專利名稱：：Cyp19a1基因snp檢測液相芯片及檢測方法
技術領域：
：本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體的是涉及CYP19A1基因SNP檢測液相芯片及檢測方法。
背景技術：
：近年來，芳香化酶抑制劑類藥物(Aromataseinhibitors,AIs)由于其特異性強、療效高、副作用小等特點，在乳腺癌和卵巢癌的治療中得到了越來越多的重視和應用。芳香化酶屬于細胞色素P450家族，能催化雄激素轉化為雌激素，是雌激素合成中的限速酶，廣泛存在于卵巢、胎盤、睪丸、腦、脂肪、骨等正常組織器官中，與乳腺癌的發生密切相關。因而AIs通過抑制芳香化酶，可使雌激素水平下降，從而消除雌激素對腫瘤生長的剌激作用。體內外研究均顯示，第三代AIs藥物，如來曲唑、阿那曲唑等，能有效抑制雄激素向雌激素轉化。另外，由于絕經后婦女的雌激素主要來源于雄激素前體物質在外周組織的芳香化，故該類藥物特別適用于絕經后的乳腺癌患者。研究還顯示，絕經后婦女早期乳腺癌的治療中，來曲唑的療效和耐藥性明顯優于他莫昔芬，顯著降低了疾病的復發率。因此，越來越多的醫生使用AIs來減少絕經后早期乳腺癌患者的術后腫瘤復發，避免他莫昔芬給患者帶來的不可預測且可能是相當嚴重的副作用。AIs藥物的使用需具備兩個條件絕經后婦女和雌激素受體陽性。即便如此，接受AIs治療后，仍只有約30%的患者能達到理想的治療效果。進一步研究發現，AIs的藥效與CYP19的基因多態性有關。CYP19是芳香化酶的編碼基因。臨床研究已證實，接受芳香化酶抑制劑治療的乳腺癌患者中，攜帶CYP19A1基因rs4646(G>T)突變患者的治療效果較無此突變的患者非常顯著。CYP19A1基因rs4646(G/T)位點GG、GT、TT基因型的頻率在歐洲人群中分別為54%、39%、7%，而在我國人群中分別為47.6%、41.6%、10.7%，分布情形大致相似，突變型所占比例較高，因此，CYP19Alrs4646(G>T)SNP突變是乳腺癌和卵巢癌患者接受芳香化酶抑制劑治療療效的有效預測指標，研究表明，在接受芳香化酶抑制劑治療的過程中，rsl0046位點的突變與患者的5年生存率有重要相關。rs700519突變與絕經后婦女患子宮內膜癌的風險呈強烈正相關。rsl870050突變與絕經后婦女患子宮內膜癌的風險呈負相關。hCV1664178、rsl2900137、rs730154、rs936306、rsl902586等位點突變與乳腺癌患者的無疾病生存期的縮短相關。目前已有檢測CYP19A1基因多態性的產品上市，如AppliedBiosystems公司的TaqManSNPGenotypingAssays系列產品，它是基于TaqMan技術的等位基因差異分析法，但其一次只能進行一種突變的檢測，耗時費力；傳統固相芯片法，價格昂貴，敏感性不高，檢測結果的重復性較差。而其它以PCR為基礎的檢測SNPs的技術，如直接測序法，半定量PCR技術，PCR-單鏈構象多態性分析(SSCP)檢測，這些技術存在靈敏度低，樣品易污染、假陽性率高的缺點，普通PCR方法和熒光定量PCR由于檢測通量的局限性均不能滿足檢測推廣的需要。
發明內容本發明的目的之一是提供CYP19A1基因SNP檢測液相芯片。該液相芯片可用于檢測CYP19A1基因的rs4646(G>T)、rsl0046(C>T)、rs700519(C>T)、rsl870050(C>A)、hCV1664178(A>C)、rsl2900137(G>C)、rs730154(G>A)、rs936306(T>C)、rsl902586(A>G)突變中的一種或多種。實現上述目的的技術方案如下—種CYP19A1基因SNP檢測液相芯片，包括有A.針對CYP19A1基因的SNP位點分別設計的野生型和突變型特異性ASPE引物，每種ASPE弓|物由5'端的tag序列和3'端的針對目的基因SNP位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列分別選自針對rs4646G>T的SEQIDNO.19和SEQIDNO.20、針對rsl0046C>T的SEQIDNO.21和SEQIDNO.22、針對rs700519C>T的SEQIDNO.23和SEQIDNO.24、針對rsl870050C>A的SEQIDN0.25和SEQIDNO.26、針對hCV1664178A>CSEQIDNO.27和SEQIDNO.28、針對rs12900137G>C的SEQIDNO.29和SEQIDNO.30、針對rs730154G>A的SEQIDNO.31和SEQIDNO.32、針對rs936306T>C的SEQIDNO.33和SEQIDNO.34、針對rsl902586A>G的SEQIDNO.35和SEQIDNO.36中的一對或一對以上；所述tag序列選自SEQIDNO.1SEQIDNO.18中的序列；B.分別包被有特異的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相應地與A中所選tag序列互補配對，所述anti-tag序列選自SEQIDNO.37SEQIDNO.54中的序列，所述anti-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；C.用于擴增具有rs4646G>T、rsl0046C>T、rs700519C>T、rsl870050C>A、hCV1664178A>C、rsl2900137G>C、rs730154G>A、rs936306T>C、rsl902586A>G的中的一個或一個以上SNP位點的CYP19A1基因目標序列的引物。優選地，擴增出具有SNP位點的目標序列的弓|物選自針對rs4646G>T的SEQIDNO.55和SEQIDNO.56、針對rsl0046C>T的SEQIDNO.57和SEQIDNO.58、針對rs700519C>T的SEQIDNO.59和SEQIDNO.60、針對rsl870050C>A的SEQIDNO.61和SEQIDNO.62、針對hCV1664178A〉CSEQIDN0.63和SEQIDNO.64、針對rsl2900137G>C的SEQIDNO.65和SEQIDNO.66、針對rs730154G>A的SEQIDNO.67和SEQIDNO.68、針對rs936306T>C的SEQIDNO.69和SEQIDN070、針對rsl902586A>G的SEQIDNO.71和SEQIDNO.72中的一對或一對以上；所述間隔臂序列為5_10個T。優選地，所述特異性ASPE引物分別選自針對rs4646G>T的由SEQIDNO.1和SEQIDNO.19組成的序列及由SEQIDNO.2和SEQIDNO.20組成的序列、針對rsl0046C>T的由SEQIDNO.3和SEQIDNO.21組成的序列及由SEQIDNO.4和SEQIDNO.22組成的序列、針對rs700519C>T的由SEQIDNO.5和SEQIDNO.23組成的序列及由SEQIDNO.6和SEQIDNO.24組成的序列、針對rsl870050OA的由SEQIDNO.7和SEQIDNO.25組成的序列及由SEQIDNO.8和SEQIDNO.26組成的序歹l」、針對hCV1664178A>C的由SEQIDNO.9和SEQIDNO.27組成的序列及由SEQIDNO.10和SEQIDNO.28組成的序列、針對rsl2900137G>C的由SEQIDNO.11和SEQIDNO.29組成的序列及由SEQIDNO.12和SEQIDNO.30組成的序列、針對rs730154G>A的由SEQIDNO.13和SEQIDNO.31組成的序列及由SEQIDNO.14和SEQIDNO.32組成的序列、針對rs936306T>C的由SEQIDNO.15和SEQIDNO.33組成的序列及由SEQIDNO.16和SEQIDNO.34組成的序列、針對rsl902586A>G的由SEQIDNO.17和SEQIDNO.35組成的序列及由SEQIDNO.18和SEQIDNO.36組成的序列、。本發明的另一目的是提供使用上述液相芯片對CYP19A1基因SNP進行檢測的方法。具體技術方案如下—種使用上述液相芯片對CYP19A1基因SNP檢測方法，主要包括以下步驟(1)PCR擴增待測DNA樣品；(2)PCR擴增產物用ExoSAP-IT試劑盒進行酶切處理；(3)用所述ASPE引物進行引物延伸反應，在反應過程中摻入生物素標記的dCTP，從而使反應后的產物帶上多個的生物素標記；(4)將對應ASPE引物的包被有特異的anti-tag序列的微球與上述延伸反應后的產物進行雜交反應；(5)雜交反應后的產物與鏈霉親和素_藻紅蛋白進行反應；(6)通過熒光檢測儀檢測。本發明的主要優點在于1.本發明所提供的檢測方法與測序法的吻合率高達100%。所制備的CYP19A1基因SNP檢測液相芯片具有非常好的信號_噪聲比，并且所設計的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應。尤其是，tag標簽序列、anti-tag標簽序列的選取以及tag標簽序列與具體ASPE引物的結合，能夠避免交叉反應，提高檢測的特異性，實現多個SNP位點的并行檢測。2.本發明設計的ASPE特異性引物序列具有非常好的特異性，能準確區分各種型別的基因型。本發明所設計的各種特異性ASPE引物，能夠在均一的反應條件下進行雜交反應，且各種引物、探針之間基本不存在非特異性結合。3.本發明不僅克服了傳統固相芯片敏感性不高，檢測結果的可重復性差的缺陷。本發明還可進一步同步對CYP19A1基因的rs4646(G>T)、rsl0046(C>T)、rs700519(C>T)、rsl870050(C>A)、hCV1664178(A>C)、rsl2900137(G>C)、rs730154(G>A)、rs936306(T>C)、rsl902586(A>G)的SNP位點進行檢測，提高檢測準確率，體現了精確的同時定性、定量分析特征，從而使檢測的靈敏度進一步得到提高，檢測結果更加準確可靠。同時，多種ASPE特異性引物的組合使用使液相芯片和檢測方法形成一個檢測效果完好的系統。具體實施例方式實施例1CYP19A1基因SNP檢測液相芯片，主要包括有—、ASPE引物針對CYP19A1的9種常見SNP位點:rs4646(G>T)、rsl0046(C>T)、rs700519(C>T)、rsl870050(C>A)、hCV1664178(A>C)、rsl2900137(G>C)、rs730154(G>A)、rs936306(T>C)、rs1902586(A>G)，設計特異性的引物序列。ASPE引物由"Tag+特異性引物序列"組成。ASPE引物序列如下表所示表1ASPE引物序列(Tag+特異性引物序列)基基因型類型ASPE引物因T恥特異性引物序列CYPGG5'AATCAATCTTCATTCMATCAACCAAGCTAGGTGCTATTG19Ars4646G>T(野生型)TCA(SEQNO.1)3'(SEQNO.19)1GT/TT(突變型)5'CTTTAATCCTTTATCACTTTATCA(SEQNO.2)CACCMGCTAGGTGCTATTT3'(SEQNO.20)7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>每條ASPE引物包括兩個部分，5'端為針對相應微球上anti-tag序列的特異性tag序列，3'端為突變型或野生型特異性引物序列(如上述表l所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。合成后的每條引物分別用1Ommol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的貯存液。二、anti-tag序列包被的微球根據所設計的ASPE特異性引物序列，選擇tag序列，最大限度地減少各微球的anti-tag序列之間以及tag與ASPE特異性引物序列可能形成的二級結構，選擇的十八種微球編號與微球上相應的anti-tag序列如表2所示。表2微球編號與微球上相應的anti-tag序列<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>選擇的18種微球購自美國Luminex公司，將anti-tag序列包被于微球上。anti-tag序列與微球之間連接有5-10個T的間隔臂序列，即在每個anti-tag序列前加上一段5-10個T的間隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。將合成的anti-tag序列用滅菌ddH20配成100nmol/ml的貯存液。常見的間隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n間隔臂(n>3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干擾，還可以用poly(TTG)作為間隔臂。本發明間隔臂優選為5-10個To微球包被的過程如下分別取5X106個上述編號的羧基化的微球(購自Luminex公司)懸浮于50ul0.lmol/L的MES溶液中(pH4.5)，力口入10ul合成的anti-tag分子(lOOnmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N_(3_Dimethylaminopropyl)_N_ethylcarbodiimide)(購自PierceChemical公司)工作液。往微球懸液中加入2.5ul的EDC工作液，恒溫孵育30分鐘，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒溫孵育30分鐘。反應結束后，用0.02%的Tween-20洗滌一次，再用0.1%的SDS液洗滌一次。將洗滌后的包被有anti-tag序列的微球重懸于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0)，lmmol/LEDTA中，2-8。C避光保存。三、擴增出具有SNP位點的目標序列的引物目標檢測CYP19A1基因9種常見SNP位點:rs4646(G>T)、rsl0046(C>T)、rs700519(C>T)、rsl870050(C>A)、hCV1664178(A>C)、rsl2900137(G>C)、rs730154(G>A)、rs936306(T>C)、rsl902586(A>G)。利用Primer5.0設計引物(見表3)。表3擴增出具有SNP位點的目標序列的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>所有引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。合成后的每條引物分別用1Ommol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的貯存液。實施例2運用實施例1所述CYP19A1基因SNP檢測液相芯片對臨床樣本的檢測所述各種溶液的配方如下50mM的MES緩沖液(pH5.0)配方(250ml):<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2XTm雜交緩沖液<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>過濾后貯存于4。C。ExoSAP-IT試劑盒購自美國USB公司。生物素標記的dCTP購自上海生工生物工程技術服務有限公司。—、樣本的DNA提取參照AxyPr印全血基因組小量提取試劑盒說明，得到待檢測的DNA。二、待測樣品的PCR擴增利用Primer5.0設計九對引物，多重PCR—步擴增出9種具有SNP位點的目標序列。引物序列(SEQNO.55-72)見上述表3所示。首先配制多重PCR引物工作液分別各取SEQNO.55_72的引物貯存液lOOul于1.5ml微量離心管中，混合均勻即為多重PCR引物工作液。多重PCR反應體系如下10X緩沖液(含Mg205uld證(各2.5mmol/L)4ulTaq酶(5U/ul)0.5ul多重PCR引物工作液(各16.7pmol/mL)6ul模板DNA(10ng/ul)lulddH2033.5ul_共50ulPCR擴增程序為95。C3min;94。C20s，56。C30s，72。C30s，30個循環；72。C10min;4t:保存備用。三、PCR產物的酶切處理參照ExoSAP-IT試劑盒說明，詳細步驟如下1.取7.5ulPCR反應后的產物，加入3ulExoSAP-IT酶；2.37t:孵育15min。8(TC孵育15min，使多余的酶滅活。酶切處理后的產物直接用于后續的ASPE引物延伸反應。四、位點特異的引物延伸反應(ASPE)利用上述設計的位點特異性引物進行引物延伸反應，在反應過程中摻入生物素標記的dCTP，從而使反應后的產物帶上多個的生物素標記。首先配制混合的ASPE引物工作液取相應的ASPE引物貯存液各10ul于1.5ml微量離心管中，加入10mmol/LTrisBuffer補至200ul，混合均勻即為ASPE混合引物工作液。ASPE反應的體系如下10X緩沖液2ulMgCl2(50,l/L)0.5ulBiotin-dCTP(400翻l/L)0.25uldATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L)lulTsp酶(5U/ul)0.25ul混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L)lul酶切處理的PCR擴增產物5ulddH2010.ul_共20ulPCR程序為96。C2min;94。C30s，58°Clmin，72°C2min，30個循環；4。C保存備用。五、雜交反應1.根據設計的ASPE引物，選擇相應的最優的18種微球(微球濃度均為2.5X105個/ml)。每種微球分別帶有不同顏色編碼，同時每種微球表面分別連接有一段24bp的特異13性的寡核苷酸序列(anti-tag)，這些anti-tag序列能分別與對應的ASPE引物5'端的tag序列特異結合；2.分別取lul每種編號的微球于1.5ml的微量離心管中；3.微球于^10000g離心l-2min;4.棄去上清，微球重懸于lOOul的2XTm雜交緩沖液中，渦旋混勻；5.取25ul上述微球懸液于96孔濾板相應的孔中，對照孔加25ul的ddH20;6.取5-25ul的ASPE反應液于相應的孔中，用ddH20補足至50ul;7.用錫箔紙包住96孔板以避光，95t:60s，37°C15min孵育雜交；8.雜交后的微球于》3000g離心2-5min;9.去上清，將微球重懸于75ul的1XTm雜交緩沖液中；10.微球于》3000g離心2-5min;11將微球重懸于75ul的lXTm雜交緩沖液中，加入15ul濃度為10ug/ml的鏈霉親和素-藻紅蛋白(SA-PE);12.37。C孵育15min，于Luminex儀器上檢測。六、結果檢測與數據分析反應后產物通過Luminex系列分析儀器檢測。以聚苯乙烯微球作為反應的載體，以熒光檢測儀作為檢測平臺，對核酸分子進行高通量的多指標并行檢測。在微球的制造過程中，摻入不同比例的紅光及紅外光染色劑，從而形成多至IOO種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價結合了針對不同待檢測物的核酸分子作為探針分子，報告分子以生物素標記，并用高靈敏的熒光染料染色。這些微球與待測物、報告分子、熒光標記物就形成完整的微球檢測體系用于Luminex系統的讀取。Luminex閱讀系統分別激發紅色激光和綠色激光用于微球體系的檢測，檢測結果如表4和表5所示。對熒光值(MFI)和數據處理有以下要求1.每個位點需至少有一個等位基因MFI大于300而且大于10XPCR陰性對照MFI;2.NETMFI=樣品MFI-PCR陰性對照MFI(NETMFI小于0的以0表示);3.滿足以上兩個條件的數據，按下列公式計算突變比值突變比值=突變型NETMFI+(突變型NETMFI+野生型NETMFI)4.根據經驗對每個檢測位點的突變比值確定閾值(cut-off值)，以劃分野生型純合子、雜合子和突變型純合子。使用本方法檢測大量樣本的CYP19A1基因多態性，實驗數據符合上述要求，因此可計算得它們的突變比值。閾值(cut-off值)的設置如下突變比值范圍在0%-20%視為野生型純合子；30%-70%視為雜合子；80%-100%視為變異型純合子。以測序法檢測與液相芯片結果作對照，計算本發明所提供的分型方法檢測結果的吻合率。本方法檢測20份樣本的CYP19A1基因(9個SNP位點同時檢測)檢測結果與測序結果吻合率達到100%，且具有非常好的信號_噪聲比。可見本發明所提供的CYP19A1基因SNP檢測液相芯片能夠準確地檢測出CYP19A1基因的SNP類型，且結果穩定可靠，多種ASPE特異性引物的組合使用使液相芯片和檢測方法形成一個檢測效果完好的系統。表4樣本檢測結果(MFI)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實施例3不同的ASPE引物的液相芯片對CYP19A1基因SNP檢測—、液相芯片制備的設計(Tag序列及Anti-Tag序列的選擇)以CYP19A1基因rs4646(G>T)位點突變的檢測液相芯片為例，針對rs4646(G>T)的野生型和突變型設計ASPE引物3'端的特異性引物序列，而ASPE引物5'端的Tag序列則選自SEQIDNO.1-SEQIDNO.18中的6條，相應的，包被于微球上的與對應tag序列互補配對的anti-tag序列選擇SEQIDNO.37-SEQIDNO.54。具體設計如下表(表6)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、擴增引物、檢測方法等如實施例1和實施例2所述。表6液相芯片制備的設計<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>二、樣品檢測采用上述設計制備的液相芯片，按實施例2所述檢測過程和方法對樣品21-40進行檢測，檢測結果如下表7樣本檢測結果(MFI)與基因多態性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>其它針對不同的SNP位點的液相芯片，ASPE引物運用不同的Tag序列，其結果依然穩定可靠，具體數據省略。實施例4不同間隔臂液相芯片對CYP19A1基因SNP檢測—、液相芯片制備的設計(間隔臂的選擇)以CYP19A1基因rsl0046(C>T)位點突變的檢測液相芯片為例，探明不同的間隔臂液相芯片對CYP19A1基因SNP檢測的影響，針對rsl0046(C>T)的野生型和突變型設計ASPE引物3'端的特異性引物序列，而ASPE引物5'端的Tag序列則選自SEQIDNO.1-SEQIDNO.18中的4條，相應的，包被于微球上的與對應tag序列互補配對的anti-tag序列選擇SEQIDNO.37-SEQIDNO.54。本實施例的間隔臂為(CH2)12，具體設計如下表(表8)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、擴增引物、檢測方法等如實施例1和實施例2所述。表8液相芯片制備的設計<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>二、樣品檢測采用上述設計制備的液相芯片，按實施例2所述檢測過程和方法對樣品41-60進行檢測，檢測結果如下表9樣本檢測結果(MFI)與基因多態性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實施例4的間隔臂為(Cigi2，由檢測結果依然穩定可靠(其它間隔臂的檢測結果也如此，具體數據省略)，而優選5-10個T的間隔臂的雜交反應率和雜交特異性均優于間隔臂為(CH2)12的液相芯片，本發明所采用的5-10個T的間隔臂均優于其他間隔臂。以上是針對本發明的可行實施例的具體說明，但該實施例并非用以限制本發明的專利范圍，凡未脫離本發明技藝精神所為的等效實施或變更，均應包含于本發明的專利范圍中。權利要求一種CYP19A1基因SNP檢測液相芯片，其特征是，主要包括有A.針對CYP19A1基因的SNP位點分別設計的野生型和突變型特異性ASPE引物，每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的針對目的基因SNP位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列分別選自針對rs4646G＞T的SEQIDNO.19和SEQIDNO.20、針對rs10046C＞T的SEQIDNO.21和SEQIDNO.22、針對rs700519C＞T的SEQIDNO.23和SEQIDNO.24、針對rs1870050C＞A的SEQIDNO.25和SEQIDNO.26、針對hCV1664178A＞C的SEQIDNO.27和SEQIDNO.28、針對rs12900137G＞C的SEQIDNO.29和SEQIDNO.30、針對rs730154G＞A的SEQIDNO.31和SEQIDNO.32、針對rs936306T＞C的SEQIDNO.33和SEQIDNO.34、針對rs1902586A＞G的SEQIDNO.35和SEQIDNO.36中的一對或一對以上；所述tag序列選自SEQIDNO.1～SEQIDNO.18中的序列；B.分別包被有特異的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相應地與A中所選tag序列互補配對，所述anti-tag序列選自SEQIDNO.37～SEQIDNO.54中的序列，所述anti-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列，上述每種微球具有不同顏色編碼；C.用于擴增具有rs4646G＞T、rs10046C＞T、rs700519C＞T、rs1870050C＞A、hCV1664178、rs12900137G＞C、rs730154G＞A、rs936306T＞C、rs1902586A＞G中的一個或一個以上SNP位點CYP19A1基因目標序列的引物。2.根據權利要求1所述的CYP19A1基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述擴增引物選自:針對rs4646G〉T的SEQIDNO.55和SEQIDNO.56、針對rsl0046C>T的SEQIDNO.57和SEQIDNO.58、針對rs700519C>T的SEQIDNO.59和SEQIDNO.60、針對rsl870050C〉A的SEQIDNO.61和SEQIDNO.62、針對hCV1664178A>CSEQIDNO.63和SEQIDNO.64、針對rsl2900137G>C的SEQIDNO.65和SEQIDNO.66、針對rs730154G>A的SEQIDNO.67和SEQIDNO.68、針對rs936306T>C的SEQIDNO.69和SEQIDNO.70、針對rsl902586A>G的SEQIDNO.71和SEQIDNO.72中的一對或一對以上。3.根據權利要求1或2所述的CYP19A1基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述特異性ASPE引物分別選自:針對rs4646G>T的由SEQIDNO.1和SEQIDNO.19組成的序列及由SEQIDNO.2和SEQIDNO.20組成的序列、針對rsl0046C>T的由SEQIDNO.3和SEQIDNO.21組成的序列及由SEQIDNO.4和SEQIDNO.22組成的序列、針對rs700519C>T的由SEQIDNO.5和SEQIDNO.23組成的序列及由SEQIDNO.6和SEQIDNO.24組成的序列、針對rsl870050OA的由SEQIDNO.7和SEQIDNO.25組成的序列及由SEQIDNO.8和SEQIDNO.26組成的序列、針對hCV1664178A>C的由SEQIDNO.9和SEQIDNO.27組成的序列及由SEQIDNO.IO和SEQIDNO.28組成的序列、針對rsl2900137G>C的由SEQIDNO.11和SEQIDNO.29組成的序列及由SEQIDNO.12和SEQIDNO.30組成的序列、針對rs730154G>A的由SEQIDNO.13和SEQIDNO.31組成的序列及由SEQIDNO.14和SEQIDNO.32組成的序列、針對rs936306T>C的由SEQIDNO.15和SEQIDNO.33組成的序列及由SEQIDNO.16和SEQIDNO.34組成的序列、針對rsl902586A>G的由SEQIDNO.17和SEQIDNO.35組成的序列及由SEQIDNO.18和SEQIDNO.36組成的序列中的一組或一組以上。4.根據權利要求1或2所述的CYP19A1基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述間隔臂序列為5-10個T。5.根據權利要求1所述的CYP19A1基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述特異性ASPE引物為針對rs4646G〉T的由SEQIDNO.1和SEQIDNO.19組成的序列及由SEQIDNO.2和SEQIDNO.20組成的序列、針對rsl0046C>T的由SEQIDNO.3和SEQIDNO.21組成的序列及由SEQIDNO.4和SEQIDNO.22組成的序列、針對rs700519C>T的由SEQIDNO.5和SEQIDNO.23組成的序列及由SEQIDNO.6和SEQIDNO.24組成的序列、針對rsl870050C>A的由SEQIDNO.7和SEQIDNO.25組成的序列及由SEQIDNO.8和SEQIDNO.26組成的序列、針對hCV1664178A>C的由SEQIDNO.9和SEQIDNO.27組成的序列及由SEQIDNO.10和SEQIDNO.28組成的序列、針對rsl2900137G>C的由SEQIDNO.11和SEQIDNO.29組成的序列及由SEQIDNO.12和SEQIDNO.30組成的序列、針對rs730154G>A的由SEQIDNO.13和SEQIDNO.31組成的序列及由SEQIDNO.14和SEQIDNO.32組成的序列、針對rs936306T>C的由SEQIDNO.15和SEQIDNO.33組成的序列及由SEQIDNO.16和SEQIDNO.34組成的序列、和針對rsl902586A>G的由SEQIDNO.17和SEQIDNO.35組成的序列及由SEQIDNO.18和SEQIDNO.36組成的序列；分別包被有特異的anti-tag序列的18種微球，所述anti-tag序列能相應地與所述特異性ASPE引物中的tag序列互補配對，所述anti-tag序列與微球連接中間還設有5-10個T的間隔臂序列，上述每種微球具有不同顏色編碼；擴增引物為:針對rs4646G>T的SEQIDNO.55和SEQIDNO.56、針對rsl0046C>T的SEQIDNO.57和SEQIDNO.58、針對rs700519C>T的SEQIDNO.59和SEQIDNO.60、針對rsl870050C>A的SEQIDNO.61和SEQIDNO.62、針對hCV1664178A>CSEQIDNO.63和SEQIDNO.64、針對rs12900137G>C的SEQIDNO.65和SEQIDNO.66、針對rs730154G>A的SEQIDNO.67和SEQIDNO.68、針對rs936306T>C的SEQIDNO.69和SEQIDN070、和針對rsl902586A>G的SEQIDNO.71和SEQIDNO.72。6.—種CYP19A1基因SNP檢測方法，其特征是，使用權利要求1-5所述的液相芯片，主要包括以下步驟(1)PCR擴增待測DNA樣品；(2)PCR擴增產物用ExoSAP-IT試劑盒進行酶切處理；(3)用所述ASPE引物進行引物延伸反應，在反應過程中摻入生物素標記的dCTP，從而使反應后的產物帶上多個的生物素標記；(4)將對應ASPE引物的包被有特異的anti-tag序列的微球與上述延伸反應后的產物進行雜交反應；(5)雜交反應后的產物與鏈霉親和素_藻紅蛋白進行反應；(6)通過熒光檢測儀檢測。全文摘要本發明公開了一種CYP19A1基因SNP檢測液相芯片，包括有針對CYP19A1基因rs4646、rs10046C＞T、rs700519C＞T、rs1870050C＞A、hCV1664178A＞C、rs12900137G＞C、rs730154G＞A、rs936306T＞C、rs1902586A＞GSNP位點分別設計的野生型和突變型特異性ASPE引物，每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列選自SEQIDNO.19～SEQIDNO.36；所述tag序列選自SEQIDNO.1～SEQIDNO.18中的序列；分別包被有特異的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相應地與所選tag序列互補配對；用于擴增具有CYP19A1基因待檢測的目標序列SNP位點的引物。本發明還公開了CYP19A1基因SNP檢測方法。本發明所提供的檢測方法與測序法的吻合率高達100％。所制備的CYP19A1基因SNP檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設計的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應。文檔編號C12Q1/68GK101781684SQ20101010556公開日2010年7月21日申請日期2010年1月29日優先權日2010年1月29日發明者李國強,楊惠夷,許嘉森申請人:廣州益善生物技術有限公司