專利名稱：一種嵌合抗體及免疫細胞的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種嵌合抗體及免疫細胞。
背景技術：
自然殺傷細胞(Natural killer, NK)是淋巴細胞的一個亞類，在宿主對惡性腫瘤 的細胞免疫應答中扮演了重要的角色。NK細胞對腫瘤的殺傷無MHC限制性，無特異性，不需 抗原預先致敏。許多細胞因子(包括IL-2)能增強NK細胞的殺瘤活性。NK細胞的功能受 其細胞表面表達的活化受體和抑制性受體的調節。研究表明，NK細胞能有效殺傷MHC-I分子下調的腫瘤細胞，這使得它們能有效殺 傷逃逸免疫應答的腫瘤變異細胞。許多研究表明，體外培養的、活化的自體或異體的NK細 胞通過釋放穿孔素和細胞因子，能有效抑制小鼠體內腫瘤的生長。然而，NK細胞的分離和 擴大培養在技術上存在很大的難度。而且，病人起源的NK細胞功能受到損害，即使在體外 經過淋巴因子活化培養后也不能恢復，這使得該方法的應用受到很大的限制。最重要的是， NK細胞的體外擴增比較困難，而且少數擴增得到的各批次的NK細胞也不一樣，導致應用于 臨床實驗的NK細胞無法標準化，這就促使研究者去探索細胞毒NK細胞系的特性和治療潛 力。連續生長的人IL-2依賴的NK-92細胞系被認為是一個很好的腫瘤免疫治療的候選效 應細胞。研究證實，NK-92細胞對多種不同來源的惡性細胞在體外和人源化的小鼠體內模 型中均顯示了很強的細胞毒活性。而且，NK-92細胞對同種異體的正常細胞沒有毒性。目 前，研究者正在評價NK-92細胞臨床應用的安全性與有效性。NK-92細胞具有活化的NK細 胞的功能，它們表達典型的NK細胞表面受體，缺少Fc-γ RIII (CD16)。它們的高內源性的細 胞毒活性極有可能歸因于NK細胞抑制性受體的缺乏。NK-92細胞僅表達一種抑制性受體， 即KIR2DL4，該受體通過結合靶細胞表面的人白細胞抗原G (HLA-G)來抑制NK細胞的細胞毒 活性。NK-92-MI細胞是NK-92細胞的變體，持續性分泌中等水平的IL-2，保留了母本細 胞的表型特征和高細胞毒活性，但具有NK-92細胞所不具備的幾個優點首先，NK-92-MI細 胞具有不依賴外源IL-2的長期的高細胞毒活性，因此避免了系統注射IL-2所產生的毒性； 其次，NK-92-MI細胞的保持和擴增比母本細胞系更簡單，不需在培養基中另加IL-2，這對 NK細胞的大規模擴增顯得尤其重要；而且，NK-92-MI細胞能殺傷體外和異種移植的小鼠體 內的人腫瘤細胞系。研究表明，嵌合受體能成功表達在NK-92細胞系的表面，賦予NK-92細胞特異、有 效地殺傷表達膜抗原的腫瘤細胞的能力。這類嵌合受體具有兩個功能抗體片段依賴的抗 原結合；信號受體的活化結構域依賴的效應細胞活化。然而，因為抗體不能穿透細胞膜去結 合胞內表達的腫瘤抗原，這使得以該類抗原為靶標的NK-92或NK-92-MI的細胞靶向治療至 今停滯不前。而且，因為大多數腫瘤抗原都是胞內蛋白，尋找能特異結合該類抗原的抗體將 極大地擴展腫瘤靶向治療的適用范圍。研究表明，細胞內的腫瘤抗原被蛋白酶或溶酶體降解為小肽，與HLA-I或HLA-II分子結合后，形成HLAA^ptide復合物，被呈遞到腫瘤細胞表面，進而被T細胞表面的TCR 受體識別，介導T細胞對腫瘤細胞的殺傷。目前，以抗體為基礎的腫瘤靶向治療常用的抗體是單鏈抗體或抗體Fab段，與它 們相比，單域抗體具有幾個獨一無二的優點(1)單域抗體僅含有抗體重鏈的一個可變區， 是最小的全功能性的抗原結合片段，因此容易進行基因工程操作；(2)單域抗體與人的VH3 域有很高的同源性。這些特性使它們成為腫瘤靶向治療的極合適的候選抗體。直到現在， 僅有一篇文獻報道了以單域抗體為基礎的免疫毒素用于腫瘤的免疫治療。通過雜交瘤技術制備MHC/肽復合物特異的TCR樣抗體仍存在很大的技術難度。重 組抗體及噬菌體展示技術的發展為TCR樣抗體的制備提供了新的途徑。GplOO是黑色素細胞分化抗原，定位于細胞內，被加工后以MHC/肽復合物的方式 呈遞到腫瘤細胞表面，進而被T細胞識別和殺傷。Gpl002C19_217(215E)(ITOVPESV)是主要的HLA-A2 限制性的表位。研究表明，以特異識別HLA/gp 100-肽復合物的Fab抗體為基礎的免疫毒 素能有效抑制裸鼠體內人黑色素瘤細胞的生長。源于黑色素腫瘤浸潤的HLA-A2限制性的 CTL能識別gplOO表位。這些報告證實HLA-A2/gpl00-肽復合物是腫瘤靶向治療的有效靶 標。目前，僅有一篇文獻報道了以HLA-A2/gpl00-肽復合物特異的Fab抗體為基礎的免疫 毒素用于黑色素瘤的免疫治療，未見以HLA-A2/gpl00-肽復合物特異的單域抗體為基礎的 靶向治療的報道，也未見以HLA-A2/gpl00-肽復合物特異的抗體為基礎的細胞靶向治療的 報道。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種可在細胞表面表達的嵌合抗體，這種抗體特別適用 于在殺傷細胞中表達，然后使細胞行使殺傷性免疫功能。本發明所提供的嵌合抗體，其氨基酸序列由N端至C端依次為目的抗體、HLA-A2分 子的跨膜區片段、CD3復合蛋白ζ鏈的胞內區片段。本發明所提供的嵌合抗體還可以是如下的抗體其氨基酸序列由N端至C端依次 為目的抗體、標簽、跨膜區片段、胞內區片段；所述目的抗體為識別MHC-肽復合物的肽特異 性的抗體。此抗體即是附加了標簽的抗體，附加標簽的作用在于便于檢測嵌合抗體的表達。所述跨膜區片段可為HLA-A2分子的跨膜區片段；所述胞內區片段可為CD3復合蛋 白ζ鏈的胞內區片段；所述標簽可為Myc標簽。所述Myc標簽的氨基酸序列具體可如序列表中序列2所示；所述HLA-A2分子的跨 膜區片段的氨基酸序列具體可如序列表中序列3所示；所述CD3復合蛋白ζ鏈的胞內區片 段的氨基酸序列具體可如序列表中序列4所示。所述目的抗體的氨基酸序列具體可如序列表中序列1所示。本發明的另一個目的是提供一種特異結合黑色素瘤細胞分化抗原HLA_A2/gp ιοο209_217(215Ε)(皿QVPESV)復合物的單域抗體。本發明所提供的單域抗體，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。表達上述任一所述抗體的免疫細胞也屬于本發明的保護范圍。所述表達上述任一所述抗體的免疫細胞具體可以是通過向宿主細胞中導入所述 抗體的編碼基因得到的。
上述任一所述單域抗體或嵌合抗體的編碼基因也屬于本發明的保護范圍。所述單域抗體的編碼基因具體可為如下1)或2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述單域抗體的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述單域抗體的DNA分 子；所述嵌合抗體中所述Myc標簽的編碼基因具體可為序列表中序列6所示的DNA分 子；所述嵌合抗體中所述HLA-A2分子的跨膜區片段的編碼基因具體可為如下a)或b) 或c)的基因a)其核苷酸序列是序列表中序列7所示的DNA分子；b)在嚴格條件下與a)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白的DNA分子；c)與a)或b)限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA分 子；所述嵌合抗體中所述CD3復合蛋白ζ鏈的胞內區片段的編碼基因具體可為如下 I、II或III的基因I其核苷酸序列是序列表中序列8所示的DNA分子；II在嚴格條件下與I限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白的DNA分子；III與I或II限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA分 子；上述嚴格條件是，在6X SSC, 0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2X SSC, 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系或表達盒也均屬 于本發明的保護范圍。所述轉基因細胞系的宿主細胞具體可為免疫細胞；所述免疫細胞具體可為自然殺 傷細胞。實驗證明，本發明的單域抗體能特異結合固化的HLA-A2/gpl002Q9_217(215E)_QVPESV) 復合物，不能結合固化的HLA-A2/p6 5495_5(13或HLA-A2/Core18_27對照復合物。GPAT-pen五 聚體能特異結合gpl002Q9_217(215E)
(IMDQVPESV) 肽脈沖的T2細胞，而不結合無關肽脈沖的T2細 胞或無肽脈沖的T2細胞。表明，本發明的單域抗體能與黑色素瘤表面呈遞的HLA-A2/
gpl0 0 209_217(215E)(IH)QVPESV)復合物結合，且特異性強。本發明嵌合體抗體可表達于任何細胞的表面，當使其表達于免疫細胞表面時， 該免疫細胞便通過其上的目的抗體具有了特異的免疫功能，所以本發明的嵌合抗體可以 隨著其中的目的抗體的不同而特異結合多種抗原。例如，本發明的嵌合體抗體GPAT-ζ 能表達于ΝΚ-92-ΜΙ細胞的表面，含有該嵌合體抗體編碼基因的ΝΚ-92-ΜΙ細胞(即 NK-92-MI-GPAT-ζ細胞)與母本ΝΚ-92-ΜΙ細胞相比，無論是體內還是體外，均更能有效地、 特異的裂解表達 HLA-A2/gpl002Q9_217(215E)
(IMDQVPESV) 復合物的黑色素瘤細胞，殺傷率高。本發明的表達嵌合抗體的免疫細胞可以用于靶向多種黑色素瘤細胞進行細胞免 疫治療，與現有的免疫毒素治療方法相比，細胞免疫治療具有如下優點(1)效果確切，有效
5率高。一般為40-50%，對有些癌癥，有效率高達70% ； (2)無明顯毒副作用，病人不痛苦； (3)適應癥廣；(4)特別適用于多發病灶或有廣泛轉移的惡性腫瘤。因此，本發明的嵌合抗 體、單域抗體及表達嵌合抗體的免疫細胞在細胞免疫治療中將會有廣闊的應用前景。
圖1為重組載體pVT2-GPAT和pVT2_GPAT-pen的結構示意圖。
圖2為GPAT單體及GPAT五聚體的電泳圖。圖3為GPAT的抗原結合特異性檢測。圖4為GPAT-pen對肽脈沖的T2細胞的特異結合。圖5為嵌合抗體GPAT- ζ的結構示意圖及在ΝΚ_92_ΜΙ細胞表面的表達。圖6 為 NK-92-MI-GPAT- ζ 細胞對 gpl002Q9_217(215E) (ITOVPESV)肽脈沖的 T2 細胞、 p6 5495_503肽或Core18_27肽脈沖的T2細胞的殺傷活性。圖7為NK-92-MI-GPAT- ζ細胞對人黑色素瘤細胞Malme_3m、Mel-624或T2細胞 的殺傷活性。圖8為NK-92-MI-GPAT- ζ細胞的體內抗黑色素瘤活性。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。原核表達載體pVT2 (Zhang等，J Mol Biol，335，2004，49-56)(中國科學院微生物 研究所)。實施例l、HLA-A2/gpl002Q9_217(215E)_QVPESV)特異的單域抗體(GPAT)的制備與功能驗 證NK-92-MI細胞購自ATCC，產品目錄號為CRL-2408 ；T2細胞購自ATCC，產品目錄號 為CRL-1992 ；人黑色素瘤細胞Malme-3m購自ATCC，產品目錄號HTB64。人NK-92-MI細胞系和人的T淋巴瘤/B細胞雜交細胞T2 (HLA_A2+and gplOO—)用 含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素的1640完全培養基培養。NK-92-MI-GPAT- ζ細胞用含有1000 μ g/ml G418的1640完全培養基培養。人黑色素瘤細胞系Mel-624 (HLA-A2+ 和 gplOO+)和 Malme-3m(HLA_A2+ 和 gplOO+) 用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素的DMEM完全培養基培養。一、單域抗體(GPAT抗體)的編碼基因的制備以表達GPAT的噬菌體(北京表源生物技術有限公司)為模板，以gpaF :5’TAATAA jGAAGAC| CGCAGGCGCGTCTGGGGGAG 3，禾口 gpaR : 5，ATTATTATGGGCCCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT 3’為引物，PCR擴增得到編碼GPAT的cDNA片段，其核苷酸序列如序列表中序列5所 示，擴增得到的基因兩端的酶切位點為Bbsl/Apal。該GPAT抗體的氨基酸序列如序列表中 序列1所示。二、重組載體 pVT2-GPAT 和 pVT2_GPAT-pen 的構建(1)重組載體 pVT2_GPAT-pen 的構建
原核表達載體pVT2自身依次含有信號肽片段的編碼序列、VTBl片段的編碼序列、 連接子、myc標簽的編碼序列和His標簽的編碼序列。將序列表中序列5所示的GPAT片 段克隆到原核表達載體PVT2的Bbsl/Apal位點，得到pVT2_GPAT_VTBl重組質粒，命名為 pVT2-GPAT-pen，其中GPAT-pen是由序列表中序列5所示的GPAT片段、VTlB的編碼序列、 Myc標簽(EQKLISEEDL)的編碼序列和His標簽的編碼序列融合而成，GPAT-pen的結構示意 圖如圖IB所示。(1表示信號肽片段的編碼序列、2表示GPAT片段，3表示VTlB的編碼序 列，4表示連接子，5表示Myc標簽的編碼序列，6表示His標簽的編碼序列)Myc標簽的氨基酸序列如序列表中序列2所示；Myc標簽的編碼基因的核苷酸序列 如序列表中序列6所示。大腸桿菌中的B亞基毒素基因VTlB能自我裝配形成五聚體，將該亞基融合到目的 蛋白的C端，可使融合蛋白五聚體化。(2)重組載體pVT2-GPAT的構建將引物ABF(cggcggcggct)和 ABR(ccggagccgccgccgggcc)直接退火得到編碼三 個甘氨酸、兩端酶切位點為Apal/BspEI的DNA片段，將該片段以讀碼框一致的方式克隆到 用Apal/BspEI酶切位點消化過的pVT2-GPAT-pen載體，VTlB序列被刪除，得到重組質粒 PVT2-GPAT，其中，GPAT由序列表中序列5所示的GPAT片段、myc標簽(EQKLISEEDL)的編碼 基因和由5個組氨酸組成的His標簽的編碼基因融合而成，GPAT的結構示意圖如圖IA所 示(1表示信號肽片段的編碼序列、2表示GPAT片段，3表示連接子，4表示Myc標簽的編碼 序列，5表示His標簽的編碼序列)。三、重組載體轉化大腸桿菌得到重組菌將重組載體PVT2-GPAT轉入大腸桿菌TG1，通過氨芐青霉素篩選、酶切鑒定得到陽 性克隆，再測序驗證，得到含有重組載體PVT2-GPAT的重組大腸桿菌TGl/pVT2-GPAT。按照 同樣的方法，得到含有重組載體pVT2-GPAT-pen的重組大腸桿菌TGl/pVT2-GPAT-pen。四、GPAT-pen五聚體和GPAT單體的表達與純化將重組大腸桿菌TGl/pVT2-GPAT 和 TGl/pVT2_GPAT_pen 分別接種到含 100 μ g/ml 氨芐青霉素鈉的IOml LB培養基中，37°C，220rpm振搖過夜。將IOml培養物接種到含有 100 μ g/ml氨芐青霉素鈉的IL LB培養基中，37°C，220rpm振搖5小時。5小時后，加入ImM IPTG到培養物中誘導蛋白表達，24°C，180rpm，繼續振搖培養22h。將培養物在8000g離心 15分鐘。將沉淀重懸在25ml 20mM的Tris-Hcl(pH 8.0)緩沖液中，加入5mg溶菌酶，室溫 反應30分鐘。然后，將混合物用超聲破碎儀超聲，直到混合物變清澈后，12000rpm, 20分鐘 離心，重復兩次，通過0. 22 μ M濾紙過濾。His5標記的GPAT和GPAT-pen通過金屬離子親和 層析(IMAC) (GE Healthcare)進行純化。純化的蛋白通過10% SDS-PAGE進行分析。重組大腸桿菌TGl/pVT2_GPAT表達的目的蛋白是由GPAT、連接子、Myc標簽和His 標簽組成的單體融合蛋白。重組大腸桿菌TGl/pVT2-GPAT_pen表達的目的蛋白是以GPAT、VTB1、連接子、Myc 標簽和His標簽組成的融合蛋白為單體形成的五聚體。實驗設3次重復，電泳結果如圖2所示(1表示融合蛋白五聚體，2表示融合蛋白單 體)。GPAT-pen和GPAT以可溶形式在大腸桿菌TGl中表達，在變性條件下，目標蛋白GPAT 的分子量約為17kDa，目標蛋白GPAT-pen五聚體的分子量約為24kDa。純化的蛋白純度大于95%。三次實驗重復GPAT-pen的產量分別是9mg/L培養物、10mg/L培養物、9. 5mg/L培 養物，三次實驗重復GPAT的產量分別是95mg/L培養物、100mg/L培養物、90mg/L培養物。五、GPAT的功能驗證( 一 ) ELISA方法檢測GPAT的抗原結合特異性(I)BSA 的生物素標記將 BSA 用 sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce，Rockford)進行 標記，標記方法按照說明書進行。(2) HLA-A2-肽復合物的生物素標記HLA_A2_gp 100209_217(215E) (IMDQVPESV)、HLA-A2-CMV p65495_503 (NLVPMVATV)、HLA-A2-HBV Core18_27(FLPSDFFPSV) 的制備均根據Dirk Busch制備Tetramer protocol中的相關步驟進行 (Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science 274,94-6) 0 才既 述如下將HLA-A2分子的細胞外部分和β 2m輕鏈在大腸桿菌中以包涵體的形式表達，再 加相應的肽進行折疊；在折疊后，再將HLA-A2-肽復合物濃縮。所有肽由SBS Genetech Co. (Beijing)合成。以上各復合物的生物素標記用BirA生物素化連接酶(Avidity)進行生物素化， 然后通過Superdex 200 (GE Healthcare)柱進行純化。 (3) ELISA方法檢測GPAT的抗原結合特異性將生物素化的85々(1(^8/!111，稀釋于？85，？!1 7. 4)過夜包被在96孔板(NUNC，maxi sorp)中，用PBST(含0. Tween 20的PBS，pH 7.4)洗三次后，加入抗生物素蛋白鏈菌素 (1(^8/1111，稀釋于？83，pH7.4)，溫育1小時。用PBST洗三次后，將生物素化的HLA-A2-肽 復合物(5μ g/ml，稀釋于 PBS，pH7. 4，呈遞 gpl002(l9_217⑵5E) (I_VPESV)，p6 5495_5(l3 或 Core18_27 三種 不同的肽)通過抗生物素蛋白鏈菌素包被在96孔板上。仔細洗滌后，96孔板用MPBS(含 2%牛奶的PBS，pH7. 4)阻斷30分鐘，再加入重組大腸桿菌TGl/pVT2_GPAT表達的目的蛋白 (50μ g/ml，稀釋于PBS，pH7. 4)室溫溫育1小時，然后用抗myc的抗體(9E10克隆，用MPBS 稀釋)染色，接下來用HRP-偶聯的山羊抗小鼠的免疫球蛋白(用MPBS稀釋)染色。用3， 3’，5，5’ -四甲基聯苯胺試劑(Jingmei，China)進行檢測。用2M硫酸終止反應，用讀板器 測八45(|值。用小鼠抗人HLA-A2的單克隆抗體BB7. 2作為陽性對照以檢測復合物的正確折疊。 實驗設3次重復。結果如圖3所示(A表示HLA-A2/gp 10 0209_217(215E) (ITOVPESV)復合物，B表示 HLA-A2/CMV P65495-503(NLVPMVATV)復合物， C 表示 HLA-A2/HBV Core18_27(FLPSDFFPSV)復合物；1 表示實 驗組，2表示單克隆抗體BB7. 2陽性對照)。GPAT能特異結合固化的HLA-A2/gpl002Q9_217(215E) gbqvpesv)復合物，不能結合固化的 HLA-A2/p6 5495_5(13 或 HLA-A2/Core18_27 對照復合物。HLA-A2 構象特異的單克隆抗體BB7. 2作為陽性對照，證實HLA-A2/肽復合物成功地包被到了 96孔 板上。(二)通過FACS檢測GPAT-pen對肽脈沖的T2細胞的特異結合T2細胞購自ATCC，產品目錄號為CRL-1992 。T2細胞含有HLA-A2基因，但僅在細胞表面表達很低水平的HLA-A2分子，不能呈遞 內源性抗原。外源肽的脈沖能穩定HLA-A2分子，進而提高T2細胞表面HLA-A2分子的表達 水平。為了檢測GPAT是否能特異結合細胞表面表達的HLA-A2/gpl002Q9_21
(215E) (IMDQVPESV)7 復合
物，本實驗將特異肽 gpl002。9-217(215E) (IM3QVPESV)，無關肽 P65 495-503 ^ Core18_27 脈沖的T2細胞用作 靶細胞，通過FACS分析的方法來分析結合能力。
檢測GPAT-pen對肽脈沖的T2細胞的特異結合將2 X IO6個T2細胞與20 μ M的肽 置于RPMI-1640培養基中，37°C溫育4小時；洗細胞，將細胞重懸在染色緩沖液中(含0.5% BSA與2mM EDTA的PBS緩沖液)，細胞濃度調整為5 X IO6個細胞/ml，將3 μ g融合蛋白五聚 體GPAT-pen加入到100 μ 1染色緩沖液中，冰浴30分鐘。洗細胞，將細胞重懸在100 μ 1含 有Iyg抗myc抗體的染色緩沖液中，冰浴30分鐘。洗細胞，將細胞重懸在含1 μ 1 FITC標 記的山羊抗小鼠多克隆抗體的100 μ 1染色緩沖液中，冰浴30分鐘，洗細胞，將細胞重懸在 0. 5ml的染色緩沖液中，用FACScan儀器(Guava Easycyte mini)進行檢測，結果用Flowjo 軟件進行評價。用BB7. 2檢測HLA-A2的總體表達水平2 X IO6個T2細胞與20 μ M的肽在 RPMI-1640培養基中，37°C溫育4小時，洗細胞，將細胞重懸在染色緩沖液中(含0. 5% BSA 與2mM EDTA的PBS)，細胞濃度調整為5X IO6細胞/ml，將1 μ g BB7. 2加入到100 μ 1染色 緩沖液中，冰浴30分鐘。洗細胞，將細胞重懸在含Iyl FITC標記的山羊抗小鼠多克隆抗 體的100 μ 1染色緩沖液中，冰浴30分鐘，洗細胞，將細胞重懸在0. 5ml的染色緩沖液中，用 FACScan儀器(Guava Easycyte mini)進行檢測，結果用Flowjo軟件進行評價。實驗設3次重復。表明，GPAT-pen五聚體能特異結合gpl002Q9_217(215E)(ITOVPESV)肽脈 沖的T2細胞，而不結合無關肽脈沖的T2細胞或無肽脈沖的T2細胞(圖4A)。HLA-A2構象 特異的單克隆抗體BB7. 2用于檢測肽脈沖的T2細胞表面上調表達的HLA-A2，證實肽正確 的裝載到了 T2 細胞表面(圖 4B)。圖 4 中，gplOO 表示 HLA-A2-gpl002(19_217(215E)(ITOVPESV)的結 果、CMV 表示 HLA-A2-CMV P6 5495-503(nlvpmvatv)的結果、HBV 表示 HLA-A2-HBV Core18_27(FLPSDFFPSV)的 結果、不加肽表示不加任何肽的結果。實施例2、嵌合抗體GPAT-ζ的構建與應用一、含有嵌合抗體GPAT- ζ的編碼基因的重組載體的構建GPAT- ζ嵌合抗體的編碼基因由HLA-A2/gpl002(19_217(215E)(_VPESV)特異的單域抗體 GPAT的編碼基因(圖5A中GPAT)、編碼Myc標簽(EQKLISEEDL)的序列(圖5A中Myc標簽)、 人HLA-A2分子的跨膜區片段(氨基酸291-340)的編碼基因(圖5A中TM，即下述a2tm)，人 CD3復合蛋白ζ鏈的胞內區片段(氨基酸52-164)的編碼基因(圖5A中ζ)融合而成，其 結構如圖5Α所示。人HLA-A2分子的跨膜區片段的氨基酸序列具體可如序列表中序列3所示 ’人 HLA-A2分子的跨膜區片段的編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示。人CD3復合蛋白ζ鏈的胞內區片段的氨基酸序列具體可如序列表中序列4所示； 人CD3復合蛋白ζ鏈的胞內區片段的編碼基因如序列表中序列8所示。將單域抗體GPAT的編碼基因、編碼Myc標簽(EQKLISEEDL)的序列、人HLA-A2分子 的跨膜區片段(氨基酸291-340)的編碼基因，人CD3復合蛋白ζ鏈的胞內區片段(氨基 酸52-164)的編碼基因，以讀碼框一致的方式順次插入到自帶信號肽序列的真核表達載體 pEF/myc/ER(Invitrogen, catalog V890-20)中，單域抗體GPAT的編碼基因插入到載體的 pstl/BamHI位點，由編碼Myc標簽(EQKLISEEDL)的序列、人HLA-A2分子的跨膜區片段(氨 基酸291-340)的編碼基因、人CD3復合蛋白ζ鏈的胞內區片段(氨基酸52-164)的編碼 基因組成的融合基因插入到載體的BamHI和NotI位點。單域抗體GPAT的編碼基因的獲得以表達GPAT的噬菌體(北京表源生物技術有限公司)為模板，以 pEF-gpat-sense (gatctgcaggcgtctgggggaggctt)禾口 pEF-gpat-anti-sense (ctGGATCCTGAGGAGACGGTGAC)為引物，PCR 擴增得到 GPAT 片段，其 兩端的酶切位點為pstl/BamHI ；將該GPAT片段插入pEF/myc/ER的pstl/BamHI位點，得到 pEF-GPAT重組質粒。pEF-A2TM 購自 invitrogen，產品目錄號為 V893-20 ;pEF-ζ 購自 invitrogen，產 品目錄號為V893-20。myc-a2tm- ζ片段的獲得以pEF_A2TM為模板，用Pl和Ρ2引物通過PCR擴增得到 myC-a2tm片段。以pEF-ζ為模板，用P3和P4引物通過PCR擴增得到a2tm-ζ片段。以 上述兩種PCR產物為模板，用Pl和Ρ4引物通過重疊PCR擴增得到myC-a2tm-ζ片段。將 myc-a2tm- ζ片段通過BamHI和NotI酶切位點插入pEF-GPAT重組質粒，得到pEF_GPAT_ ζ 重組質粒，該重組質粒中含有GPAT-ζ嵌合抗體基因。PlctggatccgaacaaaaactcatctP2 :ttttctatctgagctcttcctcctccacatcacagcacgcgP3 :aggaagagctcagatagaaaaagagtgaagttcagcaggagP4 tgacgcggccgcttagcgagggggcag二、GPAT-ζ嵌合抗體在293Τ真核細胞中的表達293Τ真核細胞購自ATCC，產品目錄號為CRL-11268。1、用磷酸鈣法將pEF-GPAT- ζ重組質粒轉入293Τ真核細胞。轉染前一天，按4χ105個細胞/孔，將293Τ細胞接種到6孔板中。將 10 μ gpEF-GPAT- ζ質粒稀釋到50 μ 1雙蒸水中，再加入50 μ 1 500mM的氯化鈣，混勻。將混 合物逐滴加入到等體積的2xHeBS溶液中，混勻。室溫溫育15分鐘后，將沉淀加入細胞中， 37°C，溫育5小時，換培養基。2xHeBs 溶液每 100ml 2xHeBs 溶液中含有 Nacl 1. 636g, HEPES 1. 19g, Na2HPO4O. 0213g, pH 值為 7· 00。2、嵌合抗體GPAT-ζ在293Τ細胞中的表達轉染48小時后，消化轉染的293Τ和對照293Τ細胞，4°C，300g離心5分鐘，將沉淀 重懸在裂解緩沖液(0. 5%NP40in PBS)中，細胞濃度調整為IxlO7個細胞/毫升，冰浴10 分鐘后，13，OOOrpm, 4°C，離心15分鐘，吸上清，加入4xSDS上樣緩沖液中，94°C加熱5分鐘。 將10 μ 1樣本加入10% SDS-PAGE的上樣孔中，用抗myc的單克隆抗體(Epigenbiotec)做 免疫印記檢測，檢測GPAT- ζ在真核細胞293Τ中的表達。實驗設3次重復，結果如圖5Β所示。檢測到一條分子量大小為35kDa的蛋白條帶 (第2泳道)，這與預測的分子量大小不太一致(約為33kDa)，這是由于抗體片段或跨膜區 的糖基化造成的。該結果顯示嵌合抗體能在真核細胞中成功表達。三、GPAT-ζ嵌合抗體在ΝΚ-92-ΜΙ細胞中的表達ΝΚ-92-ΜΙ細胞購自ATCC，產品目錄號為CRL-2408。1、ΝΚ-92_ΜΙ細胞的基因修飾用電轉染方法將pEF-GPAT- ζ重組質粒轉入ΝΚ_92_ΜΙ細胞。ΝΚ-92-ΜΙ 細胞用 the sysytem 進行電轉。1. 5xl06 個 NK-92-MI 重懸在 0. 1 毫升電 轉緩沖液中，加入4μ g pEF-GPAT- ζ質粒，混勻。電轉后(電轉參數脈沖電壓IOOOv ；脈沖寬度50毫秒；脈沖數1)，將細胞放入1毫升含10%胎牛血清，不含抗生素的1640培養基 中，培養48小時后，加入0. 6mg/ml的G418，選擇正確轉入pEF_GPAT_ ζ重組質粒的陽性細 胞，命名為NK-92MI-GPAT- ζ陽性細胞。2、富集表達GPAT- ζ嵌合抗體的ΝΚ-92-ΜΙ細胞通過FACS分選富集高表達嵌合抗體的NK-92-MI-GPAT-4細胞。將1x107G418 抵制的NK-92MI-GPAT-(細胞重懸在ImlPBS緩沖液中，加入20 μ g抗myc的單克隆抗體 (Epigenbiotec)，冰浴30分鐘，用PBS洗兩次，細胞重懸在ImlPBS中，加入20 μ g FITC 標記的山羊抗小鼠的IgG多克隆抗體(Epigenbiotec)，冰浴30分鐘，用FACSCalibur (BD Biosciences)進行分選。實驗設3次重復。結果如圖5C-c所示。分選得到的細胞顯示了均一的、高水平的 GPAT- ζ表達。這些NK-92-MI-GPAT-ζ細胞群體用在接下來的實驗中。3、嵌合抗體GPAT- ζ在ΝΚ-92-ΜΙ細胞表面的表達將5x10s 個 NK-92-MI-GPAT- ζ 和 5x10s 個 ΝΚ-92-ΜΙ 細胞分別重懸在 100 μ 1 PBS 中，加入1 μ g抗myc的單克隆抗體(Epigenbiotec)，冰浴30分鐘，PBS洗兩次后，將細胞重 懸在100 μ 1 PBS中，加入1μ g FITC標記的山羊抗小鼠IgG多克隆抗體(Epigenbiotec)， 冰浴30分鐘，PBS洗兩次，將細胞重懸在500 μ 1 PBS中，用GuavaEasycyte mini (Guava Technologies. Inc，CA)流式細胞儀檢測表面表達。將IxlO6 個 NK-92-MI-GPAT- ζ 和 IxlO6 個 ΝΚ-92-ΜΙ 細胞分別重懸在 100 μ 1 PBS 中，加入 1 μ g HLA-A2/gpl002。9_217(215E)_QVPESV)PE-標記的四聚體(Epigenbiotec), 37°C 溫育30分鐘。PBS洗兩次，將細胞重懸在500 μ 1 PBS中，用GuavaEasycytemini (Guava Technologies. Inc, CA)流式細胞儀檢測表面表達。實驗設3次重復。結果GPAT- ζ嵌合抗體在ΝΚ-92-ΜΙ細胞表面的表達通過四聚 體染色得到證實。多于90%富集的NK-92-MI-GPAT-4細胞能特異結合可溶性的HLA-A2/ gpl0 0 209_217(215E)(IH)QVPESV)四聚體(圖 5C-a)，而不能結合可溶性的 HLA-A2/Core18_27 四聚體或 HLA-A2/p6 5495_5Q3四聚體(圖5C_b)；而且，對照NK-92-MI細胞不能結合可溶性的HLA-A2/ gpl0 0209_217(215E)(imQVPESV)四聚體(圖5C-a)，這說明GPAT-ζ嵌合抗體對抗原的結合有特異 性。四、NK-92-MI-GPAT- ζ和ΝΚ-92-ΜΙ細胞的細胞毒活性人黑色素瘤細胞Malme-3m購自ATCC，產品目錄號HTB64 ；人黑色素瘤細胞 Mel-624(Peter Shamamian, Marie Mancini, Yutaka Kawakami, Nicholas P. Restifo, Steven A. Rosenberg, and Suzanne L. Topal ian. Cancer ImmunolImmunother.1994 August ；39 (2) :73-83.)中國科學院微生物研究所。通過以FACS為基礎的檢測方法分析NK-92-MI-GPAT- ζ和母本ΝΚ-92-ΜΙ細胞對 gpl0 0209_217(215E) _QVPESV)肽脈沖的T2細胞、p6 5 495_5Q3肽或Core18_27肽脈沖的T2細胞的殺傷活 性。對于T2細胞的肽脈沖3xl06個T2細胞用PBS洗兩次，重懸在0. Iml完全的1640
士貨養基中，分另1J 力口入 0· Olml 0. 2M 的 gpl0 0209_217(IMDQVPESV) (215e) (imdqvpesv)或 p6 5495-503(NLVPMVATV) Core18_27(FLPSDFFPSV) 肽，37 °C溫育4小時。對于靶細胞的5-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯 (Sigma-aldrich, st. Louis, MO)染色2xl06個靶細胞(人黑色素瘤細胞Malme_3m，人黑色素瘤細胞Mel-624或T2)或2xl06個肽脈沖的T2靶細胞用PBS洗兩次，重懸在0. 25ml 0. 2%BSA/PBS溶液中。將1.5μ 1 5mM的5-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯稀釋到2. 5ml 0.2% BSA/PBS溶液中，混勻。將0. 25ml的上述稀釋液加入0. 25ml的細胞懸液中，混勻，避光， 37°C水浴10分鐘，期間振搖2-3次，加入0. 5ml的胎牛血清終止染色，PBS洗細胞兩次，用 完全1640培養基重懸靶細胞。調整細胞濃度為IxlO5個/ml，將靶細胞按照100 μ 1/孔加 入96孔圓底聚苯乙烯板中，自發釋放孔再加入100 μ 1完全1640培養基，實驗組再分別加 入100 μ 1ΝΚ-92-ΜΙ效應細胞或NK-92-MI-GPAT- ζ效應細胞。每種效應細胞設置6個不同 的效靶比32 1,16 1,8 1,4 1，2 1和1 1。將細胞混勻，300g離心5分鐘， 37 V, 5% CO2溫育4小時。溫育后，將細胞懸液轉移到1. 5ml的小離心管中，混勻，加入1 μ 1 lmg/ml的碘化丙啶(Sigma-aldrich, st. Louis, MO)，冰上放置3分鐘后加入100 μ 1完全 1640 培養基，用 Guava Easycyte mini (Guava Technologies. Inc, CA)檢測熒光強度。同 時，設置僅含靶細胞或效應細胞的對照管。5-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯和碘化丙啶雙陽性 的細胞為死亡的靶細胞。殺傷率的計算公式5_羧基熒光素琥珀酰亞胺酯和碘化丙啶雙陽 性的細胞數/5-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯單陽性的細胞數。實驗設3次重復。檢測NK-92-MI-GPAT- ζ 細胞對 gpl002Q9_217(215E) (_VPESV)肽脈沖的 T2 細胞、p6 5495_5(13 肽或Core18_27肽脈沖的T2細胞的殺傷活性的實驗結果表明，僅gpl002C19_217(215E) _QVPESV)肽脈 沖的T2細胞能被NK-92-MI-GPAT- ζ細胞裂解，而ρ6 5495_5(13肽或Core18_27肽脈沖的T2細胞 都不能被 NK-92-MI-GPAT- ζ 細胞裂解(圖 6，1 表示 gpl002Q9_217(215E) (imQVPESV)肽脈沖的 T2 細 胞，2表示p6 5495_5(13肽脈沖的T2細胞，3表示Core18_27肽脈沖的T2細胞)。對照NK-92-MI 細胞不能裂解任何一種肽脈沖的T2細胞。以上結果顯示，GPAT-ζ嵌合抗體能特異識別并 激活ΝΚ-92-ΜΙ細胞對表達HLA-A2/gpl002(19_217(215E)_QVPESV)的靶細胞的殺傷活性。檢測NK-92-MI-GPAT-ζ細胞對人黑色素瘤細胞Malme_3m、Mel-624或Τ2細胞的 殺傷活性的實驗結果表明，NK-92-MI-GPAT- ζ細胞能特異裂解表達HLA-A2/gpl002Q9_217(215E) (i qvpesv)復合物的Malme-3m或Mel-624細胞，而不能裂解HLA-A27gpl00_的T2細胞(圖7， 1表示人黑色素瘤細胞Malme-3m，2表示人黑色素瘤細胞Mel-624，3表示T2細胞)。以上 結果顯示，NK-92-MI-GPAT- ζ 細胞能特異殺傷自然呈遞 HLA-A2/gpl002Q9_217(215E) _QVPESV)復 合物的黑色素瘤細胞。五、NK-92-MI-GPAT- ζ和ΝΚ-92-ΜΙ細胞的體內抗腫瘤活性雄性bablc nu/nu裸鼠(4_6周齡)購自北京大學醫學部實驗動物中心。將右腋接種IxlO7個Malme-3m腫瘤細胞的裸鼠任意分組，每組6只，再用 NK-92-MI-GPAT-ζ細胞加以治療，記錄腫瘤體積，記錄天數為32天。具體方法為將 Malme-3m細胞(IxlO7個/0. 2ml PBS)注射到裸鼠的右腋皮下(第0天)，NK-92-MI或 NK-92-MI-GPAT- ζ細胞(5χ107個細胞/注射/0. 2ml PBS)或對照PBS在第1天和第5天 注射到相同的位置。腫瘤直徑每周觀察兩次，腫瘤體積根據下面的公式計算腫瘤體積=長 x(寬)2x 0.5。組間統計學差異通過雙尾Student’ s t檢驗評價。當腫瘤直徑達到3. Ocm 時，將所有小鼠殺死。P < 0. 05被認為具有顯著統計學差異。實驗設3次重復。結果如圖8所示(1表示NK-92-MI-GPAT- ζ細胞實驗組，2表 示ΝΚ-92-ΜΙ細胞對照組，3表示PBS對照組)，表明，與PBS對照組相比，ΝΚ-92-ΜΙ細胞治療組沒有顯著的抑瘤作用(P > 0. 05)。相反，與對照組相比，NK-92-MI-GPAT- ζ治療組能 顯著抑制腫瘤的生長(Ρ<0.05)。與ΝΚ-92-ΜΙ治療組相比，在治療的晚期(第22到第32 天)，NK-92-MI-GPAT-4治療組顯示了明顯的統計學差異(P < 0. 05)(圖8)。以上結果顯 示，NK-92-MI-GPAT-ζ 細胞能有效減慢表達 HLA-A2/gpl002Q9_217(215E) (ITOVPESV)復合物的腫瘤 在小鼠體內的生長，即NK-92-MI-GPAT-ζ細胞能在體內殺傷呈遞HLA-A2/gpl002Q9_217(215E)
(IMDQVPESV)復合物的腫瘤。
序列表
<110>中國科學院微生物研究所
<120> 一種嵌合抗體及免疫細胞
<160>8
<210>1
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
Ala Ser Gly GlyGlyLeuValGlnProGlyGlySerLeuArgLeuSer
151015
Cys Ala Ala SerGlyArgThrPheAsnValAspAlaMetAlaTrpPhe
202530
Arg Gln Thr ArgGlyLysGluArgGluPheValAlaAlalieSerArg
354045
Ser Gly Gly SerThrTyrTyrAlaAspSerValLysGlyArgPheSer
505560
lie Ser Lys AspAsnAlaLysAsnThrMetTyrLeuGlnMetAsnSer
65707580
Leu Lys Pro GluAspThrAlaIleTyrTyrCysAlaAlaAlalieTyr
859095
Trp Arg Gly SerTyrTyrThrGluGlyAsnTyrAspTyrTrpGlyGln
100105110
Arg Thr Gln ValThrValSerSer
115120
<210>2
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
13
<400>2
Glu Gln LysLeulieSerGluGluAspLeu
1510
<210>3
<211>50
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
Pro Lys ProLeuThrLeuArgTrpGluProSerSerGlnProThrlie
151015
Pro lie ValGlylielieAlaGlyLeuValLeuPheGlyAlaVallie
202530
Thr Gly AlaValValAlaAlaValMetTrpArgArgLysSerSerAsp
354045
Arg Lys
50
<210>4
<211>113
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
Arg Val LysPheSerArgSerAlaAspAlaProAlaTyrGlnGlnGly
151015
Gln Asn GlnLeuTyrAsnGluLeuAsnLeuGlyArgArgGluGluTyr
202530
Asp Val LeuAspLysArgArgGlyArgAspProGluMetGlyGlyLys
354045
Pro Gln ArgArgLysAsnProGlnGluGlyLeuTyrAsnGluLeuGln
505560
Lys Asp LysMetAlaGluAlaTyrSerGlulieGlyMetLysGlyGlu
65707580
Arg Arg ArgGlyLysGlyHisAspGlyLeuTyrGlnGlyLeuSerThr
859095
Ala Thr LysAspThrTyrAspAlaLeuHisMetGlnAlaLeuProPro
100105110
Arg
<210>5
<211>360
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
gcgtctgggggaggcttggtgcagcctggggggtctctgagactctcctgtgcagcctct60
ggacgcaccttcaatgtcgatgccatggcttggttccgccagactcgcgggaaggagcgt120
gagtttgtagcagctattagccggagtggtggtagcacgtactatgcagactccgtgaag180
ggccgattcagcatctccaaagacaacgccaaaaacacgatgtatctgcaaatgaacagc240
ctcaaacctgaggacacggccatttattactgtgcagctgcaatctactggcgtggtagt300
tactacactgaaggcaactatgactactggggccagaggacccaggtcaccgtctcctca360
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
gaacaaaaactcatctcagaagaggatctg30
<210>7
<211>150
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
cccaagcccctcaccctgagatgggagccgtcttcccagcccaccatccccatcgtgggc60
atcattgctggcctggttctctttggagctgtgatcactggagctgtggtCgCtgCtgtg120
atgtggaggaggaagagctcagatagaaaa150
<210>8
<211>339
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctc60
tataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggc120
cgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtac180
aatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgag240
cgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggac300
acctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc339
權利要求
1.一種嵌合抗體，其氨基酸序列由N端至C端依次為目的抗體、跨膜區片段、胞內區片 段；所述目的抗體為識別MHC-肽復合物的肽特異性的抗體。
2.一種嵌合抗體，其氨基酸序列由N端至C端依次為目的抗體、標簽、跨膜區片段、胞內 區片段；所述目的抗體為識別MHC-肽復合物的肽特異性的抗體。
3.根據權利要求1或2所述的嵌合抗體，其特征在于所述跨膜區片段為HLA-A2分子 的跨膜區片段；所述胞內區片段為CD3復合蛋白ζ鏈的胞內區片段；所述標簽為Myc標簽。
4.根據權利要求1、2或3所述的嵌合抗體，其特征在于所述Myc標簽的氨基酸序列 如序列表中序列2所示；所述HLA-A2分子的跨膜區片段的氨基酸序列如序列表中序列3所 示；所述CD3復合蛋白ζ鏈的胞內區片段的氨基酸序列如序列表中序列4所示。
5.根據權利要求1-4中任一所述的嵌合抗體，其特征在于所述目的抗體的氨基酸序 列如序列表中序列1所示。
6.一種單域抗體，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。
7.表達權利要求1-6中任一所述抗體的免疫細胞。
8.權利要求6所述單域抗體或權利要求1-5中任一所述嵌合抗體的編碼基因。
9.根據權利要求8所述的編碼基因，其特征在于 所述單域抗體的編碼基因為如下1)或幻或幻的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述單域抗體的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述單域抗體的DNA分子； 所述嵌合抗體中所述Myc標簽的編碼基因為序列表中序列6所示的DNA分子； 所述嵌合抗體中所述HLA-A2分子的跨膜區片段的編碼基因為如下a)或b)或c)的基因a)其核苷酸序列是序列表中序列7所示的DNA分子；b)在嚴格條件下與a)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白的DNA分子；c)與a)或b)限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA分子； 所述嵌合抗體中所述CD3復合蛋白ζ鏈的胞內區片段的編碼基因為如下Ι、ΙΙ或III的基因I其核苷酸序列是序列表中序列8所示的DNA分子；II在嚴格條件下與I限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白的DNA分子；III與I或II限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA分子；
10.含有權利要求9所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系或表達盒。
全文摘要
本發明公開了一種嵌合抗體及免疫細胞。本發明的嵌合抗體，其氨基酸序列由N端至C端依次為目的抗體、HLA-A2分子的跨膜區片段、CD3復合蛋白ζ鏈的胞內區片段。本發明嵌合體抗體可表達于任何細胞的表面，當使其表達于免疫細胞表面時，該免疫細胞便通過其上的目的抗體具有了特異的免疫功能，所以本發明的嵌合抗體可以隨著其中的目的抗體的不同而特異結合多種抗原。本發明的嵌合抗體、單域抗體及表達嵌合抗體的免疫細胞在細胞免疫治療中將會有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N15/63GK102120772SQ20101003376
公開日2011年7月13日 申請日期2010年1月8日 優先權日2010年1月8日
發明者劉容枝, 朱學楷, 高斌 申請人:中國科學院微生物研究所