一種蔗糖異構酶基因及其高效表達方法

專利名稱：一種蔗糖異構酶基因及其高效表達方法
技術領域：
本發明屬于基因工程和酶工程領域，具體涉及一種蔗糖異構酶基因及其高效表達 方法。
背景技術：
蔗糖異構酶(Sucrose isomerase，簡稱SIase)是生產功能性甜味劑異麥芽酮糖 (醇)和海藻酮糖的關鍵酶。異麥芽酮糖醇是近年來新興的一種功能性糖醇，它是由異麥芽 酮糖經鎳催化加氫制得。它除了具有一般糖醇的共同特點外，還具有木糖醇和麥芽糖醇等 功能糖醇無法比擬的極低的吸濕性和純正的口感。由于其獨特的性能，受到了食品界制取 無糖甜食品的歡迎，特別是近年來，隨著人們對自身健康的重視，異麥芽酮糖醇的生產和開 發利用受到了廣泛關注。在歐洲上市不到5年，銷售量已經達到10萬噸以上，國內市場剛 剛起步，預計其需求量年增長率在10%以上。目前國內外生產異麥芽酮糖普遍采用SIase催化蔗糖而進行的。該反應可 以同時生成異麥芽酮糖和海藻酮糖兩種同分異構體，根據主產物的不同分為異麥芽 酮糖主產型和海藻酮糖主產型。所報道的SIase生產菌種中，大黃歐文菌(Erwinia rhapontici)，沙雷氏菌(serratia ρlymuthica),克雷伯氏菌(Klebsiella sp. LX-3) 和多源發散菌(Pantoeadi spera)可以生成70 85 %的異麥芽酮糖，而嗜中酸性 假單胞菌(Pseudomonasmesoacidophila MX-45),放身寸性 土 壤桿菌(Agrobacterium radiobacterMX-232)生成90%以上的海藻酮糖。目前，許多SIase酶已經得到了純化，相應SIase的編碼基因得到了克隆。由于分 泌SIase的野生菌株的生產能力普遍較低，為了克服野生菌的低生產能力，采用基因工程 菌高效表達SIase引起了人們極大的興趣。在國內，SIase的克隆與表達迄今為止鮮有報 道，國內有限的研究仍主要致力于提高原始菌株的酶產量。因此構建高效的基因工程菌是 降低SIase生產成本的關鍵。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種優質的蔗糖異構酶基因。本發明還要解決的技術問題是提供上述蔗糖異構酶基因所編碼的蛋白質。本發明還要解決的技術問題是提供包含上述蔗糖異構酶基因的表達載體。本發明還要解決的技術問題是提供包含上述表達載體的重組大腸桿菌。本發明還要解決的技術問題是提供利用上述重組大腸桿菌高效表達蔗糖異構酶 基因的方法。本發明還要解決的技術問題是提供上述重組大腸桿菌的應用。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下一種蔗糖異構酶基因(即pal I基因)，其核苷酸序列如SEQ ID NO=I所示。該 基因是從大黃歐文菌(Erwinia rhapontici) NX-5 (CGMCC NO 2222) (200710190755. 2)中提
3取獲得，共1803bp。一種權利要求1所述基因的編碼蛋白質(即蔗糖異構酶，縮寫Slase)，其氨基酸序 列如SEQ ID NO 2所示，共601個氨基酸。一種表達載體，包含如SEQ ID NO 1所示的蔗糖異構酶基因。上述表達載體，優選為重組表達載體pET22b (+)。一種重組大腸桿菌，包含如SEQ ID NO 1所示的蔗糖異構酶基因。上述重組大腸桿菌，優選為包含有重組質粒pal I/pET22b⑴的E. coli BL21(DE3)。利用上述重組大腸桿菌細胞高效表達pal I基因的方法，即上述重組大腸桿菌細 胞自誘導產酶的方法，是以糖蜜水解液為誘導劑誘導培養重組大腸桿菌產酶。糖蜜水解液 即作為碳源又作為誘導劑。利用上述重組大腸桿菌細胞高效表達pal I基因的方法，具體為將重組大腸桿 菌在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養基中30 40°C液體培養8 20h，轉接至發酵培 養基培養5 7h后降溫至25 30°C再誘導培養6 12h ；所述的發酵培養基為糖蜜水 解液 10 50mL/L, (NH4)2SO4 5 10g/L, NaCl 5 10g/L, KH2PO4 1 3g/L, MgSO4 0. 1 lg/L。上述宿主細胞自誘導產酶的方法優選為將重組大腸桿菌細胞在含有50 μ g/mL 氨芐青霉素的LB培養基中37°C液體培養12h，轉接至發酵培養基培養5 7h后降溫至 25 30°C再誘導培養6 IOh ；所述的發酵培養基為糖蜜水解液40mL/L(50g糖蜜溶解于 IOOmL水中，調pH至1. 8，90°C酸水解3h，KOH回調pH至7. 0制得糖蜜水解液)，(NH4)2S04 8g/L, NaCl 10g/L, KH2PO4 2g/L, MgSO4 0.5g/L。本發明所述的糖蜜按如下方法制備對于每IOOmL水，加入20 80g糖蜜溶解，在 酸性條件下80 100°C水解1 5h，水解結束后加堿調至中性，即為糖蜜水解液。具體來 說，對于每IOOmL水，加入20 80g糖蜜溶解，混勻后離心去除不溶物，室溫下用鹽酸調pH 值至1 3左右，于80 100°C水解1 5h，水解結束后用濃堿回調pH至7. 0，即為糖蜜水 解液。糖蜜主要成分蔗糖水解為等摩爾的葡萄糖和果糖，少量(1-2% )棉子糖水解為等摩 爾的半乳糖、葡萄糖和果糖。常規的誘導方法是將含有質粒pal I/pET22b(+)的Ε. coli BL21(DE3)，在含 有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養基中37°C液體培養過夜，轉接一次，37°C液體培養至 OD達0.5 0.8后用終濃度為0.2 l.Ommol/L的異丙基硫代-β _D_半乳糖苷(或 0. 2-1. Ommol/L乳糖)在25 30°C條件下誘導10 20h，產SIase酶活為10 15U/mL。通過本發明自誘導產酶的方法(即pal I基因高效表達方法)，重組大腸桿菌產 SIase酶達20 30U/mL。而以常規誘導方法即以外加異丙基硫代_ β -D-半乳糖苷或乳糖 為誘導劑，則宿主細胞產SIase酶活為10 15U/mL。上述宿主細胞在發酵生產異麥芽酮糖中的應用。具體為將游離的或固定化后 的宿主細胞填充至反應罐中，加入450 600g/L的蔗糖溶液，進行酶轉化反應，反應溫度 25 35°C，轉化時間2 IOh ；或者將固定化后的宿主細胞裝入填充床式柱反應器中，該反 應器以0. 5 5mL/min的流速單向流加或循環連續流加400 600g/L的蔗糖溶液，進行酶 轉化反應，反應溫度25 35°C，每批轉化時間2 10h。
有益效果本發明方法與現有技術相比具有如下優勢1、本發明提供了 pal I基因的高效表達方法。以質粒pET22b(+)為表達載體，以 E. coli BL21(DE3)為表達宿主，可實現pal I的高效表達，發酵液酶活達20U/mL以上，而野 生菌(Erwinia rhaponticiNX-5)的發酵液酶活僅為1. 3U/mL，重組酶具有轉化蔗糖生成異 麥芽酮糖的能力。2、本發明提供了一種適合于重組大腸桿菌(含pET系統)的以糖蜜水解液為碳 源的自誘導產酶體系，糖蜜經酸水解后，主要成分為葡萄糖和果糖，可以作為菌體生長的 碳源，糖蜜中還含有少量的棉子糖(1-2% )，經酸水解后分解為等量的半乳糖、葡萄糖和果 糖，其中的半乳糖可充當PET系統中T7啟動子的誘導劑，該體系免去了昂貴的誘導劑(異 丙基硫代-β-D-半乳糖苷，IPTG)的加入環節，誘導時間短，使用方便廉價。


圖1用于生產重組SIase的pal I/pET22b (+)示意圖。圖2SIase純化過程電泳圖。其中1 標準蛋白，2 重組菌超聲破碎后的上清液，3 經過Ni親合層析后的SIase。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的具體的物料配比、實驗操作條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不 會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1 大黃歐文菌(Erwinia rhapontici)NX-5總DNA的提取。E. rhapontici NX-5 菌株(CCTCC NO 2222)在 SB液體培養基(蛋白胨 10g/L，酵母 膏5g/L，NaCl 10g/L)中培養12h，SOOOr/min離心收集菌體，無菌水洗滌，收集沉淀懸浮于 500 μ L Tris-EDTA(三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)緩沖液，加入5 μ LRNA酶，37°C下 保溫30min，加入30 μ L 10% SDS (十二烷基硫酸鈉)和15 μ L蛋白酶K，37°C下保溫60min， 加入100 μ L 5Μ的NaCl溶液和80 μ L CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)，65°C下保溫20min， 用700 μ L的酚氯仿異戊醇體積比25 24 1混合溶液抽提，10000r/min離心，上 清液用700 μ L的氯仿異戊醇體積比24 1混合溶劑抽提，10000r/min離心，上清液與 1400 μ L的冰異戊醇混合，_20°C沉淀30min，10000r/min離心，沉淀加200 μ L 70%乙醇清 洗，10000r/min離心，沉淀用Tris-EDTA緩沖液溶解，即得到Erwinia rhapontici NX-5總 DNA。實施例2 =SIase編碼基因的克隆。以實施例1得到的E. rhapontici NX-5總DNA為模板，以下列核苷酸序列作為引 物引物 1 :TTAAGCTT CCATGGATTCTCAAGGATT，分別弓丨入 HindIII、Nco I 酶切位點(下 劃線部分)。引物 2 GTAAATATTTGAATTAGGCGAGCTC CCTAGGTT，分別引入 BamH I 和 Xho I 雙酶 切位點(下劃線部分)。PCR 反應在 20 μ L 體系中進行10XPCR 緩沖液 2 μ L、2. 5mmol/LdNTP 2 μ L、ΙΟμ θΙ/L 弓ι物 1 禾口弓ι物 2 各 2μ L、模板 DNA 2 μ L、25mmol/LMgCl2 2 μ L、TaqDNA 聚合酶 1 μ L，補加雙蒸水至20 μ L0PCR 反應條件95°C變性 3min，后開始循環，(94°C 30s ；45°C 30s ；72°C 2min ； 72°C 5min)，共25次循環，擴增得到1800bp的PCR片段，切膠回收，回收片段經HindIII和 BamH I雙酶切，采用DNA片段純化試劑盒純化，與經同樣雙酶切的pUC18載體連接。轉化 至E. coli DH5 α，轉化產物涂布含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB平板，經37 °C培養過夜，平 板上長了約30個菌落，挑選陽性轉化子，接入LB液體培養基，IOh后提取質粒并進行酶切 驗證后測序。結果表明插入片段含有一個長1803bp (如SEQ ID N0:1所示)的開放閱讀框 (ORF)，編碼一個由601個氨基酸編碼的蛋白質(如SEQ ID NO 2所示)。實施例3 :pal I基因在表達載體上的構建。用于構建表達載體的質粒是pET22b(+)，帶有pelB信號肽和His-tag標記。將 pET22b(+)質粒和pal I基因進行Xho I和Nco I雙酶切，切膠回收pal I后經T4連接 酶16°C連接過夜，連接產物轉化E. coli BL21(DE3)感受態細胞，經37°C培養過夜，挑選 轉化子于100 μ g/mL氨芐青霉素的LB進行液體培養，然后抽提質粒，得到富集的pal I/ pET22b (+)質粒(圖 1)。實施例4 大腸桿菌宿主轉化。E. coli BL21(DE3)宿主菌在LB液體培養基中培養12h，按5%的接種量轉移至 新鮮的LB液體培養基中，37度培養2h，取ImL培養液加入1. 5ml離心管中，5000r/min離 心5min(4°C )，傾去上清液加入用冰遇冷的0. lmol/L CaCl2500 μ L振蕩混勻，低溫離心 5min(5000r/min)，傾去上清，再加CaCl2500 μ L振蕩混勻，低溫離心5min (5000r/min)，收 集菌體加200 μ 1 CaCl2混勻，分裝成兩管(IOOyL)，制成感受態細胞。吸取5 μ Lpal I/ pET22b (+)，加入100 μ L感受態細胞溶液中，冰浴30min，42°C水浴90s，迅速將離心管轉移 至冰浴中，使細胞冷卻l-2min，然后加入Iml LB培養基，37°C培養45min后，吸取200 μ L已 轉化的感受態細胞轉移至含氨芐抗性的LB平板上，37°C培養24-36h。挑選轉化子進行酶切 鑒定。實施例5 含pal I/pET22b (+)的Ε. coli BL21 (DE3)經常規方法誘導產酶。將含有質粒pal I/pET22b(+)的 Ε. coli BL21 (DE3)，在氨芐青霉素(100 μ g/mL) LB平板上經37°C培養過夜，挑選轉化子(含pal I/pET22b (+)的Ε. coli BL21 (DE3))在LB 液體培養基中37°C培養過夜，后轉接至LB發酵培養基中37°C培養至OD 0. 6后用終濃度為 0. 8mmol/L的IPTG (異丙基硫代-β -D-半乳糖苷)在20°C條件下誘導14h，SIase酶活力 為10U/mL ；或采用0. 5mmol/L乳糖，在24°C條件下誘導12h，SIase酶活力為12U/mL。酶活 的檢測方法為取經誘導表達后的細胞培養液lmL，8000r/min離心5min收集菌體，生理鹽 水洗滌一遍，用200 μ 1磷酸鉀緩沖液(ρΗ 5.8,0. 025mmol/L)重懸，加入800 μ L蔗糖溶液 (500g/L)作為底物，30°C下轉化lh，100°C沸水浴IOmin終止反應，12000r/min離心lOmin， 取上清，使用高效液相色譜測定異麥芽酮糖在產物中的含量，(HPLC條件Agilentl200型 HPLC系統，ShodexRlOl示差折光檢測器，色譜柱Rezex RCM-Monosaccharide Ca2+柱，流動 相為純水，流速0. 5ml/min，柱溫80°C )以30°C條件下ImL培養液中的細胞每分鐘催化蔗糖 生成1 μ mol異麥芽酮糖為1個酶活單位(U)，以下相同。實施例6 糖蜜水解液的制備方法。
稱取50g糖蜜溶解于IOOml蒸餾水中，混勻后于8000r/min離心20min，去除不溶 物，室溫下用37% (ν/ν)的鹽酸調ρΗ值至1.8左右，于90°C水解3h，水解結束后用5mol/ LKOH回調ρΗ至7. 0，即為糖蜜水解液。糖蜜主要成分蔗糖水解為等摩爾的葡萄糖和果糖， 少量(1-2% )棉子糖水解為等摩爾的半乳糖、葡萄糖和果糖。糖蜜水解液具體成分葡萄 糖18 20% (即IOOg糖蜜中含18 20g葡萄糖，以下定義相同)，果糖23 25%，半乳 糖0. 4 0. 6%，檢測方法HPLC法，具體條件同實施例5。實施例7 含pal I/pET22b⑴的E. coli BL21 (DE3)以糖蜜水解液為碳源，形成 SIase的自誘導表達體系。將含有質粒palI/pET22b(+)的 Ε. coli BL21(DE3)，在含有 50μ g/mL氨芐青霉素 的LB培養基中37°C液體培養過夜，轉接至發酵培養基(糖蜜水解液40mL/L，(NH4)2SO4Sg/ L，NaCl 10g/L,KH2PO4 2g/L,MgSO4 0. 5g/L，自然 ρΗ)，培養 5_7h 后降溫至 25°C誘導培養，8h 產 SIase 酶達 23U/mL。實施例8 SIase的純化和特性。將上述SIase發酵液于4°C、lOOOOr/min離心20min收集菌體，生理鹽水洗滌一 遍，重新懸浮于緩沖液中，冰浴條件下超聲破碎菌體(400W，20min)。緩沖液組成為25mmol/ L磷酸鈉(ρΗ = 5. 8)，超聲后離心(10000r/min, 40min)，取上清液，得SIase粗酶液。Ni親 和柱用緩沖液A(25mmol/L的磷酸鈉緩沖液，ρΗ 5. 8)平衡后，將上樣樣品吸入Ni柱，使之完 全吸附后，分別用緩沖液A、含20mmol/L咪唑的緩沖液A、含250mmol/L咪唑的緩沖液A洗 脫，流速lmL/min，檢測波長為280nm，收集SIase酶活洗脫液液，活力組分在pH5. 8、25mmol/ L磷酸鈉緩沖液中透析過夜后，得純化SIase酶制品。純化過程電泳圖見圖2。實施例9:按實施例6所述方法，將成功表達SIase基因的E. coli BL21 (DE3)細胞收集， 25mM的磷酸鈉緩沖液(pH5. 8)洗滌兩次，離心收集進行游離細胞轉化，稱取IOg的細胞加 入500mL 500g/L的蔗糖溶液中，在30°C的條件下，于搖瓶中振蕩轉化生產異麥芽酮糖，反 應時間2h，反應中止后測底物轉化率和產物濃度。蔗糖轉化率為99. 5%，異麥芽酮糖轉化 率達90%。對比例1 斜面培養基蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaC15g/L，瓊脂20g/L，pH7. 0。搖瓶培養基蔗糖50g/L，酵母膏 10g/L，Na2HPO4. 12H20 5g/L，pH7. 0。把大黃歐文氏菌NX-5CGMCC No. 2222在斜面培養基上30°C培養24h，然后接一環 此菌于搖瓶培養基中，30°C培養10h，搖瓶轉速200r/min，得到的發酵液中菌體的含量為 20g/L，產酶達2. 5 5. 0U/ml，以游離細胞轉化，稱取IOg的細胞加入500mL 500g/L的蔗糖 溶液中，在30°C的條件下，于搖瓶中振蕩轉化生產異麥芽酮糖，反應時間20h，反應中止后 測底物轉化率和產物濃度。蔗糖轉化率為90 %，異麥芽酮糖轉化率達80 %。
權利要求
一種蔗糖異構酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.—種權利要求1所述基因的編碼蛋白質，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.—種表達載體，其特征在于包含權利要求1所述的蔗糖異構酶基因。
4.根據權利要求3所述的表達載體，其特征在于所述表達載體為pET22b(+)。
5.一種大腸桿菌細胞，其特征在于包含權利要求1所述的蔗糖異構酶基因。
6.根據權利要求5所述的大腸桿菌細胞，其特征在于所述大腸桿菌細胞為包含有重組 質粒 pal I/pET22b (+)的 Ε. coli BL21 (DE3)。
7.一種利用權利要求6所述的大腸桿菌高效表達權利要求1所述基因的方法，其特征 在于以糖蜜水解液為誘導劑誘導培養重組大腸桿菌細胞產酶。
8.根據權利要求7所述的高效表達基因的方法，其特征在于將重組大腸桿菌細胞在含 有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中30 40°C液體培養8 20h，按2 10 (ν/ν) % 的接種量轉接至發酵培養基培養5 7h后降溫至25 30°C再誘導培養6 12h ；所述的發 酵培養基為糖蜜水解液 10 50mL/L, (NH4)2SO4 5 10g/L, NaCl 5 10g/L，KH2PO4 1 3g/L, MgSO4 0.1 lg/L。
9.根據權利要求7或8所述的高效表達基因的方法，其特征在于所述的糖蜜水解液按 如下方法制備對于每IOOmL水，加入20 80g糖蜜溶解，在酸性條件下80 100°C水解 1 5h，水解結束后加堿調至中性，即為糖蜜水解液。
10.權利要求6所述的重組大腸桿菌在生物催化生產異麥芽酮糖中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種蔗糖異構酶基因，pal I基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。本發明還公開了上述基因的編碼蛋白質，SIase酶。本發明還公開了包含上述基因的表達載體及宿主細胞，以及該基因的高效表達方法。包含上述蔗糖異構酶基因的重組菌具有異構的活性，能轉化蔗糖生成異麥芽酮糖。該重組菌穩定性好，催化效率高，產物特異性明顯改善，可應用于異麥芽酮糖的工業生產中。
文檔編號C12N15/63GK101906430SQ20101010576
公開日2010年12月8日 申請日期2010年2月2日 優先權日2010年2月2日
發明者任賁, 徐虹, 李莎, 汪晨, 蔡恒 申請人:南京工業大學