專利名稱：對蝦肝胰腺細小病毒現場快速高靈敏檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及海洋生物病原檢測技術，具體是對蝦肝胰腺細小病毒對蝦肝胰腺細小病毒Ofepatopancreatic Parvovirus，簡稱HPV)的現場快速高靈敏檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
對蝦肝胰腺細小病毒，又名DNA細小病毒(Parvovirus)，屬細小DNA病毒科 (Parvoviridae)細小DNA病毒屬(Parvovirus)的一種單鏈DNA病毒。HPV可以感染中 國對蟲下(Fenneropenaeus chinensis)、南美白對蟲下(Litopenaeus vannamei)、印度對蟲下 (Fenneropenaeus indieus)、斑節對蟲下(Penaeus mono don)、曰本囊對蟲下(Marsupenaeus japonicus)、墨吉對蟲下(Fenneropenaeus merguiensis)、褐虎對蟲下(browntigerprawn, Penaeus esculentus)、長毛對蟲下(Fenneropenaeus penicillatus)、短溝對蟲下(Penaeus semisulcatus)及藍對蟲下(blue shrimp,Litopenaeusstylirostris)等多種重要經濟對蟲下 及野生對蝦。對蝦感染該病毒之后，一般外觀無明顯特異癥狀，但免疫力、抗逆性會變差，常 會引發二次性細菌感染，或合并斑節對蝦桿狀病毒(Monodon Baculoviru^MBV)、白斑綜合 癥病毒(White Spot是Syndrome Virus, WSSV)感染，進而造成大量死亡，累計死亡率可達 50 90% ；感染該病毒的對蝦也可并隨著蝦體增長，病情減輕；后一種感染會造成種蝦隱 性感染而使種苗繼續帶毒。2009年我們在全國養殖對蝦病毒病流行情況調查中發現，我國 沿海主要對蝦養殖省份都能監測到HPV的存在和流行。所以開發新的技術快速、準確、靈敏 地檢測HPV，加強對蝦苗種和成蝦檢疫以及養殖水體環境的監測，對預防病毒感染，切斷病 毒傳播，保障我國對蝦養殖業的健康持續發展具有重要意義。目前，有關HPV檢測還主要依賴于病理切片法、電鏡觀察法和PCR檢測法。病理切 片法不能直接對病毒進行檢測，只能利用發病的組織病理征兆進行檢測，并且還局限于在 實驗室內進行；電子顯微鏡技術雖然可以直接觀察到病毒粒子的存在，但其操作復雜、耗費 時間長、準確性低；HPV的PCR檢測法，雖然克服了前面幾種方法的缺點，在實驗室條件下能 實現對HPV的相對快速、準確檢測，但由于常規的PCR檢測需要昂貴的PCR儀、凝膠電泳和 成像系統，使得PCR檢測法難以用于現場的快速檢測，這大大限制了 PCR檢測方法在現場生 產中的推廣應用。
發明內容
本發明的目的是要提供一種適于生產現場應用、快速、高靈敏度且易操作的對蝦 肝胰腺細小病毒檢測方法，并將檢測方法標準化，同時將檢測試劑集中于規范的試劑盒中， 以克服現有技術的不足，使HPV的檢測更準確、靈敏、快速、安全和方便。首先，本發明利用針對HPV結構蛋白基因中保守區段設計的4條特異引物和一種 具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒定溫度下對目的核酸進行擴增，實現對HPV的快速和高靈敏檢測。為了進一步縮短檢測時間、消除檢測過程中可能發生的污染、簡化檢測步驟，使 檢測實驗能夠在生產現場開展，本發明對HPV的實驗室檢測方法進行了優化。在用FTA卡 片制備樣品核酸的標準步驟中，需要將被樣品勻漿液潤濕的FTA膜片在室溫下干燥至少一 個小時，然后才能進行漂洗；本發明通過在被樣品勻漿液潤濕的FTA膜片上滴加親水性且 易揮發的醇類物質(主要是叔醇、伯醇和仲醇)，使潤濕的FTA膜片在室溫條件下只需10分 鐘即可完成干燥過程，大大縮短了樣品核酸制備的時間。在利用等溫擴增方法檢測病原時， 目前普遍采用擴增反應結束后向反應管中添加核酸染料以判斷檢測結果的方法；由于等溫 擴增反應的產物量非常大，這種打開反應管再添加核酸染料的方法極易導致后續待檢樣品 被污染而使檢測結果出現假陽性；有報道和專利采用在擴增反應試劑中添加尿嘧啶DNA糖 基化酶(UNG酶)的方法消除污染風險，但卻增加了成本；本發明先將核酸染料粘附到擴增 反應管的內側上方或蓋子內側，等擴增反應結束后再通過上下反復震蕩使擴增反應液和核 酸染料混合，這樣不打開擴增反應管就能完成擴增產物的染色，消除了打開擴增反應管再 添加核酸染料過程中反應液可能濺出造成后續樣品被污染的風險。在用FTA卡片制備樣品 核酸的標準步驟中，需要用Whatman公司(英國)專門的純化試劑反復漂洗FTA膜片；本發明無需專門的純化試劑，采用普通的蒸餾水漂洗即可完成FTA膜片的純化， 這樣不僅簡化了檢測實驗的操作步驟，還降低了成本。為了使該方法在生產現場更具實用 性，本發明在上述優化的基礎上，將檢測HPV病毒所需的試劑與器材進行了組裝，使之標準 化、配套化，形成了檢測試劑盒。本發明的檢測試劑盒包括 (1)采樣管，用來盛放、研磨待檢樣品；(2)漂洗管，內裝蒸餾水；(3)核酸變性管，內裝TE緩沖液；(4)擴增檢測管，內裝擴增反應液和核酸染料，擴增反應液組成成分如下擴增引 物 HPV-Fl 和 HPV-Bl 各 1 2 μ M，擴增引物 HPV-F2 和 HPV-B2 各 0. 1 0. 4 μ M，dATP、dTTP、 dGTP 和 dCTP 各 0. 8 2. 0mM，MgCl24 10mM，Betaine (甜菜堿)0. 6 1. 2M, Tris-HCl 10 40mM, KCl 10 20mM，MgSO4I 4mM，(NH4) 2S046 12mM，Triton X-1000. 05 % 1· 0 %，具 有鏈置換活性的DNA聚合酶2 20U ；核酸染料為分子生物學研究中常用的核酸染料，包括 但不限于 SYBR Green、GelRed、GelGreen、GoldViewTM、GeneFinder 等；且核酸染料預先粘 附于擴增檢測管管壁內側上方或擴增檢測管蓋子內側；(5)陰性對照管，內裝無對蝦肝胰腺細小病毒核酸的FTA膜片；(6)陽性對照管，內裝吸附了對蝦肝胰腺細小病毒核酸的FTA膜片；(7)快速干燥液，為親水性且易揮發的醇類物質；(S)FTA膜片、研磨棒、牙簽和吸管分別封裝于無菌袋中；(9)包裝盒，內裝一塊有多個小孔的泡沫板或海綿塊；(10)使用說明書。上述試劑盒中所述的擴增引物是根據HPV結構蛋白基因保守區序列設計的，其核 苷酸序列如下上游引物1 5 ‘ -GCGTATGCTTGTACTAATTCTGCTATTTTGATGGAGTAAGAGCAGCAAAC下游引物1 5 ‘ -GGATTTTCAGACAGCACAGAAATAGTFTTATTCTGTCCTTCTTCTTGGA
上游引物 2 5 ‘ -ACAAAGTACAAACAGAGGAGAA下游引物2 5 ‘ -AATGCAATCTCAATAGCCAAT。用本發明的試劑盒檢測對蝦HPV的方法，按下列步驟進行(1)取樣品對蝦組織約0. 02 1. Og置于采樣管中，用研磨棒將樣品對蝦組織磨碎 至漿狀；(2)用研磨棒蘸取漿狀的樣品對蝦組織將FTA膜片充分潤濕；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，靜置10 20min ；(4)用牙簽將上述FTA膜片轉移到漂洗管內，震蕩漂洗管3 5min以洗滌FTA膜片；(5)用牙簽將上述漂洗管內的FTA膜片轉移到核酸變性管內，95°C保溫3 6min， 讓DNA雙鏈充分解鏈，然后再迅速置于室溫條件下2 5min，使FTA膜片上的核酸DNA保持 兩條單鏈狀態；(6)再用牙簽將上述核酸變性管內的FTA膜片轉移到擴增檢測管內，將擴增檢測 管置于55 65°C條件下保溫40 70min ；(7)將擴增檢測管上下反復甩動l-3min，使擴增反應液與粘附于擴增檢測管管壁 或管蓋上的核酸染料充分混勻；(8)用力向下甩動擴增檢測管，使管內混有核酸染料的擴增反應液集聚于擴增檢 測管底部，用眼睛觀察反應液，如果反應液呈現綠色則表示該樣品的HPV檢測結果為陽性， 如果反應液呈現橙黃色則表示該樣品的HPV檢測結果為陰性。在上述步驟中，從第(4)步開始應將作為陰性對照的無對蝦肝胰腺細小病毒核酸 的FTA膜片、作為陽性對照的吸附了對蝦肝胰腺細小病毒核酸的FTA膜片，以及吸附了樣品 核酸的FTA膜片一起處理，直至完成檢測反應。本發明的積極效果在于在試劑盒中匯集HPV現場快速檢測所需的FTA膜片、TE 緩沖液、擴增反應液、核酸染料等試劑和研磨棒、牙簽、吸管等器材，使得HPV的檢測能夠快 速有序地進行，實現了檢測過程的程序化和標準化，使得操作規范、不易出錯；本發明依據 優選的HPV結構蛋白基因保守區序列所設計的擴增引物不僅能有效檢測HPV的所有毒株， 而且與其他桿狀病毒的多角體蛋白基因無同源性，檢測特異性非常好；采用醇類物質對取 樣后的FTA膜片進行快速干燥處理，使得樣品核酸的制備時間大大縮短；采用內置核酸染 料，在反應結束后不用打開反應管即可直接對反應液進行染色，避免了打開反應管再添加 核酸染料使后續待檢樣品被擴增產物污染而造成假陽性的結果，從而大大提高了可靠性。 使用本發明在1. 5 2小時內就可完成對蝦HPV的檢測，檢測過程無需昂貴的儀器設備如 離心機、PCR儀和凝膠成像系統，僅需水浴鍋或金屬浴甚至更簡單的保溫裝置即可；而且檢 測結果非常容易判別；與對蝦HPV已有檢測技術相比，本發明的檢測方法成本非常低，整個 過程不涉及有毒試劑，對操作人員和環境都非常安全，并且檢測靈敏度極高，可以替代對蝦 肝胰腺細小病毒之前的相關檢測方法如病理切片法、電鏡觀察法、抗體檢測法和PCR檢測 法；本發明的檢測試劑盒不僅可在實驗室使用，也可在野外生產現場使用，對加強HPV的流 行病學監測和疾病防控意義重大，具有很高的推廣應用價值。
具體實施方式
以下通過實施例對本發明作進一步說明。
實施例1 對蝦肝胰腺細小病毒現場快速高靈敏檢測試劑盒本發明的試劑盒由以下部件組成(可檢測4個樣品的包裝)(1)采樣管，4個，用來盛放、研磨待檢樣品；
(2)漂洗管，6個，每個管內裝有Iml的蒸餾水；(3)核酸變性管，6個，每個管內裝有20μ L的TE緩沖液(含IOmM Tris-HCl和 ImM EDTA,ρΗ8· 0)；(4)擴增檢測管，6個，每個管內裝有25 μ L擴增反應液和IyL的核酸染料，擴增 反應液組成成分如下擴增引物的上游引物1和下游引物1各1. 6 μ Μ，擴增引物的上游引 物 2 和下游引物 2 各 0. 2 μ M，dATP、dTFP、dGTP 和 dCTP 各 1. 4mM, MgCl28mM, Betaine (甜菜 堿)1· 2M, Tris-HCl 20mM, KCllOmM, MgS042mM, (NH4)2SO4IOmM, TritonX-1000. 1%, Bst DNA 聚合酶8U ；核酸染料成分為稀釋10倍的GeneFinder ，且核酸染料粘附固定于擴增檢測管 的管蓋內側。(5)陰性對照管，1個，內裝無對蝦肝胰腺細小病毒核酸的FTA膜片；(6)陽性對照管，1個，內裝吸附了對蝦肝胰腺細小病毒核酸的FTA膜片；(7)快速干燥液，1管，內裝500 μ L無水乙醇；(S)FTA膜片(4片)、研磨棒(4個)、牙簽(6個)和吸管(1個)分別封裝于無菌 袋中；(9)包裝盒(1個)，內裝一塊有多個小孔的海綿塊，海綿塊上有小孔4X6個；(10)使用說明書，1份。實施例2本發明的對蝦肝胰腺細小病毒等溫擴增檢測方法使用實施例1中的檢測試劑盒，按下列步驟進行(1)取樣品對蝦組織約0. Ig置于采樣管中，用研磨棒快速將樣品磨碎至漿狀；(2)用研磨棒蘸取漿狀的樣品將FTA膜片充分潤濕；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，將FTA膜片室溫靜置IOmin ；(4)用牙簽將上述FTA膜片轉移到漂洗管內，將漂洗管劇烈震蕩3min ；(5)用牙簽將上述漂洗管內的FTA膜片轉移到核酸變性管內，95°C保溫3min，讓 DNA雙鏈充分解鏈，然后再迅速置于室溫條件下2min，目的是使核酸DNA保持呈兩條單鏈狀 態；(6)再用牙簽將上述核酸變性管內的FTA膜片轉移到擴增檢測管內，將擴增檢測 管置于58°C條件下保溫60min ；(7)將擴增檢測管上下反復甩動2min，使擴增反應液與管蓋上的核酸染料充分混 勻；(8)然后用力向下甩動擴增檢測管，使管內混有核酸染料的擴增反應液聚于擴增 檢測管底部，用眼睛觀察擴增反應液，如果呈現綠色則表示該樣品的HPV檢測結果為陽性， 如果呈現橙黃色則表示該樣品的HPV檢測結果為陰性。在上述步驟中從第4步開始，應將無對蝦肝胰腺細小病毒核酸的FTA膜片、吸附了 對蝦肝胰腺細小病毒核酸的FTA膜片和吸附了樣品核酸的FTA膜片一起處理，直至完成檢 測反應，分別用作檢測的陰性和陽性對照。本發明中所述的FTA膜片是英國Whatman公司用來制備核酸的FTA卡片；將FTA卡片裁切成長X寬不小于1毫米Xl毫米的紙片或打孔成直徑不小于1毫米的紙片即可 制成FTA膜片。本發明使用的試劑和材料引物由上海生物工程有限責任公司合成；乙二胺四乙 酸二鈉、三羥甲基氨基甲烷、dNTP、甜菜堿(Betaine)、dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP、KCl、MgSO4、 (NH4)2SO4, MgCl2, TritonX-IOO購自上海生物工程有限責任公司；等溫擴增用的BstDNA聚 合酶等購自NEB公司；核酸染料GeneFinder 購自廈門百維信生物科技有限公司。<110>中國水產科學研究院黃海水產研究所<120>對蝦肝胰腺細小病毒現場快速高靈敏檢測試劑盒及檢測方法<160>4<210>1<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據對蝦肝胰腺細小病毒結構蛋白基因序列和等溫擴增引物設計要求而設 計，用作對蝦肝胰腺細小病毒等溫擴增檢測的上游引物1<400>1gcgtatgctt gtactaattc tgctattttg aggtagtaag agcagcaaac 50<210>2<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據對蝦肝胰腺細小病毒結構蛋白基因序列和等溫擴增引物設計要求而設 計，用作對蝦肝胰腺細小病毒等溫擴增檢測的下游引物1<400>2ggattttcag acagcacaga aatagtttta ttctgtcctt cttcttgga 49<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據對蝦肝胰腺細小病毒結構蛋白基因序列和等溫擴增引物設計要求而設 計，用作對蝦肝胰腺細小病毒等溫擴增檢測的上游引物2<400>3acaaagtaca aacagaggag aa 22<210>4<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據對蝦肝胰腺細小病毒結構蛋白基因序列和等溫擴增引物設計要求而設計，用作對蝦肝胰腺細小病毒等溫擴增檢測的下游引物2<400>4aatgcaatct caatagccaa t 2權利要求
一種對蝦肝胰腺細小病毒現場快速高靈敏檢測試劑盒，其特征是該檢測試劑盒包括(1)采樣管，用來盛放、研磨待檢樣品；(2)漂洗管，內裝蒸餾水；(3)核酸變性管，內裝TE緩沖液；(4)擴增檢測管，內裝擴增反應液和核酸染料；(5)陰性對照管，內裝無對蝦肝胰腺細小病毒核酸的FTA膜片；(6)陽性對照管，內裝吸附了對蝦肝胰腺細小病毒核酸的FTA膜片；(7)快速干燥液；(8)FTA膜片、研磨棒、牙簽和吸管；(9)包裝盒，內裝一塊有多個小孔的泡沫板或海綿塊；(10)使用說明書。
2.如權利要求1所述的檢測試劑盒，其中所述的核酸染料為分子生物學中應用的核酸 染料，包括但不限于 SYBR Green、GelRed, GelGreen, GoldView 或 GeneFinder 。
3.如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的快速干燥液是親水性且易揮發 的醇類物質。
4.如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于上述擴增檢測管內的核酸染料粘附于 擴增檢測管的管壁內側上方或擴增檢測管的管蓋內側。
5.如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的FTA膜片為英國Whatman公司 用來制備核酸的FTA卡片。
6 如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于上述的擴增反應液由以下組份組成 擴增引物的上游引物1和下游引物1各1 2μΜ，擴增引物的上游引物2和下游引物2各0.1 0. 4 μ M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 0. 8 2. OmM, MgCl24 IOmM,甜菜堿 0. 6 1.2M, Tris-HCl 10 40mM，KCl 10 20mM，MgSO4I 4mM，(NH4) 2S046 12mM，Triton X-1000. 05% 1. 0%，具有鏈置換活性的DNA聚合酶2 20U。
7.如權利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于擴增反應液中擴增引物的核酸序列如下上游引物 1 5 ‘ -GCGTATGCTTGTACTAATTCTGCTATTTTGAGGTAGTAAGAGCAGCAAAC 下游引物 1 5 ‘ -GGATTTTCAGACAGCACAGAAATAGTTTTATTCTGTCCTTCTTCTTGGA 上游引物 2 5 ‘ -ACAAAGTACAAACAGAGGAGAA 下游引物 2 5 ‘ -AATGCAATCTCAATAGCCAAT。
8.使用權利要求1所述檢測試劑盒檢測對蝦肝胰腺細小病毒的方法，其特征在于該方 法包括下列步驟(1)取樣品對蝦組織約0.02 1. Og置于采樣管中，用研磨棒將樣品磨碎至漿狀；(2)用研磨棒蘸取漿狀的樣品將FTA膜片充分潤濕；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，靜置10 20min；(4)用牙簽將上述FTA膜片轉移到漂洗管內，震蕩漂洗管3 5min以洗滌FTA膜片；(5)用牙簽將上述漂洗管內的FTA膜片轉移到核酸變性管內，95°C變性3 6min，然后 再置于室溫條件下2 5min ；(6)再用牙簽將上述核酸變性管內的FTA膜片轉移到擴增檢測管內，將擴增檢測管置 于55 65 °C條件下保溫40 70min ；(7)將上述擴增檢測管上下反復甩動l-3min，使反應液與粘附于擴增檢測管管壁或管蓋上的核酸染料充分混勻；(8)向下甩動擴增檢測管，使管內混有核酸染料的擴增反應液集聚于擴增檢測管底部， 直接觀察擴增反應液顏色，如果擴增反應液呈現綠色則表示該樣品的對蝦肝胰腺細小病毒 檢測結果為陽性，如果擴增反應液呈現橙黃色則表示該樣品的對蝦肝胰腺細小病毒檢測結 果為陰性。
全文摘要
本發明涉及一種對蝦肝胰腺細小病毒現場快速高靈敏檢測試劑盒及檢測方法。本發明的檢測試劑盒包括采樣管、內裝蒸餾水的漂洗管、內裝TE緩沖液的核酸變性管、內裝擴增反應液和核酸染料的擴增檢測管、陰性對照管、陽性對照管、FTA膜片及其快速干燥液等。本發明的檢測方法具有比PCR檢測方法更高的特異性、靈敏性和便捷性，并且成本低，使用方便，檢測更準確、快速、靈敏度極高，且對人和環境都非常安全，可以替代已有的相關檢測方法如病理切片法、電鏡觀察法和PCR檢測法。本發明的檢測試劑盒和檢測方法不僅可在室內的實驗室使用，也可在野外的生產現場使用，對加強對蝦肝胰腺細小病毒的流行病學監測和疾病防控意義重大，具有很高的推廣應用價值。
文檔編號C12Q1/68GK101838707SQ20101010610
公開日2010年9月22日 申請日期2010年2月2日 優先權日2010年2月2日
發明者張慶利, 張錚, 黃倢 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所