專利名稱：利用馬鈴薯淀粉廢水培養枯草芽孢桿菌的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種利用高濃度有機廢水培養枯草芽孢桿菌的方法。
背景技術：
近年來，我國馬鈴薯產業發展迅速，在許多地區都形成了產業化基地。每年生產 馬鈴薯淀粉總量達40多萬噸，加工馬鈴薯近300萬噸，排放廢水800多萬噸。這些工藝廢 水大部分排放于河流和水庫中，造成嚴重污染。馬鈴薯淀粉廢水中，造成污染的主要是蛋 白液，占廢水總量的25%左右。蛋白液中主要營養成分是馬鈴薯本身的蛋白質、多糖、礦物 質等，總含量為4% _5.5%，其中蛋白質含量在0.9% 2. 1%，化學需氧量(COD)含量在 39000-45000mg/Lo其污染機理和危害是，蛋白液被排放在河流水庫中自然發酵后釋放出硫 化氫、氨氣等氣體，飄在空氣中有一股惡臭味；在水中，由于有機質濃度太高，各種微生物生 長繁殖很快，其中包括有害的微生物或者致病菌的大量生長繁殖，不僅可以直接侵害水生 動物，而且由于微生物的生長和有機質的氧化反應，水中的溶解氧被消耗殆盡，使水生動物 因缺氧而死亡(引自《飼料廣角》2007年第13期，32-34頁)。中國發明專利(申請號200810063868. 0)公開了一種投藥氣浮-UASB-SBR的方 法處理淀粉廢水。該方法主要是通過氣浮池去除水中的懸浮物，氣浮池出水流入UASB厭 氧反應器，將大部分的有機物分解為無機小分子物質和甲烷，剩余污泥進入污泥濃縮池， 出水流入預曝氣沉淀池，預曝氣沉淀池的出水自流進入SBR進行好氧生物處理。中國實 用新型專利(申請號200820131168.6)公開了一種馬鈴薯淀粉生產廢水中蛋白質膜法 回收裝置，適用于淀粉生產廢水中蛋白質的回收、濃縮、回收率在50%以上。中國實用新 型專利(申請號200720U6184. 1)公開了一種納濾回收馬鈴薯淀粉生產廢水中低聚糖裝 置，適用于廢水中低聚糖的回收、濃縮、回收率在80%以上。中國實用新型專利(申請號 200620005277. 4)公開了一種對馬鈴薯淀粉生產過程中產生的含有蛋白質的廢水進行加熱 處理提取蛋白質的熱處理設備。目前尚未發現文獻報道用馬鈴薯淀粉廢水培養枯草芽孢桿 菌的方法。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)N14菌株是我們實驗室從油菜的葉面上分離 篩選出來的一株具有降解有機磷農藥特性，并且能夠促進植物生長的野生菌株。該菌株保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2009年11月2日，分類 命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，保藏編號為CGMCC No. 3374。該菌株的16S rDNA基因序列已經遞交到了 GenBank數據庫，登錄號為GU086422。在http //www. ncbi. nlm. nih. gov/網站上用blast程序與已登錄細菌菌株的16S rDNA基因序列進行比較，結果 表明與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的相似性最高，可以達到99%以上。該菌株可 以利用馬鈴薯淀粉廢水中的有機質為營養物快速生長。
發明內容
本發明的目的是提供一種利用馬鈴薯淀粉廢水為主要原料，培養枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)N14菌株的方法，并且配制成菌劑，有利于保存和農業應用。本發明所述的菌劑的生產方法如下1、培養基配制1)菌種保藏培養基(固體)硫酸銨0 3g，磷酸氫二鉀0 2g，硫酸鎂0 0. Ig, 瓊脂20g，加馬鈴薯淀粉廢水至1L，pH7. 0-7. 5 ；2)菌種活化培養基(液體)硫酸銨0 3g，磷酸氫二鉀0 2g，硫酸鎂0 0. Ig, 加馬鈴薯淀粉廢水至1L，pH7. 0-7. 5 ；3)種子培養基(液體)硫酸銨0 30g，磷酸氫二鉀0 20g，硫酸鎂0 1. Og, 加馬鈴薯淀粉廢水至10L，pH7. 0-7. 5 ；4)發酵培養基(液體)硫酸銨0 0. ^g，磷酸氫二鉀0 0. 4kg，硫酸鎂0 20g，加馬鈴薯淀粉廢水至200L，pH7. 0-7. 5 ；以上培養基均在121°C滅菌15_30min。2、菌種轉接與活化挑取斜面保存的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)至菌種 保藏培養基平板，35°C連續劃線、挑單菌落培養兩次后，挑取單菌落在菌種活化培養基中， 于;35°C，150-200r/min 搖床振蕩培養 12_24h ；3、液體種子制備向裝有高溫滅菌的種子培養基的發酵罐中，按照5% -20%的接 種量接種步驟2活化的有機磷農藥降解菌，于25-37°C，通空氣培養12-24h，得到液體種子。4、液態發酵向裝有高溫滅菌的發酵培養基的發酵罐中，按照5% -20%的接種量 接種步驟3制備的有機磷農藥降解菌液體種子，于25-37°C，通空氣培養18-60h，得到活菌 體培養物，菌體濃度達到60億CFU/mL以上。5、菌劑制備培養好的發酵液經細菌計數后，加入甘氨酸(質量分數0. 2% -2% ) 和甘油(質量分數0.2%-5%)，灌裝保藏。使用時用水稀釋500-1000倍。由本發明技術方案生產的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)能夠有效降解作物 表面殘留的有機磷農藥，促進作物生長，而且生產成本低廉，還實現了高濃度有機廢水的資 源化。以下通過具體實施例詳細說明本發明的實施，目的在于幫助讀者更好地理解本發明 的精神實質，但不作為對本發明實施范圍的限定。實施例1 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)N14菌株的培養方法1、培養基配制1)菌種保藏培養基(固體)硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0. lg，瓊脂20g，加 馬鈴薯淀粉廢水至1L，pH7. 0-7. 5 ；2)菌種活化培養基(液體)硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0. lg，加馬鈴薯淀 粉廢水至 1L，pH7. 0-7. 5 ；3)種子培養基(液體)硫酸銨20g，磷酸氫二鉀20g，硫酸鎂l.Og，加馬鈴薯淀粉 廢水至 10L, ρΗ7· 0-7. 5 ；4)發酵培養基(液體)硫酸銨0. ^g，硫酸鎂20g，磷酸氫二鉀0. 4kg，加馬鈴薯 淀粉廢水至200L，pH7. 0-7. 5 ；以上培養基均在121°C滅菌15_30min。
2、菌種轉接與活化挑取斜面保存的有機磷農藥降解菌至菌種保藏培養基平板， 35°C連續劃線、挑單菌落培養兩次后，挑取單菌落在菌種活化培養基中，于35°C，150r/min 搖床振蕩培養20h ；3、液體種子制備向裝有高溫滅菌的種子培養基的發酵罐中，按照5%的接種量 接種有機磷農藥降解菌，于37°C，通空氣培養24h，得到液體種子。4、液態發酵向裝有高溫滅菌的發酵培養基的發酵罐中，按照10%的接種量接種 有機磷農藥降解菌液體種子，于37°C，通空氣培養36h，得到活菌體培養物，菌體濃度達到 50 億 CFU/mL05、菌劑制備培養好的發酵液經細菌計數后，加入甘氨酸(質量分數)和甘油 (質量分數2% )，灌裝保藏。使用時用水稀釋500-1000倍。實施例2 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)N14對油菜葉面敵敵畏農藥殘留的 降解效果1)選取兩個完全相同的油菜地塊，各30m2，均勻噴灑1000倍稀釋的80%敵敵畏乳 油農藥；2)噴灑敵敵畏1 后，害蟲已被殺死，均勻噴施農藥降解菌劑(用清水稀釋600 倍)，以噴施清水作對照；3)噴灑菌劑24h后，五點取樣法檢測油菜葉面敵敵畏殘留，發現噴灑菌劑的處理 組與不噴灑菌劑的對照組相比，敵敵畏殘留量顯著降低，低于蔬菜中敵敵畏殘留國家限量 標準(0. lmg/kg)。實施例3 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)N14促進油菜生長，改善油菜品質1)選取兩個完全相同的油菜地塊，各30m2，每塊菜地都按照30公斤/畝的施肥量 在幼苗期施用尿素，其中一塊同時再施加枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)N14菌株的發 酵液(用量按照80升/畝)。2)施肥2周后，在每塊菜地隨機采摘油菜樣本30棵，稱重，并檢測油菜中硝酸鹽和 亞硝酸鹽的含量；結果表明，施用枯草芽孢桿菌N14菌株發酵液的油菜與不施加發酵液的 對照相比，株重增加15%，硝酸鹽含量降低30%，亞硝酸鹽含量降低70%。本發明所使用的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)N14菌株保藏于中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2009年11月2日，分類命名為枯草芽孢 桿菌(Bacillus subtilis)。保藏編號為CGMCC No. 3374。
權利要求
1.利用馬鈴薯淀粉廢水培養枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的方法，其特征在 于發酵培養基以馬鈴薯淀粉廢水為主要營養物質來源，培養步驟包括(1)培養基配制1)菌種保藏培養基(固體)硫酸銨0 3g，磷酸氫二鉀0 2g，硫酸鎂0 0.lg，瓊 脂20g，加馬鈴薯淀粉廢水至1L，pH 7. 0-7. 5 ；2)菌種活化培養基(液體)硫酸銨0 3g，磷酸氫二鉀0 2g，硫酸鎂0 0.Ig,加 馬鈴薯淀粉廢水至1L，pH 7. 0-7. 5 ；3)種子培養基(液體)硫酸銨0 30g，磷酸氫二鉀0 20g，硫酸鎂0 1.0g，加馬 鈴薯淀粉廢水至10L, pH 7. 0-7. 5 ；4)發酵培養基(液體)硫酸銨0 0.5kg,磷酸氫二鉀0 0. 4kg，硫酸鎂0 20g， 加馬鈴薯淀粉廢水至200L，pH 7. 0-7. 5 ；以上培養基均在121°C滅菌15-30min ；(2)菌種轉接與活化挑取斜面保存的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)至菌種保 藏培養基平板，35°C連續劃線、挑單菌落培養兩次后，挑取單菌落在菌種活化培養基中，于 35°C,150-200r/min 搖床振蕩培養 12_24h ；(3)液體種子制備向裝有高溫滅菌的種子培養基的發酵罐中，按照5%-20%的接種 量接種步驟2活化的有機磷農藥降解菌，于25-37°C，通空氣培養12-24h，得到液體種子；(4)液態發酵向裝有高溫滅菌的發酵培養基的發酵罐中，按照5%-20%的接種量接 種步驟3制備的有機磷農藥降解菌液體種子，于25-37°C，通空氣培養18-60h，得到活菌體 培養物，菌體濃度達到60億CFU/mL以上；(5)菌劑制備培養好的發酵液經細菌計數后，加入甘氨酸(質量分數0.2% -2% )和 甘油(質量分數0.2%-5%)，灌裝保藏。使用時用水稀釋500-1000倍。
全文摘要
本發明涉及一種利用馬鈴薯淀粉廢水培養枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的方法，屬于生物技術領域。其特征在于發酵培養基以馬鈴薯淀粉廢水為主要營養物質來源，培養步驟包括培養基配制、菌種活化、液體種子制備、液態發酵、菌劑制備。由本發明技術方案生產的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)能高效原位降解蔬菜葉片上有機磷農藥殘留，促進蔬菜生長，降低蔬菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量，保障食品安全；本發明技術方案還能有效資源化馬鈴薯淀粉廢水，減少高濃度廢水排放，保護生態環境。
文檔編號C12N1/20GK102127513SQ20101003372
公開日2011年7月20日 申請日期2010年1月12日 優先權日2010年1月12日
發明者宿燕明, 李林, 李祖明, 白志輝, 韓禎 申請人:北京聯合大學