACCAATACATCGCTCTGACT-3’和5’-TTGACAATTGATTCGTACTTTCTAGC-3’。本發明的突出優點是僅需一對哈維氏弧菌DNA的特異引物，即可對不同樣品中哈維氏弧菌進行檢測或監控，方法簡便、快速、靈敏、應用范圍廣。不但能對養殖魚類疾病進行快速診斷，而且可為海水水質監控以及海產品質量控制提供最簡便方法。
文檔編號C12Q1/68GK101838691SQ201010106108
公開日2010年9月22日 申請日期2010年2月2日 優先權日2010年2月2日
發明者劉瑞, 徐廣峰, 陳吉祥 申請人:中國海洋大學