專利名稱：釀酒酵母致突變菌株rdky3615(δctt)及rdky3615(δsod)的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及利用分子生物學技術敲除釀酒酵母氧 化損傷清除基因，構建突變率可控的釀酒酵母致突變菌株。
背景技術：
目前致突變菌株的研究已經越來越受到關注和重視，其主要應用就是在蛋白質的 體內定向進化上。原核生物的致突變菌株研究得已經較為成熟和深入，在蛋白質的體內定 向進化上也得到廣泛的應用。商品化致突變菌株XLl Red Competent cell (stratagene公 司)的突變率大約為野生型菌株自發突變率的5000倍，作為原核表達系統其缺陷在于無法 有效的表達一些源于真核生物的蛋白質，該致突變菌株的另一不足是突變率不可控制。出 于上述原因，需要構建真核生物的致突變菌株，以應用在突變率可控的真核蛋白質的體內 定向進化上。釀酒酵母(Saccharomyce scerevisiae)含有過氧化氫酶CTT、超氧化物歧化酶 S0D，這兩個酶的作用是可以清除體內的氧化性物質，從而減少DNA的氧化損傷。當敲除過 氧化氫酶CTT基因cttl，超氧化物歧化酶SOD基因sodl后，在培養過程中，缺失了基因的致 突變菌株無法有效清除氧化性物質，其遺傳物質將受到相對野生型更多的氧化損傷，當外 源DNA轉入致突變菌株中時，宿主基因組和外源DNA可以同時發生隨機突變，實現致突變菌 株和外源蛋白的協同進化。通過外加氧化性誘導劑控制致突變菌株的突變率，實現可控的 蛋白質體內定向進化。
發明內容
本發明旨在通過分子生物學手段，利用基因敲除技術分別敲除掉過氧化氫酶CTT 基因cttl、超氧化物歧化酶SOD的基因sodl，以獲得突變率可控的致突變菌株，應用在蛋白 質體內定向進化上。本發明所述的釀酒酵母致突變菌株RDKY3615 ( Δ CTT)及RDKY3615 ( Δ SOD)如下以trpl基因為標記基因，設計引物時在trpl基因兩端分別引入待敲除基因ctt、 sod基因的同源序列，通過PCR擴增得到以trpl基因為標記基因，含有待敲除基因ctt或 sod的同源序列的敲除片斷。該敲除片斷純化轉化釀酒酵母RDKY3615 (ura3-52, trpl Δ 63， leu2 △ 1，his3 △ 200)，轉化采用常規的電轉化方法進行，然后在不含色氨酸的選擇平板上 篩選陽性轉化子。陽性轉化子擴增培養后，提取基因組，進一步通過PCR擴增trpl基因的 結果確認。確定釀酒酵母致突變菌株RDKY3615 (ACTT)及RDKY3615 ( Δ S0D)在外加氧化性 物質調控下的突變率。雙氧水濃度的濃度范圍0. 5mM 10mM，利用雙氧水處理的時間范圍 0 lh。本發明利用基因敲除技術分別敲除掉過氧化氫酶CTT基因cttl、超氧化物歧化 酶SOD的基因sodl，得到釀酒酵母致突變菌株。釀酒酵母致突變菌株RDKY3615 ( Δ CTT)及RDKY3615 (ASOD)可以在雙氧水等氧化性物質的調控下在一定的突變率內發生突變。釀酒 酵母致突變菌株RDKY3615(ACTT)及RDKY3615(AS0D)為廣泛的蛋白質體內定向進化提供 了一個可控的操作平臺。
具體實施例方式以下將將結合具體實施例對本發明作進一步的說明，目的在于幫助讀者更好的理 解本發明的精神實質，但不作為對本發明實施范圍的限定。實施例設計引物在trpl基因兩端分別引入待敲除氧化氫酶CTT基因cttl的同源序 列。通過PCR擴增得到以trpl基因為標記基因，含有待敲除基因cttl的同源序列的敲 除片斷。該敲除片斷利用PCR產物純化試劑盒純化后轉化釀酒酵母RDKY3615(ura3-52， trpl Δ 63，leu2 Δ 1，his3 Δ 200)，轉化采用常規的電轉化方法進行，然后在不含色氨酸的選 擇平板上篩選陽性轉化子。陽性轉化子擴增培養后，提取基因組，進一步通過PCR擴增trpl 基因的結果驗證確認。驗證正確的轉化子命名為釀酒酵母致突變菌株RDKY3615 (ACTT)。 RDKY3615 ( Δ CTT)釀酒酵母致突變菌株的突變率可控，實驗數據表明通過控制外加氧化性 物質雙氧水的濃度和處理的時間，可以使致突變菌株RDKY3615 ( Δ CTT)的突變率相對野生 型菌株可提高50 20000倍范圍內。
權利要求
1.釀酒酵母致突變菌株RDKY3615( Δ CTT)及RDKY3615 ( Δ SOD)，其特征在于，敲除釀酒 酵母清除體內氧化性物質相關的關鍵性酶的基因，并利用氧化性物質控制致突變菌株的突變率。
2.釀酒酵母致突變菌株RDKY3615( Δ CTT)及RDKY3615 ( Δ SOD)，其特征在于，敲除掉過 氧化氫酶CTT基因ctt 1，獲得釀酒酵母致突變菌株RDKY3615 ( Δ CTT)。
3.釀酒酵母致突變菌株RDKY3615( Δ CTT)及RDKY3615 ( Δ SOD)，其特征在于，敲除掉超 氧化物歧化酶SOD的基因sodl，獲得釀酒酵母致突變菌株RDKY3615 ( Δ SOD)。
4.釀酒酵母致突變菌株RDKY3615( Δ CTT)及RDKY3615 ( Δ SOD)，其特征在于，利用氧化 性物質雙氧水控制致突變菌株的突變率。
5.釀酒酵母致突變菌株RDKY3615( Δ CTT)及RDKY3615 ( Δ SOD)，其特征在于，雙氧水的 濃度范圍0. 5mM 10mM，雙氧水的處理時間O lh。
全文摘要
本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及利用基因敲除手段敲除釀酒酵母氧化損傷清除基因，構建突變率可控的釀酒酵母致突變菌株。利用基因敲除技術敲除釀酒酵母RDKY3615氧化氫酶CTT基因ctt1得到釀酒酵母致突變菌株RDKY3615(ΔCTT)，敲除掉超氧化物歧化酶SOD的基因sod1得到釀酒酵母致突變菌株RDKY3615(ΔSOD)。通過控制外加氧化性物質雙氧水的濃度和處理的時間，可以使RDKY3615(ΔCTT)、RDKY3615(ΔSOD)致突變菌株的突變率相對野生型菌株提高50～20000倍范圍內，實現可控突變。本發明構建的釀酒酵母致突變菌株RDKY3615(ΔCTT)及RDKY3615(ΔSOD)為廣泛的蛋白質體內定向進化提供了一個可控的操作平臺。
文檔編號C12N15/09GK102120965SQ201010033619
公開日2011年7月13日 申請日期2010年1月7日 優先權日2010年1月7日
發明者伍國超, 劉巍峰, 莊國強, 馬安周, 魏聯果 申請人:中國科學院生態環境研究中心