專利名稱：一種高通量篩選microRNA靶基因的新方法
技術領域：
本發明涉及一種利用生物素修飾的microRNA模擬物高通量篩選microRNA靶基因 的新方法。
背景技術：
microRNA (簡稱miRNA)是與轉錄后基因沉默相關的一類長度為21_23nt的重要 RNA，最早在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中發現[1]。現已證實，miRNA廣泛存 在于真核生物細胞內，是最大的基因家族之一，大約占整個基因組的-4% [2]。最近研 究表明，miRNA功能廣泛，在生物體內的多種生物學過程和調控途徑中扮演著關鍵性角色， 如發育進程控制、細胞生長與凋亡、細胞分裂、細胞分化與器官發育、病毒感染、維持機體生 理活動的動態平衡等[3]。而且，一些重要的miRNA的失調將會導致細胞調控事件的劇變， 甚至可能誘發癌癥[4]。miRNA與其靶分子以及調控其自身表達的轉錄因子組成了一個復 雜的調控網絡[5]，使我們對于基因表達調控網絡的認識更加全面和深入，上升到了一個新 的高度。目前，從microRNA (miRNA)基因的轉錄、加工到對靶基因的識別過程都有了較為 深入地研究，這個過程通常被認為是一個從細胞核到細胞質逐漸加工的過程[6]在細胞 核內，microRNA 是由 RNA 聚合酶 II(PolII) [7]或 RNA 聚合酶 III (PolIII) [8]轉錄的，一 般初始轉錄本為大的具有帽子結構(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pri_miRNA[9， 10]。這些pri-miRNA在核糖核酸酶Drosha[11]和其輔助因子Pasha的作用下被處理成 70個左右的核苷酸組成的前體產物pre-miRNA [12，13]，轉運蛋白RAN-GTP和export in 5 [14-16]將這種前體分子輸送到細胞質中。隨后，細胞質中另一個核糖核酸酶Dicer將其 剪切產生約為22個核苷酸長度的miRNA:miRNA*雙鏈[17，18]。同樣，具有這樣結構的雙 鏈RNA在轉染入細胞后也會被內源性RNA酶系統識別，很快被引導進入miRNA沉默復合體 (miRISC)中[19]，其中含有Arg0naute、TRBP等蛋白，并且將成熟的單鏈miRNA保留在這一 復合物中，形成活性miRNA沉默復合體。活性miRNA沉默復合體在所包裹的成熟miRNA引 導下，結合到與成熟miRNA互補的mRNA的位點上，并會與mRNA 5’和3’結合蛋白發生競爭 性相互作用，通過兩種依賴于序列互補性的機制負調控基因表達[20]如果miRNA與靶位 點完全互補(或者幾乎完全互補)，那么這些miRNA的結合往往引起靶mRNA的降解，通過這 種機制作用的miRNAs的結合位點通常都在mRNA的編碼區或開放閱讀框中；與靶mRNA不完 全互補的miRNA在蛋白質翻譯水平上抑制其表達或間接影響mRNA的穩定性，使用這種機制 的miRNA結合位點通常在mRNA的3’端非翻譯區。而且，microRNA沉默復合物與microRNA 靶基因mRNA這種相互作用在一定時間內是很穩定的[21]，這就為進行microRNA靶基因的 富集和篩選提供了可能。microRNA在對其靶基因進行識別和作用過程中，其5’部分與對應靶基因mRNA的 3’部分的配對十分重要，這一點最早在對線蟲的研究中得以發現。當時的研究結果表明， lin-14UTR區存在一個核心元件，可以與lin-4miRNA的5，部分互補[22]。更多最近的研究結果支持microRNA的5’部分與對應靶基因mRNA的3’部分的配對的重要性1)幾個能 夠通過在轉錄后水平發揮抑制作用的無脊椎動物的miRNA，其2-8位核苷酸都分別與其靶 基因的3’UTR精確互補；2)miRNA的2_8位核苷酸及與其相互補的mRNA上相對應的堿基位 置在進化上都非常保守[23，24] ；3)miRNA的2-8位核苷酸對于miRNA特異性識別非常重要 [24]。另外，由于microRNA沉默復合物中的重要成分之一 Argonaute蛋白會與microRNA 的3’端相互作用，在對microRNA進行人工修飾的時候通常選擇正義鏈的5’端堿基。microRNA靶基因的確定是microRNA功能研究中的一個核心問題，隨著研究的不 斷深入，microRNA靶基因篩選和鑒定方法也在不斷發展。在研究的早期，較多采用生物信息 學預測結合熒光素酶報告基因系統在體外對microRNA的靶基因進行驗證。但這種方法常 常只能對microRNA進行一一分析，費時費力，且microRNA靶基因分析范圍有限，并不適合 進行高通量分析。microRNA抑制子修飾技術的發展為microRNA功能的研究提供了新的思 路，利用經2’ -0甲基化修飾后或用LNA合成的microRNA抑制子結合全基因組表達譜芯片 分析技術，可以高通量分析內源性microRNA被敲低后的基因表達譜變化并進行聚類分析， 從而推測microRNA的功能。但由于這些方法往往通過檢測整個基因組表達譜的變化來推 測microRNA的靶基因，而由于有些基因的變化并非microRNA直接作用而造成的，這就有可 能造成篩選到的靶基因存在“假陽性”。因此，迫切需要一種既能高通量篩選microRNA靶基因，又能降低或排除“假陽性” 靶基因的技術。
發明內容
因此，本發明的目的是提供一種既能高通量篩選microRNA靶基因，又能降低或排 除“假陽性”靶基因的技術。因此，本發明的第一方面涉及一種高通量篩選microRNA靶基因的方法，其包含下 述步驟a)根據要研究的microRNA的序列，進行帶有生物素修飾的microRNA模擬物的設 計與合成，b)選擇合適的目的細胞，進行microRNA模擬物的轉染，并設立相應陰性對照和陽 性對照，C)利用含對生物素具有強親和性的配偶體的磁珠對生物素修飾的microRNA模擬 物直接結合的靶基因mRNA進行富集，并經過洗滌去除非特異性結合的mRNA，經洗脫后最終 獲得microRNA靶基因mRNA庫。優選地，所述方法進一步包括步驟d)將獲得的microRNA靶基因mRNA兩端分別加上已知序列的接頭，經過PCR擴增 后構建microRNA靶基因cDNA文庫，并進行測序和序列比對，以確定microRNA靶基因的信 息和功能。優選地，所述方法進一步包括步驟e)在體外利用基因表達報告系統，將microRNA模擬物與含有microRNA靶基因 3’ UTR區的相應基因表達報告載體共轉染，以確定microRNA對候選靶基因的負調節作用。優選地，所述對生物素具有強親和性的配偶體選自鏈霉親和素、親和素、抗生物素蛋白，更優選地，所述對生物素具有親和性的配偶體是鏈霉親和素。優選地，所述基因表達報告系統選自熒光素酶報告系統、綠色熒光蛋白報告系統、 半乳糖苷酶報告基因系統、硝基還原酶報告基因系統、氯霉素乙酰基轉移酶報告基因系統或 分泌型堿性磷酸酶報告基因系統，更優選地，所述基因表達報告系統是熒光素酶報告系統。優選地，所述生物素修飾經由本領域常規方法進行。本發明的第二方面涉及如上所述的方法在篩選microRNA靶基因中的用途。換言之，為了更加準確地對microRNA靶基因進行篩選和鑒定，本技術采用生物化 學方法對microRNA直接結合的靶基因mRNA進行了富集，該方法的原理如下用生物素修 飾后的microRNA模擬物轉染細胞，利用內源性microRNA的加工系統將帶有生物素修飾的 microRNA包裹入microRNA沉默復合物，進而識別和結合其靶基因。然后，提取細胞質粗提 物，通過生物素與抗生物素蛋白——鏈霉親和素的強相互作用，利用表面帶有鏈霉親和素 的磁珠將microRNA沉默復合物偶聯的靶基因mRNA富集。將富集的mRNA洗脫后進行逆轉 錄形成cDNA，構建文庫，然后進行測序鑒定。具體而言，本技術的操作要點主要包括以下幾個步驟a)根據要研究的microRNA的序列，進行帶有生物素修飾microRNA模擬物的設計 與合成，b)選擇合適的目的細胞，進行microRNA模擬物的轉染，并設立相應陰性對照和陽 性對照，c)利用鏈霉親和素磁珠對生物素修飾microRNA模擬物直接結合的靶基因mRNA 進行富集，并經過洗滌去除非特異性結合的mRNA，經洗脫后最終獲得microRNA靶基因mRNA 庫，及d)可選地，將獲得的microRNA靶基因mRNA兩端分別加上已知序列的接頭，經過 PCR擴增后構建microRNA靶基因cDNA文庫，并進行測序和序列比對，以確定microRNA靶基 因的信息和功能，及e)可選地，在體外利用熒光素酶報告系統，將microRNA模擬物與含有microRNA靶 基因3’ UTR區的熒光素酶報告載體共轉染，以確定microRNA對候選靶基因的負調節作用。本技術最大的優勢在于，將microRNA直接相互作用的mRNA靶基因進行富集，避免了 其他方法可能存在的“假陽性”問題，而且操作簡便，費用相對較低，適用于大多數實驗室。
圖1 利用帶有生物素標記的microRNA模擬物高通量捕獲microRNA靶基因的技 術路線圖。圖2 帶有熒光基團FAM的microRNA模擬物可以成功高效率轉染HEK-293細胞， 其中GFP作為陽性對照。圖3 利用Northern blot方法，以microRNA特異性探針檢測microRNA模擬物在 細胞內的正確表達。圖4 =HiicroRNA模擬物轉染目的細胞后捕獲的cDNA片段，兩端連入接頭后經過 PCR擴增后得到的結果。圖5 =HiicroRNA模擬物miR_7與帶有候選靶基因3’非編碼區(3’ -UTR)的報告基因質粒(Iuc-UTR)共轉染293T細胞進行microRNA對靶基因負調節作用的驗證。圖6 =HiicroRNA模擬物miR-122與帶有候選靶基因3’非編碼區(3’ -UTR)的報告 基因質粒(Iuc-UTR)共轉染293T細胞進行microRNA對靶基因負調節作用的驗證。
具體實施例方式下面將通過下述非限制性實施例進一步說明本發明，本領域技術人員公知，在不 背離本發明精神的情況下，可以對本發明做出許多修改，這樣的修改也落入本發明的范圍。下述實驗方法如無特別說明，均為常規方法，所使用的實驗材料如無特別說明，均 可容易地從商業公司獲取。
實施例實施例1實驗材料及方法l.microRNA模擬物的設計、合成microRNA模擬物是模擬內源性microRNA的成熟過程中的發夾形前體而人工合成 的結構型雙鏈RNA，其中正義鏈與microRNA成熟序列相同，其5’末端一個堿基在合成時帶 有生物素標記，而反義鏈與正義鏈5’端起19個核苷酸反向互補，并在正義和反義鏈的3’ 末端各有兩個堿基突出。microRNA模擬物的合成由gen印harma公司完成。本實驗中選擇 兩個代表性的miRNA進行后續實驗，實驗中涉及的寡聚核苷酸序列如表1所述表1 實驗中涉及的寡聚核苷酸序列
權利要求
1.一種高通量篩選microRNA靶基因的方法，其包含下述步驟a)根據要研究的microRNA的序列，進行帶有生物素修飾的microRNA模擬物的設計與 合成，b)選擇合適的目的細胞，進行microRNA模擬物的轉染，并設立相應陰性對照和陽性對照C)利用含對生物素具有強親和性的配偶體的磁珠對生物素修飾的microRNA模擬物直 接結合的靶基因mRNA進行富集，并經過洗滌去除非特異性結合的mRNA，經洗脫后最終獲得 microRNA 靶基因 mRNA 庫。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法進一步包括步驟d)將獲得的microRNA靶基因mRNA兩端分別加上已知序列的接頭，經過PCR擴增后構 建microRNA靶基因cDNA文庫，并進行測序和序列比對，以確定microRNA靶基因的信息和 功能。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法進一步包括步驟e)在體外利用基因表達報告系統，將microRNA模擬物與含有microRNA靶基因3’UTR 區的相應基因表達報告載體共轉染，以確定microRNA對候選靶基因的負調節作用。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述對生物素具有強親和性的配偶體選自 鏈霉親和素、親和素、抗生物素蛋白。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述對生物素具有強親和性的配偶體是鏈 霉親和素。
6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述基因表達報告系統選自熒光素酶報告 系統、綠色dd熒光蛋白報告系統、半乳糖苷酶報告基因系統、硝基還原酶報告基因系統、氯 霉素乙酰基轉移酶報告基因系統或分泌型堿性磷酸酶報告基因系統。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述基因表達報告系統是熒光素酶報告系統。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述生物素修飾經由本領域常規方法進行。
9.根據權利要求1到8任一項所述的方法在篩選microRNA靶基因中的用途。
全文摘要
本發明涉及一種高通量篩選microRNA靶基因的新方法。特別地，本發明涉及一種利用生物素修飾的microRNA模擬物高通量篩選microRNA靶基因的新方法，其主要特征在于設計與合成帶有生物素修飾的microRNA模擬物及利用含對生物素具有強親和性的配偶體的磁珠對生物素修飾的microRNA模擬物直接結合的靶基因mRNA進行富集和選擇。本發明將microRNA直接相互作用的mRNA靶基因進行富集，避免了其他方法可能存在的“假陽性”問題，而且操作簡便，費用相對較低，適用于大多數實驗室。
文檔編號C12Q1/68GK102115785SQ20101003391
公開日2011年7月6日 申請日期2010年1月6日 優先權日2010年1月6日
發明者習楊, 劉德培, 呂湘, 曾超, 朱文楠, 李振亞 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所